Щелочные фосфатазы (ЩФ) представлены подгруппой суперсемейства металлоэнзимов с аналогичными металлосвязывающими сайтами и предсказуемой устойчивой белковой структурой у активного центра. Известно, что ЩФ содержится практически во всех животных тканях; наиболее богаты ферментом печень, костная ткань, кишечник, плацента. ЩФ проявляет заметную гетерогенность, частично детерминированную генетически и частично вызываемую посттрансляционными изменениями.
Ранние структурные и иммунологические исследования показали, что три различных класса энзимов ЩФ (печеночно-костно-почечная, кишечная и плацентарная) кодируются тремя различными локусами генов [1]. Впоследствии было высказано предположение, что у человека ЩФ кодируется четырьмя основными генами, соответственно названию тканей — основных источников энзима. Ген тканево-неспецифической ЩФ экспрессирован в основном в печени, костях, почках и плаценте I триместра беременности и в меньшей степени — в других тканях. Другие три ЩФ: плацентарную (ПЩФ), зародышево-клеточную (germcell — GCAP) и интестицинальную большинство исследователей относят к тканево-специфическим [2]. В итоге, на сегодня у человека различают до пяти изоферментов ЩФ: плацентарный, костный, печеночный, кишечный, почечный. У млекопитающих активность ЩФ обнаружена в разнообразных тканях и органах, где энзим локализуется и прикрепляется к плазматическим мембранам с помощью гликозил-фосфатидил-инозитолового фрагмента.
Наиболее изученным ферментом плаценты является ПЩФ. Считается, что этот энзим состоит из субъединиц с молекулярной массой 58—65 кД [3]. После обнаружения изоэнзима ПЩФ в ткани опухоли и сыворотке крови больного раком легкого [4] за период с конца прошлого столетия и до настоящего времени опубликовано значительное число работ, посвященных изучению изоферментов ПЩФ в диагностике злокачественных новообразований [5—7]. При этом недостаточно исследований этого показателя в биологических жидкостях в комплексной лабораторной оценке течения беременности и ее осложнений [8].
Причина, побудившая к написанию данного обзора, привлечь внимание специалистов, работающих в репродуктологии, — от андрологов до эмбриологов — к исследованию ПЩФ. Этому белку ежегодно посвящены сотни работ в мировой литературе, а в России уделяется незаслуженно мало внимания.
Обычно ПЩФ синтезируется в плацентарном синцитиотрофобласте, поступает в кровоток матери после 12 нед беременности в количестве от 1,0 до 40,0 ЕД/л [4, 5, 9] и, вероятно, вовлекается в трансплацентарный перенос с иммуноглобулином G [9]. ПЩФ характеризуется генетически обусловленной вариабельностью. Фермент кодируется высокополиморфными генами в трех общих аллелях и 18 редких аллелях, что дает до 48 известных фенотипов. ПЩФ-подобные ферменты кодированы в четырех аллелях с проявлением 10 известных фенотипов. ПЩФ и ПЩФ-подобные энзимы могут формировать гетеродимеры [9—12]. ПЩФ является одним из секретируемых в кровь матери плацентарных белков [13, 14].
Различают 6 общих фенотипов ПЩФ: S, FS, F, I, SI и FI, согласно их изоэлектрической подвижности (S — медленная, F — быстрая и I — промежуточная). В номенклатуре, введенной L. Donald и E. Robson [15], эти общие фенотипы названы 1, 2, 3, 2−1, 3−1 и 3−2 соответственно. Данная модель согласуется с экспрессией трех общих аутосомных аллелей PI-1, PI-2, PI-3. Гетерозиготные индивидуумы дают тройную полосу ЩФ в электрофорезе, в связи с тем, что энзим является димером, и гибридные энзимы возникают вследствие случайной комбинации мономеров. Все они сходны по физико-химическим и антигенным характеристикам, но имеют и различия в активности, изоэлектрических точках, термостабильности [9, 16].
Три общих аллеля ответственны за 97,5% плацентарных фенотипов, в связи с чем частота редких аллелей достигает 2,5%. Это приводит к появлению редких гибридных фенотипов. Так, при исследовании 5000 плацент людей разных рас выявлено 48 фенотипов ПЩФ [17, 18]. Еще большее многообразие вариантов ПЩФ может быть выявлено с помощью моноклональных антител [19, 20]. Исследование ДНК и энзимного полиморфизма ПЩФ используется при изучении популяционных отличий [21—23].
В онтогенезе экспрессия ЩФ регулируется плацентой таким образом, что до 10-й недели беременности в плаценте присутствует ЩФ, похожая по свойствам на печеночную ЩФ взрослого человека, на 10—13-й неделе гестации удается обнаружить плацентарный изоэнзим, а к 14-й неделе беременности этот фермент обеспечивает полную активность ЩФ плаценты, причем синтез его стимулируется эстрогенами [21]. При этом уровень общей сывороточной ЩФ у беременных повышается также за счет костной ЩФ, которая лишь к 38-й неделе беременности полностью замещается ПЩФ, но может сохраняться и в течение 6 нед после родов [24—26].
Таким образом, происходит сдвиг в развитии, при котором за ранней экспрессией ЩФ неспецифического печеночного и костного типов следуют индукция и последующее увеличение уровня ЩФ плацентарного типа в процессе беременности [19, 21, 27, 28]. Вероятно, печеночная ЩФ является филогенетически более древней, а ПЩФ — более поздним продуктом эволюции, так как встречается только у высших животных — некоторые приматы и человек [19]. Однако, по мнению M. Moore, C. Nelson-Piercy [29], печень может реагировать как на изменения метаболизма при нормальной беременности, так и на осложнения беременности (гестозы). При этом повышается объем циркулирующей плазмы, снижается уровень альбумина и может снижаться уровень печеночных трансфераз и ЩФ за счет разведения крови, что затрудняет диагностику печеночной дисфункции.
Возможность изучения экспрессии гена в линиях клеток, продуцирующих разные изоформы ЩФ, и возможность изменять микросреду клетки расширили область биологии развития, онтогенеза, филогенеза и онкоэволюционной биологии. Установлено, что несколько линий HeLa продуцируют разные формы ЩФ: плацентарные, кишечные и тканево-неспецифические. Важным наблюдением было то, что в разных линиях имелись различия электрофоретической подвижности ПЩФ, в то время как другие энзимы, продуцируемые клетками HeLa, оставались фенотипически стабильными. В клеточных вариантах HeLa и клеточных линиях из других опухолей продукция ПЩФ повышается под воздействием глюкокортикоидов, эстрадиола, бутирата натрия, 5-бромдезоксиуридина и дибутирил-цАМФ. Изучение регуляции экспрессии ПЩФ и тканево-неспецифической ЩФ в двух хориокарциномных клеточных линиях, подвергшихся воздействию 5-бромдезоксиуридина и дибутирил-цАМФ, показало, что оба гена регулируются некоординированно. Это позволяет предположить, что плацентарный энзим индуцируется, по крайней мере, двумя независимыми механизмами. Интересно отметить, что характер экспрессии гена ЩФ «сдвигается» и под влиянием вирусной трансформации. Так, диплоидные фибробласты человека W126 и W138 после трансформации ДНК-опухолевым вирусом SV40 начинают продуцировать вместо тканево-неспецифической ЩФ плацентарный изоэнзим. И напротив, индукция тканево-неспецифической ЩФ в клетках доношенной плаценты, в которые был введен мутант tsA вируса SV40, дает интересную систему для изучения регуляции гена в плаценте человека [30—33]. Полученные данные свидетельствуют о выраженной чувствительности и уязвимости генетической и постгеномной регуляции продукции ПЩФ в отличие от тканево-неспецифической ЩФ под влиянием разнообразных метаболических и биологических факторов и, возможно, объясняют большую вариабельность значений и показателей лабораторных исследований изоэнзимов ПЩФ в процессе беременности.
ПЩФ является цинксодержащим металлопротеидом с серином в активном центре. Ионы магния активируют ПЩФ, но значительно слабее, чем ЩФ почек и мозга. Молекула Щ.Ф. человека представлена двумя субъединицами и, по данным ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, ее молекулярная масса находится в пределах 118—120 кД. По строению ПЩФ является гликопротеидом, содержит фукозу, маннозу, галактозу и 7 остатков сиаловой кислоты [9, 19]. ПЩФ, являясь гликопротеином, хорошо связывается с конкавалином, А и лектином чечевицы [9, 19]. По отношению к лектинам можно выделить три типа Щ.Ф. Плацентарная Щ.Ф. полностью связывается с конкавалин, А сефарозой и некоторыми другими иммобилизированными лектинами. Кишечная форма практически не взаимодействует с лектинами. Тканево-неспецифические формы частично удерживаются N-глюкозаминспецифическими лектинами [3]. Можно считать, что три основных классa ЩФ различаются по типу гликозилирования, и этот факт может рассматриваться как косвенное подтверждение концепции трех генов.
ПЩФ обнаруживается в высоких концентрациях в сыворотке крови беременных в виде как димера с молекулярной массой около 120 кД (А-форма), так и агрегатов разной, всегда большей молекулярной массы, диссоциируемых детергентами (В-форма). Эти высокомолекулярные формы содержат антигенные детерминанты, отличающиеся от таковых у ПЩФ, что свидетельствует о наличии других белков в образовавшихся комплексах.
Все изученные до сих пор ЩФ активны в димерном состоянии. Димеры, состоящие из мономеров с молекулярной массой от 40 до 75 кД, обычно зависят от ионов металлов и связывают 4 атома цинка на димер и несколько ионов магния. Некоторые из этих ионов тесно связаны с активным центром на каждом мономере, и при удалении металлов происходит утрата энзимной активности. Ковалентное включение радиоактивного фосфора в активный участок различных энзимов, последующее ферментативное расщепление молекул и анализ радиохимически меченных пептидов показали наличие идентичных последовательностей вокруг активного участка в энзимах как бактерий, так и млекопитающих. Это свидетельствует о значительной степени сохранности структуры в районе активного центра в процессе эволюции энзимов. В то же время при изучении многих аллельных форм ЩФ человека обнаружены признаки быстрой эволюции в районе неактивного участка молекулы [19].
Установлено, что ПЩФ человека — димерный энзим, также прикрепляющийся с помощью гликозил-фосфатидил-инозитола к клеточным мембранам. Специфические фосфолипазы способствуют выделению ПЩФ из клеточных мембран в сыворотку крови. Множественные формы ЩФ обусловлены как генетическими факторами, так и посттрансляционной модификацией. Для плацентарной формы существуют отдельный генетический локус и аллельные варианты, которые не обнаруживаются для других изоформ. Фракции Щ.Ф. различаются по своим каталитическим свойствам, электрофоретической подвижности, устойчивости к тепловой инактивации.
Исследованием термоустойчивости (56 °С 10 мин или 65 °C 5 мин) изоферментов ЩФ из различных тканей установлено, что при указанных условиях ПЩФ устойчива к нагреванию, костная фракция очень чувствительна к теплу (85—90% инактивации); менее чувствительна к теплу кишечная фракция (50—65% инактивации) и печеночная (50—75% инактивации). Таким образом, ПЩФ и зародышевая ЩФ (ПЩФ-подобная, или GCAP) термостабильны при 65 ˚С и на 98% гомологичны, тогда как тонкокишечная ЩФ и тканево-неспецифическая ЩФ (печеночно-костно-почечная) нестабильны при 65 ˚С и представляют от 88 до 56% гомологичности с ПЩФ [9].
Однако только по методу тепловой инактивации судить об органной принадлежности ЩФ недостаточно. Для биохимической характеристики изоэнзимов ЩФ используют различные ингибиторы. Среди ингибиторов ЩФ различают неспецифические, такие как фенилфосфат, перийодат и перманганат. К специфическим ингибиторам относят те, которые оказывают избирательное тормозящее действие на определенный изофермент. Так, L-фенилаланин (в большей степени) и L-лейцин (в меньшей степени) являются стереоспецифическими ингибиторами для ПЩФ и тонкокишечной ЩФ, а L-гомоаргинин и L-левамизол — ингибиторами для ЩФ кости, печени, почки и легкого [11]. Торможение имеет неконкурентный характер и происходит в результате присоединения аминокислоты к фермент-субстратному комплексу. Различное инактивирующее действие оказывает мочевина. Печеночная изоформа ЩФ к ней более стабильна, чем костная, но менее стабильна, чем ПЩФ и кишечная Щ.Ф. Также, как при действии мочевины, резистентность ЩФ распределяется и при изменении щелочной среды на кислую. Ингибиторами Щ.Ф. являются также вещества, связывающие двухвалентные ионы, — ЭДТА, оксихолин и др. Наиболее устойчива к таким ингибиторам ПЩФ [34]. А.Е. Сухарев [35] обнаружил ингибирующее действие физиологических концентраций сывороточного альбумина на ПЩФ при использовании в качестве субстрата нафтол-AS-фосфата.
ПЩФ синтезируется в течение всей беременности, однако ее физиологическая роль неясна [36]. I. Onwuameze и соавт. [37] определяли термостабильную ПЩФ в сыворотке крови здоровых небеременных и женщин с нормально протекающей беременностью и исследовали возможность использования этого теста в оценке плацентарной функции и косвенно — выживаемости плодов. По их данным, у 47 небеременных (что свидетельствует о наличии неплацентарного источника ПЩФ) средняя концентрация ПЩФ равна 0,79±1,54 МЕ/л, и в первые 8 нед беременности (98 женщин) достоверных различий не отмечено (0,98±1,28 МЕ/л). В процессе развития беременности уровень ПЩФ возрастает. По мнению авторов [37], определение термостабильной ПЩФ может быть рекомендовано в качестве простого теста для выявления плацентарной недостаточности.
Показано возрастание активности ПЩФ в 2 раза в динамике беременности и положительная корреляция с концентрацией глюкозы, альбумина в пуповинной крови и развитием (масса тела) новорожденных. У недоношенных эти параметры достоверно ниже, чем в группе доношенных [38, 39]. Более высокая активность ПЩФ в сыворотке крови беременных (в 9—10 раз) некоторые авторы [40—43] связывают с тромбогеморрагическими нарушениями, признаками гипотрофии плода и риском преждевременных родов, особенно при одновременном повышении уровня кортикотропин-рилизинг-гормона и альфа-фетопротеина. Однако могут быть и индивидуальные особенности продукции ПЩФ в норме. Так, V. Vongthavaravat и соавт. [27] обнаружили 10-кратное увеличение уровня ПЩФ в сыворотке крови 28-летней здоровой женщины в III триместре беременности, которая родила здорового ребенка с нормальной плацентой. Уровень ПЩФ после родов снизился до нормальной границы. H. Celik и соавт. [44] у пациентки, родившей здоровую девочку, выявили 17-кратное увеличение уровня ПЩФ в сыворотке крови во время беременности и снижение до нормы после родов. M. Gol и соавт. [45] считают, что уровень общей и плацентарной щелочной фосфатазы в сыворотке крови беременных плодами женского пола может быть выше по сравнению с беременными, вынашивающими мальчиков.
Основным источником сывороточной ПЩФ является развивающаяся плацента [4, 19]. Однако в 30% случаев ПЩФ иммуногистохимическим методом обнаруживается в фетальных яичниках в I триместре наряду с такими маркерами, как раково-эмбриональный антиген, хорионический гонадотропин человека, Са-125, рецепторы эстрогенов и прогестерона [46]. Обнаружение ПЩФ-подобного энзима в фетальных яичниках авторы [11, 46, 47] связывают с процессами дифференцировки эмбриональных тканей.
А.Е. Сухарев и соавт. [48] идентифицировали ПЩФ иммунохимическими и иммуногистохимическими методами в эмбриональном бронхиальном эпителии и в эндотелии новообразующихся сосудов костей плодов человека I и II триместров беременности, где ее содержание связано с дифференцировкой этих органов в эмбриогенезе.
Т.Б. Воробьёва [49] обнаружила, что при перенашивании беременности наблюдается «старение» плаценты и уменьшение содержания ПЩФ в ее ткани. Некоторые авторы [50—52] считают, что ПЩФ матери может компенсировать определенные нарушения функции других изоэнзимов ЩФ, в частности, при гипофосфатаземии и дефектах развития костной системы у плода.
Таким образом, функция ПЩФ в организме матери представляется неоднозначной. Видимо, этот энзим, участвуя в дефосфорилировании различных соединений, является активным ключевым ферментом многих метаболических процессов в быстрорастущих тканях матери и плода, для обеспечения которых обычных гидролаз было бы недостаточно [50]. Кроме того, ПЩФ принимает участие в активации факторов роста и, возможно, сама обладает такими свойствами [3, 53]. Есть также указания на то, что ПЩФ может играть роль активатора плазминогена [49], что очень важно для регуляции системы гемостаза беременных и рожениц, у которых, как правило, отмечается гиперкоагуляция [54]. Вероятно, ПЩФ может влиять на гемостаз в комплексе с тканевыми компонентами. Так, А. Sembaj и соавт. [55] помимо растворимой ПЩФ, присутствующей в сыворотке крови беременных женщин в последнем триместре беременности, обнаружили с помощью собственного метода на основе ультрацентрифугирования (до 100 000 g) в сыворотке здоровых беременных женщин в III триместре высокомолекулярную мембранно-связанную ПЩФ. Это согласуется с данными S. Guller и соавт. [56], которые показали, что микрочастицы синцитиотрофобласта из плаценты с высоким содержанием ПЩФ попадают в кровоток матери в норме и количество их повышается при преэклампсии. Они играют важную роль в развитии преэклампсии, так как изменяют фибринолитический баланс и ангиогенез системы мать—плод.
В связи с тем что ишемия плаценты и повреждение эндотелия играют существенную роль в патогенезе токсикозов и связанных с ними осложнений беременности, а ПЩФ продуцируется микроворсинками плаценты и эндотелием новообразующихся сосудов [57], логично предположить непосредственное участие этого фермента в указанных патологических процессах.