В последние годы возрастает интерес к изучению состояния рецептивности эндометрия в отношении исхода беременности при проведении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Высокая эффективность ВРТ и наступление беременности так или иначе связаны с выявлением случаев дисфункции эндометрия, что диктует поиск новых методов оценки функционального состояния эндометрия. К сожалению, и до настоящего времени эта проблема диагностики актуальна, поскольку нет инструмента, позволяющего предвидеть наступление беременности. Для выяснения состояния эндометрия были использованы различные методы — от морфологической оценки, как это описали Noyes, Hertig и Rock, 1950 (цит. по [1], до определения эндометриальной рецептивности и широких геномных исследований [15, 16].
Нами в 1983—1986 гг. был разработан комплекс методов для оценки состояния эндометрия при бесплодии и привычном невынашивании беременности, который не только заложил новую базу диагностики, но и обоснованно способствовал дальнейшему развитию этого направления исследований [2—4, 8]. Однако и до сих пор, несмотря на значительный прогресс в этом направлении, отсутствуют высокоинформативные маркеры определения эндометриальной рецептивности ввиду того, что рецептивность является многофакторным процессом.
Развитие эндометрия осуществляется под действием и через взаимодействие эстрогена и прогестерона. Наличие прогестерона является предпосылкой для развития эндометрия и имплантации эмбриона. Трансформация эндометрия в секреторную фазу зависит от адекватного уровня прогестерона в дополнение к предыдущему пику эстрадиола в фазу пролиферации [14]. Уровень циркулирующего прогестерона отличается большей вариабельностью и, следовательно, повышение уровня прогестерона в лютеиновую фазу, а не конкретный его уровень определяет восприимчивость эндометрия к нидации эмбриона [24].
Эстроген и прогестерон оказывают воздействие на эндометрий через специфические ядерные рецепторы для эстрогена: ЭР-альфа и ЭР-бета и для прогестерона: ПР-A и ПР-B. Рецепторы эстрогена кодированы двумя различными генами на разных хромосомах, в то время как ПР формируются из механизмов альтернативного сплайсинга. Экспрессия этих рецепторов изменяется на протяжении менструального цикла. В частности, экспрессия ЭР-альфа и ПР-B снижается в эндометрии во время имплантации. Ранее было показано, что уменьшение секреторной трансформации эндометрия коррелирует с экспрессией гликоделина и выраженностью пиноподий [14].
В доступной литературе отсутствуют данные о статистически значимых различиях в экспрессии изоформ ЭР и ПР в ядрах клеточных структур эутопического эндометрия у здоровых женщин по отношению к больным с бесплодием трубного происхождения в зависимости от наступления беременности после проведения ЭКО/ИКСИ.
Цель исследования — изучить экспрессию изоформ рецепторов эстрадиола (ЭР-альфа, ЭР-бета) и рецепторов прогестерона (ПР-А+В, ПР-В) в ядрах клеток эутопического эндометрия и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в ткани эндометрия в период «окна имплантации» у больных с бесплодием трубного происхождения и провести анализ этих данных в зависимости от наступления беременности после проведения ЭКО/ИКСИ.
Материал и методы
Под наблюдением находились 120 женщин репродуктивного возраста (от 20 до 37 лет) с бесплодием трубного происхождения, согласно МКБ-10. Среди них в соответствии с критериями включения и исключения была выделена группа из 29 больных в возрасте от 24 до 37 лет (средний возраст 30,8±3,7 года) с отсутствием маточных труб по поводу внематочной беременности или окклюзией маточных труб в связи с воспалительными заболеваниями органов малого таза, а также после оперативных вмешательств на маточных трубах, что соответствовало 1—4-й степени спаечного процесса [17]. Подбор и рандомизация больных осуществлялись совместно с д.м.н., проф. Л.Н. Кузьмичевым и врачом А.Н. Онищенко. Клиническая характеристика больных была представлена нами ранее [6]. Контрольную группу составили 20 женщин, которым проводилась стерилизация маточных труб лапароскопическим доступом, как это было описано ранее [11].
Критерии включения: возраст женщин от 24 до 37 лет; бесплодие трубного происхождения, верифицированное по данным лапароскопического и гистероскопического исследований. Критерии исключения: бесплодие трубного происхождения и сопутствующая гинекологическая патология, другие виды женского бесплодия, астенотератозооспермия 3-й и 4-й степени у мужа, неудовлетворительная морфологическая оценка эмбрионов.
Дизайн исследования: ретроспективное одномоментное исследование, одобренное этическим комитетом ФГБУ «НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава Р.Ф. Информированное согласие на участие в исследовании и использование крови и ткани эндометрия было получено у всех пациенток. Клинико-лабораторное обследование пациенток проведено в соответствии с приказом МЗ РФ № 67 от 26.02.03 «О применении ВРТ в терапии женского и мужского бесплодия». Оплодотворение ооцитов осуществлялось в стандартных условиях методами ЭКО или ИКСИ. Стимуляция овуляции проводилась, как было описано нами ранее [6].
Ультразвуковое исследование органов малого таза у больных проводилось до оперативного лечения и после окончания курса терапии с помощью аппарата Aloka SSD-2000 с использованием трансвагинального датчика с частотой 7,5 МГц.
Кровь для исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром до операции, а также после окончания курса медикаментозной терапии (через 3 мес). Образцы сыворотки хранили при –70 ˚С до момента исследования. Образцы ткани эндометрия для анализа экспрессии мРНК немедленно помещали в раствор RNAlater (RNAlater, «Qiagen GmbH», Нидерланды) и хранили при –20 °C до проведения исследований. Все образцы биопсии эндометрия были получены через 7 дней после пика ЛГ ± 2 дня, исходя из ежемесячной оценки фазы менструального цикла и дня менструального цикла образцов эндометрия, согласно стандартным морфологическим критериям [22].
Иммуногистохимический анализ. Иммуногистохимическое окрашивание для ЭР и ПР было выполнено в стандартных условиях, как это было описано нами ранее [11, 21]. Использовались следующие первичные антитела: мышиные моноклональные античеловеческие антитела ЭР-альфа, кроличьи поликлональные античеловеческие антитела ЭР-бета, мышиные моноклональные античеловеческие антитела ПР-A+B, мышиные моноклональные античеловеческие антитела ПР-B. Все моноклональные антитела имели класс IgG
Оценка экспрессии ЭР, ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-А+В, ПР-В и соответствующее распределение по клеточным элементам выполнены при использовании полуколичественной системы гистологической шкалы (HSCORE) [20]: Σ P
Нервные микроволокна PGP 9,5. Окрашивание эутопического эндометрия проводилось в условиях стандартного протокола. Оценка результатов осуществлялась по наличию или отсутствию специфического окрашивания нервных микроволокон в ткани эутопического эндометрия, исходя из плотности PGP 9,5 на 1 мм2, как это описано было ранее [5].
Выделение мРНК, синтез цДНК и проведение количественной ПЦР. Выделение мРНК осуществлялось с использованием реагентов Rneasy Mini Kit (Quiagen, «Maryland», США) в соответствии с инструкцией производителя. Очистка мРНК выполнялась с использованием Agilent bio-analyzer («Agilent technologies», «Waldbronn», Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Все образцы мРНК имели RIN (индекс целостности выделенной РНК), численно равное 9, как это было описано ранее [10]. Количественный анализ РНК проводился с использованием реагентов Quant iT RNA assay kit and Qubit (Invitrogen, Carlsbad, CA, США).
Синтез цДНК из ткани эндометрия осуществлялся с использованием реагентов Superscript III First Strand Synthesis для РТ-ПЦР (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) в соответствии с рекомендациями производителя в реакции обратной транскрипции. Использовали 2 мкг от общей РНК из ткани эндометрия в реакции обратной транскрипции с применением случайных гексамеров в качестве праймеров.
ПЦР в реальном времени проводили с использованием оборудования Step One Real-Time PCR System («Applied Biosystems», Foster City, CA, США). Применялись следующие праймеры: ЭР-альфа 5’- CCA CCA ACC AGT GCA CCA TT-3’ и 5’- GGT CTT TTC GTA TCC CAC CTT TC-3’, ЭР-бета 5’-AGA GTC CCT GGT GTG AAG CAA-3’ и GAC AGC CGA GAA GTG AGC ATC, ПР-A+B 5’- AGA GCA CTG GAT GCT GTT GCT-3’ и 5’- TGG CTT AGG GCT TGG CTT T-3’, ПР-B 5’- GAG GGG GCA GTG GAA CTC AG-3’ и 5’- AGG GGA ACT GTG GCT GTC GT-3’, GAPDH 5’- GAA GGT GAA GGT CGG AGT CAA C-3’ и 5’- CAG AGT TAA AAG CAG CCC TGG T-3’. Цикл амплификации включал денатурацию при 95 °C в течение 3 мин, 25 циклов амплификации при 94 °C в течение 30 с, отжиг при 64 °C в течение 45 с и при 72 °C в течение 1 мин. Все исследования проводились в дубликатах и были нормализованы к glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) для внутреннего контроля.
Анализ сыворотки крови. Определение половых и стероидных гормонов ФСГ (мE/л), ЛГ (мE/л), эстрадиола (пмоль/л), прогестерона (нмоль/л) проводилось при использовании Immulite 1000 («Siemens Healthcare Diagnostics», Deerfield, IL, США), согласно инструкциям изготовителя.
Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы IBM SPSS Statistics 20. Результаты исследования представлены как средние±стандартное отклонение (М±SD). В зависимости от конкретных условий применялись: ANOVA, критерий Вилкоксона, U-критерий Манна—Уитни. Различия между группами считались достоверными при p<0,05.
Результаты
Клинико-эмбриональные данные. Клинические данные у обследованных больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей или ненаступившей беременностью после проведения ЭКО/ИКСИ представлены в табл. 1. Статистически значимых различий у обследованных двух групп установлено не было.
Содержание в крови половых пептидных и стероидных гормонов у больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей и ненаступившей беременностью. Как следует из табл. 2, различий в содержании в крови половых пептидных и стероидных гормонов у больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей или ненаступившей беременностью после проведения ЭКО/ИКСИ не установлено.
Экспрессия ядерных изоформ ЭР и ПР в эндометрии в норме и у больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей и ненаступившей беременностью после проведения ЭКО/ИКСИ. Из табл. 3 следует, что экспрессия в эутопическом эндометрии ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-A+B, ПР-B выявляется в ядрах поверхностного эпителия, эпителия желез и стромальных клетках в норме и у больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей и ненаступившей беременностью после ЭКО/ИКСИ.
Отмечается статистически значимое снижение экспрессии ЭР-альфа в ядрах поверхностного эпителия, эпителия желез и в клетках стромы у больных с бесплодием трубного происхождения с ненаступившей беременностью по отношению к контрольным значениям и показателям у больных с наступившей беременностью. Статистически значимых различий для экспрессии ЭР-бета у обследованных больных не установлено.
Показано, что максимальная экспрессия ЭР-альфа и ЭР-бета наблюдается в поверхностном эпителии эутопического эндометрия и в эпителии желез, а минимальная — в клетках стромы. Это распределение экспрессии характерно для всех больных, находившихся под наблюдением, за исключением группы контроля. В группе контроля наблюдались максимальные и статистически значимые показатели экспрессии ЭР-альфа в поверхностном эпителии по отношению к эпителию желез и строме.
Экспрессия ПР-A+B была снижена в ядрах поверхностного эпителия и эпителия желез у больных с бесплодием трубного происхождения с ненаступившей беременностью по отношению к контрольной группе и группе больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей беременностью. В клетках стромы различий не установлено.
Наибольшие статистически значимые различия установлены для ПР-B в ядрах поверхностного эпителия, эпителия желез и клетках стромы. Экспрессия была снижена у больных с бесплодием трубного происхождения с ненаступившей беременностью по отношению к контрольной группе и группе больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей беременностью.
Установлено, что максимальная экспрессия ПР-A+B и ПР-B наблюдается в ядрах поверхностного эпителия эутопического эндометрия и в эпителии желез, а минимальная — в ядрах клеток стромы. Это распределение экспрессии характерно для женщин контрольной группы с сохраненной репродуктивной функцией. В то же время у больных с бесплодием трубного происхождения экспрессия ПР-A+B и ПР-B была не только снижена, но и не имела признаков распределения от максимального значения в ядрах поверхностного эпителия, железах до минимального в ядрах стромы.
Следовательно, у больных с бесплодием трубного происхождения с ненаступившей беременностью по отношению к больным с наступившей беременностью и женщинам контрольной группы наблюдается снижение экспрессии ЭР-альфа, ПР-A+B, ПР-B в ядрах поверхностного эпителия и эпителия желез. Установлен градиент изученных ядерных рецепторов, который в норме снижается от максимального значения в поверхностном эпителии и в железах к минимальной экспрессии в строме. У больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей беременностью этот градиент сохраняется для ЭР, ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-A+B и ПР-B по сравнению с контрольными значениями. У больных с бесплодием трубного происхождения и ненаступившей беременностью характерно полное изменение этого градиента для ЭР, ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-A+B и ПР-B.
Плотность нервных микроволокон. Плотность нервных микроволокон в эутопическом эндометрии в контрольной группе для PGP 9,5 в 1 мм2 составила 1,2±1,1, у больных с бесплодием трубного происхождения — 1,15±2,9, различия статистически незначимы (р>0,05). Случаев отсутствия положительной реакции на PGP 9,5 не было. Следовательно, у всех больных с бесплодием трубного происхождения исследованные образцы эутопического эндометрия не содержали избыточную плотность нервных микроволокон. Отсутствовали статистически значимые различия между плотностью нервных микроволокон у больных с наступившей и ненаступившей беременностью (р>0,05).
Экспрессия мРНК ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-A+B, ПР-B в эндометрии у больных с бесплодием трубного происхождения в зависимости от наступления или ненаступления беременности после ЭКО/ИКСИ. Как следует из табл. 4, получено статистически значимое снижение содержания мРНК ЭР-альфа, ПР-A+B, ПР-B в ткани эндометрия у больных с ненаступившей беременностью после проведения ЭКО/ИКСИ. Значимость этих различий составляла p=0,024 для ЭР-альфа, p=0,021 для ПР-A+B, p=0,018 для ПР-B. Учитывая, что выделение мРНК осуществлялось при гомогенизации ткани эндометрия с вовлечением всех клеточных структур, невозможно установить, за счет каких компонентов наблюдались эти различия.
Обсуждение
Приведенные результаты исследования носят поисковый характер за счет использования двух высокоинформативных методов: иммуногистохимии и количественной ПЦР в реальном времени. Сопоставление данных этих методов позволяет не только дополнять результаты каждого из них, но и верифицировать изменения по отношению к контрольной группе. Учитывая, что анализ результатов ПЦР осуществлялся на основе предварительной гомогенизации ткани и экстракции из нее мРНК, не представлялось возможным учесть распределение ЭР и ПР по типам клеток и их локализации. В то же время иммуногистохимический анализ позволил установить распределение результатов экспрессии ЭР и ПР по типам клеток и их локализации, но этот метод является полуколичественным и носит элементы субъективного восприятия.
При определении уровня гормонов — эстрадиола, прогестерона, ЛГ и ФСГ — различий между двумя группами женщин с нормальным менструальным циклом не установлено ни по одному из исследованных показателей. Эти гормоны очень важны для нормального менструального цикла и развития эндометрия. Наличие нормальной секреции является более важным признаком, чем конкретные величины уровня гормонов, которые имеют значительные индивидуальные колебания [18]. В настоящем исследовании уровень ЛГ и ФСГ измеряли в сыворотке крови, полученной в те же сроки, что и образцы ткани эндометрия, — в середине секреторной фазы. В то же время имеются данные о том, что для прогнозирования исхода беременности важно определение уровня ЛГ и ФСГ в начале менструального цикла [12].
По нашим результатам, у женщин с ненаступившей беременностью отмечалось снижение содержания мРНК ПР-A+B, ПР-B, ЭР-альфа и экспрессии ЭР-альфа, ПР-A+B, ПР-B по данным иммуногистохимического исследования по сравнению с женщинами, у которых беременность наступила. Ранее было известно, что по данным иммуногистохимического исследования наблюдается снижение экспрессии ЭР-альфа, ПР-A и ПР-В в железах эндометрия во время секреторной фазы, но их уровень сохраняется в строме [14, 24].
Установлено, что у женщин с эндометриозом наблюдается повышение экспрессии (up-regulation) ЭР-альфа, что приводит к дефектам восприимчивости эндометрия к эмбриону [19]. Низкий уровень ЭР-альфа и ПР отмечается в эндометрии во время стимулированных циклов, которые могут привести к снижению нидации эмбриона [13].
В проведенных нами предварительных исследованиях удалось показать, что у больных эндометриозом при отсутствии беременности по сравнению с больными с наступившей беременностью и здоровыми наблюдается снижение экспрессии ПР-A+B, ПР-B (down-regulation) и повышение экспрессии ЭР-альфа (up-regulation) [21]. Эти данные устанавливают важное влияние ЭР-альфа, ПР-A, ПР-B на эндометрий для нормализованного регулирования и его рецептивности.
Разнонаправленность выявленных изменений отражают глубокие метаболические преобразования в ответ на различные патологические стимулы на фоне фенотипических особенностей эутопического эндометрия. Учитывая, что к моменту включения больных в исследование они все обратились за медицинской помощью к врачу по поводу бесплодия, можно утверждать, что комплексное лечение (хирургическое и гормональное) позволило получить клинический эффект. Однако эффект от лечения наблюдался не у всех больных. Это свидетельствует о том, что у больных с нормализованными до лечения фенотипическими показателями ЭР-альфа, ПР-А+В, ПР-В беременность наступила, а у больных с измененными показателями, несмотря на лечение, не наступала. Следовательно, в процессе указанного лечения фенотипические особенности эутопического эндометрия не меняются и беременность не наступает [5, 21].
К числу патологических стимулов, изменяющих фенотипические свойства эутопического эндометрия, может быть отнесен инфламаторный стресс. Учитывая, что в исследование были включены больные с бесплодием трубного происхождения, обусловленным отсутствием маточных труб по поводу внематочной беременности или окклюзией маточных труб в связи с воспалительными заболеваниями органов малого таза, а также после оперативных вмешательств на маточных трубах со спаечным процессом 1—4-й степени, установленные изменения в эндометрии объективно снижают шанс наступления беременности [1].
Следовательно, полученные результаты вполне объяснимы. У обследованных больных отсутствовали клинические и патоморфологические признаки хронического эндометрита, но наличие иммуногистохимических изменений и клинико-анамнестические данные не позволяют полностью исключить инфламаторный процесс в эутопическом эндометрии, который мог оказывать патологическое воздействие на функциональную активность ядерных рецепторов к половым стероидным гормонам.
Эта позиция получила развитие при оценке уровня экспрессии L-селектина, MEСA-79, рецептора IL-6Rα, рецептора IL-1Rα в эндометрии у больных с бесплодием трубного происхождения. Показано, что проявления патологических изменений при ненаступлении беременности у этих больных сочетаются статистически значимо на системном уровне (повышение в сыворотке содержания L-Sel, вч-СРБ, IL-1α, IL-6) и локальном (повышение экспрессии в эндометрии L-Sel и рецептора IL-1Rα) уровне [6].
По нашим данным, маточная беременность наступала в течение 1 года после импульсной электротерапии у 37% больных с хроническим эндометритом в результате устранения повреждений сосудистых терминалей и ишемии ткани [9], у 44,7% больных с эндометриозом после комплексного лечения (хирургическое+гормональное) [5] и у 41,4% больных с бесплодием трубного происхождения после проведения ЭКО/ИКСИ [7]. Сравнение этих данных показывает отсутствие статистически значимых различий (р>0,05). Следует отметить, что эти результаты были получены при использовании у разных больных различных методов лечения бесплодия: комбинированная терапия в сочетании с электротерапией, гормональная терапия + хирургическое лечение, проведение ЭКО/ИКСИ. Следовательно, именно наличие фенотипических особенностей эндометрия при хроническом эндометрите, эндометриозе, бесплодии трубного происхождения обусловливают наступление беременности.
По нашему мнению, наиболее значимым фактором, характеризующим функциональную активность эндометрия, является фенотипическая характеристика состояния ядерных рецепторов к половым стероидным гормонам. Сравнительная фенотипическая характеристика экспрессии ядерных рецепторов ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-А+В, ПР-В и плотности PGP 9,5 в эндометрии у больных с бесплодием при эндометриозе и при бесплодии трубного происхождения представлена в табл. 5 [5]. Как следует из табл. 5, во всех группах больных при наступлении беременности отмечается умеренная экспрессия ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-А+В, ПР-В и низкая плотность PGP 9,5. При ненаступлении беременности у больных с эндометриозом отмечается высокая экспрессия ЭР-альфа и низкая экспрессия ПР-А+В, ПР-В и высокая плотность PGP 9,5, у больных с бесплодием трубного происхождения — низкая экспрессия ЭР-альфа, ПР-А+В, ПР-В и низкая плотность PGP 9,5. Обращает на себя внимание однонаправленный характер снижения экспрессии ПР-А+В и ПР-В в эндометрии у больных с бесплодием при эндометриозе и у больных с бесплодием трубного происхождения. В то же время экспрессия ЭР-альфа и плотность PGP 9,5 носит разнонаправленный характер: выше при эндометриозе и ниже при трубном факторе.
Таким образом, проведенные исследования экспрессии ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-A+B, ПР-B в ядрах поверхностного эпителия, эпителия желез и стромальных клетках эндометрия и содержания мРНК ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-A+B, ПР-B в ткани эндометрия у больных с бесплодием трубного происхождения показали, что при ненаступившей беременности по отношению к наступившей беременности наблюдается снижение экспрессии ЭР-альфа, ПР-A+B, ПР-B по данным иммуногистохимического исследования и уровня мРНК ЭР-альфа, ПР-A+B, ПР-B (down-regulation). Между экспрессией ЭР-альфа, ПР-A+B, ПР-B в ядрах поверхностного эпителия и эпителия желез у больных с бесплодием трубного происхождения с наступившей беременностью и контрольными показателями у здоровых женщин таких различий не наблюдалось. Установленные изменения, несомненно, могут влиять на рецептивность эндометрия и приводить к развитию субфертильности у больных с бесплодием трубного происхождения. Уровень экспрессии изоформ ЭР-альфа, ПР-А+В и ПР-B в ядрах поверхностного эпителия и эпителия желез эутопического эндометрия перед назначением лечения у больных бесплодием трубного происхождения может служить дополнительным показателем в оценке фертильности и эффективности лечения.
Благодарности. Выражаем благодарность ass. professor Anneli Stavreus-Evers и professor Matts Olovsson, сотрудникам Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden за участие в обсуждениях и поддержку. Финансовая, научная, правовая и политическая помощь осуществлялась Шведской Королевской академией наук, Шведским медицинским исследовательским советом (проект № 8683), Университета Уппсалы, Швеция, Российской Академией медицинских наук, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России и Министерством здравоохранения России.