Анализ полиморфизма генов ферментов системы обмена катехоламинов и антиоксидантной системы у женщин с привычным невынашиванием беременности

Среди наиболее значимых проблем современной науки и медицины одно из основных мест занимает невынашивание беременности, приводящее к ухудшению здоровья населения и демографических показателей. Несмотря на значительное число исследований невынашивания беременности, данная патология сохраняет свою распространенность и частоту [1—3]. Наряду с множеством доказанных и давно известных факторов в последние годы большое внимание уделяется генетическим аспектам потери беременности [4]. Известно, что в ЦНС основными переносчиками информации являются нейромедиаторы катехоламины [5]. В норме эти вещества несут важнейшую функцию обеспечения межклеточных взаимодействий, однако при возникновении стресса в качестве адаптивной реакции резко возрастает их выработка и при длительном воздействии стрессора происходит чрезмерное накопление катехоламинов [5]. В организме существует система, обеспечивающая поддержание их концентрации на физиологическом уровне, основным ферментом которой является катехол-о-метилтрансфераза, зависимая от экспрессии гена СОМТ [6]. При наличии полноценно активного фермента катехол-о-метилтрансферазы происходит адекватное поддержание нормальных концентраций катехоламинов. Однако в случае длительного воздействии стрессора и недостаточности защитных систем возникает состояние гиперкатехоламинемии, в свою очередь негативно отражающееся на органах-мишенях, содержащих специфические рецепторы [6, 7]. При повышенных концентрациях катехоламинов происходит повышение тонуса миометрия и нарушение маточно-плацентарного кровотока, что, несомненно, отражается на состоянии беременности.

В результате внутриклеточных метаболических процессов постоянно происходит образование и накопление активных форм кислорода (АКФ) [8]. АКФ обладают важными регуляторными функциями, однако неконтролируемое накопление АКФ влечет за собой дисбаланс окислительно-восстановительных реакций в организме и может приводить к структурным повреждениям в молекуле ДНК, провоцируя мутагенез [8]. Во время беременности происходит значительная перестройка многих химических и метаболических процессов, увеличивается количество ненасыщенных жирных кислот, являющихся основным субстратом для перекисного окисления липидов. В организме за элиминацию АКФ и свободных радикалов отвечают ферменты антиоксидантной системы (АОС), функциональная активность которых генетически детерминирована [8, 9]. У носителей разных полиморфных вариантов генов ферментов АОС последние могут отличаться по своей активности. Недостаточная активность ферментов АОС сопровождается повышенной уязвимостью организма в условиях окислительного стресса [9].

В соответствии с вышеизложенным объектом настоящего исследования являлось изучение распределения аллелей генов АОС (rs 4680 гена COMT, rs 17880664 гена CAT, rs 713041 гена GPX4,rs 17883901 гена GCLC, rs 4880 гена SOD2)у пациенток с неоднократными репродуктивными потерями в сравнении со здоровыми женщинами.

Обследованы 508 пациенток: 311 — с эпизодами невынашивания беременности в анамнезе (основная группа), 197 — без потерь беременности при реализованной репродуктивной функции (группа контроля). Всем пациенткам было проведено общее и клинико-лабораторное обследование с целью исключения иных причин потери беременности. У пациенток основной группы проведено кариотипирование абортусов для выявления тяжелых аномалий кариотипа, приведших к невынашиванию, что являлось критерием исключения пациенток из исследования.

Молекулярно-генетическое исследование было проведено после предварительного забора 5 мл периферической венозной крови пациенток в пробирку, содержащую консервант — раствор К3EDTA, в соотношении 1:10. В последующем до постановки реакций образцы хранили при температуре —20—80 °С. Для выделения ДНК использовали наборы реактивов Diatom DNA Prep 200 (Isogene Lab.Ltd, Россия), согласно заявленному протоколу.

Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) методом аллельспецифической тетрапраймерной реакции [10] осуществляли с использованием лиофилизированных готовых наборов Master Mix (фирма «Изоген») и праймеров (Евроген или Синтол) с последующим электрофорезом с интеркалирующим красителем бромида этидием амплифицированных фрагментов ДНК в 2% агарозном геле.

Результатом генотипирования было выявление полиморфных вариантов rs 4680 гена COMT, rs 17880664 гена CAT, rs 713041 гена GPX4, rs 4880 гена SOD 2, rs 17883901 гена GCLC с последующей оценкой распределения аллелей у женщин с привычным невынашиванием беременности и у здоровых женщин.

В настоящем исследовании мы изучили распределение аллелей полиморфного варианта rs4680 гена COMТ у пациенток с невынашиванием беременности по сравнению с группой здоровых женщин. При данном полиморфизме происходит замена в нуклеотиде азотистого основания гуанина на аденин, сопровождающаяся заменой в первичной структуре белка аминокислоты валин на метионин [11, 12]. При таких изменениях происходит экспрессия не- одинакового по своей активности фермента катехол-О-метилтрансферазы. Доказано, что у носителей генотипа G/G наблюдается экспрессия полноценного фермента, гетерозиготы G/A отличает некоторое снижение активности СОМТ, у гомозигот по мутантному аллелю, А (генотип A/A) наблюдается 3—4-кратное снижение активности фермента по сравнению с генотипом дикого типа [6]. По результатам проведенных ранее исследований, носительство аллелей rs 4680 ассоциировано с повышенным риском развития некоторых соматических заболеваний, однако в контексте невынашивания беременности данный полиморфный вариант ранее не изучался [6, 13]. В настоящей работе мы проследили взаимосвязь носительства аллелей rs 4680 гена COMТ и риска привычного невынашивания беременности.

Распределение генотипов у обследованных пациенток соответствовало равновесию Харди—Вайнберга. Гомозиготный генотип G/G имел протективный эффект: в группе здоровых женщин выявлен у 32,51% (n=53), что достоверно выше по сравнению с женщинами с привычным невынашиванием — 20,47% (n=61), χ²=8,21, р=0,0042. Согласно общепопуляционным показателям, дикий генотип G/G также является наименее распространенным и наблюдается примерно у 17% европеоидов.

Что касается гетерозиготного генотипа G/A, то достоверной разницы между группами не выявлено. Среди пациенток с невынашиванием данный генотип встречался у 54,02% (n=161), что не отличалось от группы контроля — 44,17% (n=72). Полученные данные полностью совпали с показателями по популяции европеоидов в целом, где данный генотип является наиболее распространенным ~ 45% (см. рисунок).

По распределению аллеля, А в гомозиготном состоянии также не наблюдалось статистически достоверных различий, и в обеих группах он выявлен примерно в 30% случаев: у 25,50% (n=76) пациенток основной группы и у 23,31% (n=31) группы контроля, что соответствовало общепопуляционным показателям для европеоидов (см. рисунок). Нами был также проведен аддитивный тест Кохрана—Армитажа, по результатам которого установлено, что аллель, А проявляет доминантную модель наследования у пациенток с привычным невынашиванием, на основании чего носительство обоих генотипов А/А и G/А может повышать риск потери беременности, χ²=4,32, р=0,03. Также установлено, что у носителей аллеля, А достоверно выше шанс потери беременности в сравнении с носителями аллеля G (аддитивная модель: OR=1,33, р=0,046, 95% df=0,57—0,99).

Другой группой генов, вошедших в наше исследование, являлись гены АОС. Одним из наиболее важных звеньев АОС является фермент каталаза, ген САТ которой локализован на 11-й хромосоме [14]. В нашем исследовании объектом изучения был выбран наименее описанный полиморфизм Т21А rs 17880664 гена САТ, при котором происходит замена азотистого основания тимина на аргинин в позиции 21 нуклеотида, изученный в контексте предрасположенности к развитию некоторых соматических заболеваний [15, 16]. Установлено, что у пациенток с невынашиванием беременности дикий аллель Т в гомозиготном состоянии выявлен в 40,98% (n=125), что достоверно не различалось от показателей в группе здоровых женщин — 38,74% (n=74). Вклад гетерозиготы Т/А составил в основной группе 48,52% (n=148), в контрольной группе этот показатель был практически идентичным и составил 47,12% (n=90), достоверных различий также не выявлено. Наименее распространенным оказался минорный аллель, А в гомозиготном состоянии. У пациенток с невынашиванием беременности он наблюдался в 10,49% (n=32), тогда как в контрольной группе генотип А/А выявлен у 14,14% (n=27), однако разница не являлась статистически достоверной.

Также была изучена роль полиморфизма rs 713041 гена GPX4, кодирующего фермент АОС глутатионпероксидазу 4, в аспекте невынашивания беременности. Объектом изучения был выбран наиболее описанный полиморфизм С44Т (rs 713041) гена GPХ4, при котором возникает замена цитозина на тимин в позиции 44, что сопровождается экспрессией фермента глутатионпероксидазы 4 с пониженной активностью, приводящей, по данным литературы [17, 18], к развитию многих мультифакториальных заболеваний.

У пациенток основной группы аллель С rs 713041 гена GPХ4 в гомозиготном состоянии наблюдался в 41,3% (n=121) случаев, что достоверно не отличалось от группы здоровых женщин — 39,15% (n=74). Относительно гетерозиготного генотипа С/Т полученные результаты указывают на его носительство у 42,0% (n=123) пациенток с невынашиванием беременности, тогда как в группе контроля наблюдались несколько большие показатели — 50,26% (n=95), что, однако, также не было достоверным.

Что касается аллеля Т в гомозиготном состоянии Т/Т, то среди пациенток с репродуктивными потерями он встречался у 16,72% (n=49), тогда как среди здоровых женщин — всего у 10,58% (n=20), что также статистически не различалось.

Еще одним из важнейших звеньев АОС является восстановленный глутатион (низкомолекулярный тиол), при участии которого происходит восстановление и изомеризация дисульфидных связей, а также изменение активности ферментов и других белков. Синтез глутатиона происходит под воздействием фермента глутаматцистеинлигазы (GCL), состоящей из двух субъединиц — регуляторной субъединицы (GCLM) и обеспечивающей каталитическую активность фермента (GCLC) [19].

В настоящем исследовании мы провели изучение полиморфизма С129Т (rs 17883901) гена GCLC, при котором происходит замена цитозина на тимин в позиции 129. По результатам проведенного генотипирования выявлено стойкое превалирование аллеля С в гомозиготном состоянии в обеих группах пациенток. В основной группе частота генотипа С/С составила 87,1% (n=270), среди здоровых женщин этот показатель также встречался у подавляющего большинства — 87,76% (n=172), что не являлось статистически различным. Генотип С/Т был выявлен среди женщин с потерей беременности у 12,26% (n=38), а в группе контроля — у 10,71% (n=21), разница не была достоверна.Наименее распространенным являлся минорный аллель Т в гомозиготном состоянии, который встречался всего у 3 (1,53%) здоровых женщин, тогда как в основной группе данный вариант наблюдался всего в 2 (0,6%) случаях.

Другой группой наиболее активных агентов АОС являются ферменты семейства супероксиддисмутаз (СОД) [9]. В настоящем исследовании мы провели изучение наиболее известного полиморфизма гена SOD2 Т47С (rs 4880). Данный полиморфный вариант характеризуется заменой аллеля Т на аллель С в позиции 47, который приводит к изменению в структуре белка с заменой аминокислоты аланина на валин со снижением в той или иной степени активности кодируемого фермента [20]. Полиморфизм rs 4880 наиболее изучен и является предиктором развития многих мультифакториальных заболеваний, в том числе и невынашивания беременности [20, 21]. Носительство минорного аллеля С в гомозиготном состоянии сопровождается экспрессией фермента с ослабленными антиоксидантными свойствами [20, 21].

По результатам проведенного нами генотипирования установлено, что у пациенток основной группы аллель Т в гомозиготном состоянии представлен в 25,16% (n=77) случаев, в контрольной группе этот показатель составил 22,45% (n=44), что достоверно не различалось. По разным источникам литературы [20, 21], данный генотип рассматривается как благоприятный, поскольку обеспечивает экспрессию полноценного фермента СОД2. Частота гетерозиготы C/Т у женщин с невынашиванием беременности в нашем исследовании составила 49,67% (n=152), что оказалось близким к контрольной группе — 55,10% (n=108), разница не была достоверна. Частота встречаемости аллеля С в гомозиготном состоянии у пациенток с невынашиванием беременности составила 25,16% (n=77), что достоверно не отличалось от группы контроля — 22,44% (n=44).

Выявлена взаимосвязь носительства вариантного аллеля гена СОМТ и повышенного риска привычного невынашивания беременности. При обследовании пациенток с неблагоприятными исходами беременности в анамнезе выявление генотипов А/А и G/А rs 4680 гена СОМТ может позволить выделить группу риска, на основании чего в последующем возможна разработка профилактических и лечебных мероприятий, приводящих к снижению риска невынашивания беременности у таких пациенток.

Изученные полиморфные варианты генов ферментов антиоксидантной системы rs 17880664 гена CAT, rs 713041 гена GPX4, rs 4880 гена SOD2, rs 17883901 гена GCLC не являются клинически значимыми в контексте невынашивания беременности, носительство вариантных аллелей перечисленных генов не ассоциируется с повышенным риском репродуктивных потерь.