Введение
Распространенность врожденных пороков сердца (ВПС) весьма вариабельна: согласно данным литературы, она колеблется от 0,6 до 9,4 на 1000 рожденных живыми [1]. Гетерогенность частоты выявления аномалий сердечно-сосудистой системы в различных географических регионах сопряжена с социально-экономическими условиями, уровнем пренатальной диагностики, доступности высокотехнологичной специализированной помощи [1]. Этиология ВПС, как и асоциированных с ними осложнений, носит многофакторный характер, включающий в том числе генные нарушения, ответственные как за органогенез, так и за патофизиологические изменения у данной обширной популяции пациентов [2, 3]. Генетически детерминированные изменения системы гемостаза могут быть факторами риска развития тромботических событий (ТС) [4], клинические последствия которых в популяции пациентов с ВПС в условиях измененной физиологии приобретают особую значимость [5].
Согласно данным литературы, частота ТС в популяции пациентов с ВПС значительно выше по сравнению со здоровым контролем [5]. Из верифицированных факторов риска особое место отводится сердечной недостаточности, хронической гипоксемии как основным патогенетическим механизмам развития ТС [6, 7]. Кроме того, периоперационное использование гепарина рассматривается как фактор риска гепаринорезистентности в силу связывания комплекса «гепарин — антитромбин» и, как следствие, повышения тромбообразования [7].
Цель исследования — изучить распространенность полиморфизма генов системы гемостаза и роль этого полиморфизма в реализации тромботических событий у пациентов детского возраста, подвергнутых кардиохирургическим вмешательствам.
Материал и методы
В проспективное одноцентровое исследование «случай — контроль» включены 179 пациентов, подвергнутых кардиохирургической коррекции в условиях искусственного кровообращения (ИК) в ГБУЗ «НИИ-ККБ №1 им. проф. С.В. Очаповского» в 2022 г.
Все пациенты разделены на две группы по критерию наличия или отсутствия ТС. В группу с верифицированными ТС включены 42 пациента. В контрольную группу вошли 137 пациентов без тромботических событий. Основные характеристики клинических групп приведены в табл. 1.
Таблица 1. Сравнительная характеристика клинических групп
| Параметр | Группа | p | |
| ТС (n=42) | Без ТС (n=137) | ||
| Масса тела, кг | 5,33±3,17 4 2,2; 19 [3,4; 6,1] | 6,72±3,15 6,25 2,4; 24 [4,19; 8,5] | <0,05 |
| Рост, см | 60,86,73±13,93 55 46; 110 [52; 69] | 66,61±13,17 66,0 46; 134 [56; 72,5] | <0,05 |
| ИМТ, кг/м2 | 13,41±2,04 13,22 9,92; 22,68 [12,35; 14,4] | 14,49±2,26 14,29 9,22; 24,57 [13,18; 16,08] | 0,05 |
| Время ИК, мин | 134±56 138 42,3; 183 [63,5; 125,5] | 145±52 149 44,5; 192,5 [62; 128,5] | 0,75 |
| Время ишемии, мин | 109±51 102 35; 157 [38,5; 132,5] | 112±43 104 34; 165 [45; 139] | 0,68 |
| SataO2,% | 82,51±13,75 85,9 32; 99,9 [74; 95,1] | 90,32±9,95 94,4 62,9; 99,7 [84,95; 97,5] | <0,05 |
Примечание. Данные представлены в виде M±m, Me, значений min, max [25%; 75%]. ТС — тромботические события; ИМТ — индекс массы тела; ИК — искусственное кровообращение.
Проведено молекулярно-генетическое исследование методом полимеразной цепной реакции по определению мутаций в генах F2_20210_G>A (коагуляционный фактор II — протромбин), F5_1691_G>A (фактор V, фактор Лейдена), F7_10976_G>A (фактор VII), F13_G>T (фактор XIII), FGB_455_G>A (фибриноген), ITGA2_807_C>T (интегрин альфа-2), ITGB3_1565_T>C (тромбоцитарный рецептор фибриногена), PAI-1 (ингибитор активатора плазминогена 1). Определяли концентрацию ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1).
Проведен мониторинг тромботических событий, оцениваемых нами в виде изменения цвета, отечности конечности, дисфункции установленного катетера, верификации тромбоза в системе верхней и/или нижней полой вены или же изменения скорости кровотока при выполнении ежедневной доплерометрии с применением ультразвуковой диагностической системы CX50 (Philips Ultrasound, Inc., США).
Для интраоперационной гепаринизации использовали раствор нефракционированного гепарина сульфата в соответствии с вес-ассоциированным протоколом (300 ед. на 1 кг массы тела) с повторным его введением каждые 30—120 мин для достижения целевых значений активированного времени свертывания >480 с (использовали портативный коагулометрический анализатор Hemochron Junior, Accriva Diagnostics, Inc., США).
ИК осуществлялось с расчетной производительностью 3,0—2,8 л/мин/м2 (200—150 мл на 1 кг массы тела в минуту) с помощью аппарата искусственного кровообращения Stöckert S5 (LivaNova Deutschland GmbH, Германия).
Согласно протоколу, принятому в ГБУЗ «НИИ-ККБ №1 им. проф. С.В. Очаповского», все пациенты с установленными венозными и/или артериальными катетерами получали антитромботическую профилактику. Во все промывочные растворы линий мониторинга высокого давления добавляли раствор гепарина сульфата (4 Ед/мл). Такое же количество раствора гепарина добавляли и в раствор парентерального питания. Периоперационная профилактика тромботических осложнений осуществлялась в соответствии с принятыми клиническими протоколами и международными рекомендациями [8].
Оценка гемодинамического статуса пациента в периоперационном периоде проводилась путем мониторинга электрокардиографии, артериального давления, центрального венозного давления, центральной и периферической температуры, оценки кислотно-щелочного состояния артериальной и венозной крови, эхокардиографии. В отдельных случаях инвазивный мониторинг расширяли и проводили регистрацию уровня давления в левом предсердии и в легочной артерии. К критериям сердечной недостаточности отнесены: сниженная или нарушенная контрактильная функция, необходимость периоперационного использования инотропной терапии, проведение терапии сердечными гликозидами, мочегонными средствами, использование дилататоров малого и большого круга кровообращения (таких как iNO, ингибиторы фосфодиэстеразы, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента).
Статистический анализ проведен с использованием программного пакета Statistica 13.3 (StatSoft Inc., США). Для оценки распределения значений категориальных характеристик в группах использовали частотный анализ. Проверка закона распределения количественных характеристик клинических групп с применением критерия хи-квадрат (χ2) Пирсона установила их несоответствие нормальному распределению (p<0,05), поэтому для их сравнения в группах применяли непараметрический критерий Манна—Уитни. Корреляционные связи оценивали при помощи коэффициента корреляции Спирмена. Использован общепринятый порог уровня статистической значимости p=0,05. Для обработки данных и достижения поставленной цели рассчитывали среднее арифметическое (M), стандартное отклонение (m) (далее в записи использована форма M±m), рассчитывали также медиану (Me), минимальное (min) и максимальное (max) значения, нижний и верхний квантили (обозначены квадратными скобками) [9].
Исследование одобрено локальным этическим комитетом ГБУЗ «НИИ-ККБ №1 им. проф. С.В. Очаповского» (протокол от 21.01.2022 №7/2022).
Результаты и обсуждение
Данные анализа полиморфизма генов, контролирующих факторы свертывания и тромбоцитарное звено гемостаза, и установленная частота мутаций генов представлены в табл. 2. Случаи полиморфизма генов, контролирующих II (F2_20210_G>A) и V (F5_1691_G>A) факторы, не зарегистрированы, что свидетельствует о невысоком риске тромбофилий в анализируемой выборке пациентов с ВПС [10].
Таблица 2. Доля пациентов с верифицированным полиморфизмом генов
| Ген | Тип полиморфизма | Число пациентов, n (%) |
| F2_20210_G>A | G/G гомозигота | 179 (100) |
| G/A гетерозигота | 0 (0) | |
| F5_1691_G>A | G/G гомозигота | 179 (100) |
| G/A гетерозигота | 0 (0) | |
| F7_10976_G>A | G/G гомозигота | 130 (72,63) |
| G/A гетерозигота | 49 (27,37) | |
| А/А гомозигота | 0 (0) | |
| F13_G>T | G/G гомозигота | 149 (83,24) |
| G/T гетерозигота | 27 (15,08) | |
| Т/Т гомозигота | 3 (1,68) | |
| FGB_455_G>A | G/G гомозигота | 75 (41,9) |
| G/A гетерозигота | 69 (38,55) | |
| А/А гомозигота | 35 (19,55) | |
| ITGA2_807_C>T | С/С гомозигота | 44 (24,58) |
| С/Т гетерозигота | 111 (62,01) | |
| Т/Т гомозигота | 24 (13,41) | |
| ITGB3_1565_T>C | Т/Т гомозигота | 125 (69,83) |
| Т/С гетерозигота | 54 (30,17) | |
| С/С гомозигота | 0 (0) | |
| PAI-1 | 5G/5G гомозигота | 54 (30,17) |
| 5G/4G гетерозигота | 107 (59,78) | |
| 4G/4G гомозигота | 18 (10,05) |
Гетерозиготная мутация в гене F7_10976_G>A отмечена у 49 (27,37%) пациентов представленной выборки. Обращают на себя внимание гомозиготная Т/Т мутация у 3 (1,68%) пациентов и гетерозиготная мутация G/T у 27 (15,08%) пациентов при анализе полиморфизма гена фактора XIII (F13_G>T). В гене FGB_455_G>A гетерозиготная мутация выявлена у 69 (38,55%) пациентов, а гомозиготная мутация зарегистрирована у 35 (19,55%) пациентов.
Гетерозиготная мутация в гене ITGA2_807_C>T верифицирована у 111 (62,01%) пациентов, а гомозиготная мутация — у 24 (13,41%) пациентов. В локусе другого фактора, контролирующего тромбоцитарное звено гемостаза, ITGB3_1565_T>C, гетерозиготная мутация отмечена у 54 (30,17%) пациентов, а гомозиготных Т/Т мутаций не выявлено.
В локусе, ответственном за экспрессию ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1), гетерозиготная мутация верифицирована у 107 (59,78%) пациентов, тогда как гомозиготная мутация — у 18 (10,05%) пациентов.
ТС зарегистрированы у 42 (23,46%) пациентов из общего числа включенных в исследование. При этом обращает на себя внимание, что пациенты группы ТС характеризуются меньшей массой тела, меньшим ИМТ (см. табл. 1). Кроме того, отмечено, что ТС регистрировались чаще у пациентов с хронической гипоксемией, что подтверждается ранее проведенными нами исследованиями, позволившими идентифицировать латентные факторы риска, сопряженные с сердечной недостаточностью, физиологией единственного желудочка сердца и хронической гипоксемией, характерной для обширной группы ВПС [8, 11]. Так, в настоящем исследовании показано, что частота сердечной недостаточности в группе пациентов с верифицированными ТС составила 57,86%, тогда в группе пациентов без ТС — 42,14%. Проведенный анализ позволил установить умеренную корреляционную связь сердечной недостаточности и вероятности наступления тромботических событий (R=0,306) (табл. 3).
Таблица 3. Корреляционные связи показателей в клинических группах в отношении тромботических событий
| Переменная | Ранговые корреляции Спирмена |
| Масса тела | –0,278 |
| Рост | –0,257 |
| ИМТ | –0,250 |
| SataO2 | –0,341 |
| Сердечная недостаточность | 0,306 |
| F7_10976_G>A | 0,207 |
| F13_G>T | –0,047 |
| FGB_455_G>A | 0,063 |
| ITGA2_807_C>T | –0,055 |
| ITGB3_1565_T>C | –0,187 |
| PAI-1 | –0,257 |
| PAI-1, концентрация | 0,470 |
Примечание. Отмеченные корреляции значимы (p<0,05). ИМТ — индекс массы тела.
Концентрация PAI-1 у пациентов группы ТС составила 44,99±14,52 нг/мл, тогда как у пациентов контрольной группы — 25,93±16,02 нг/мл (p=0,0001) (рис. 1). Значимые (p<0,05) ранговые корреляции Спирмена в отношении концентрации PAI-1 в группе с верифицированными ТС составили R=0,47 (см. табл. 3).
Рис. 1. Диаграмма размаха концентрации ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1) в клинических группах.
Анализ полиморфизма генов, ответственных за экспрессию факторов свертывания, позволил провести сравнение в исследуемой и контрольной группах. Обращает на себя внимание, что частота гетерозиготной мутации в гене F7_10976_G>A в группе с верифицированными ТС составила 41,07%, тогда как в группе без ТС — 21,14% (рис. 2). Известно, что мутация в данном локусе сопряжена со снижением уровня фактора FVII и сокращением рисков развития тромбозов [12, 13]. Умеренные ранговые корреляции Спирмена (R=0,207) (см. табл. 3) говорят о роли гетерозиготных мутаций в локусе F7_10976_G>A, что в большей степени свидетельствует о существовании некой равновесной системы, компенсирующей изменения коагуляционного и антикоагуляционного профиля.
Рис. 2. Частота мутаций в локусе F7_10976_G>A в клинических группах.
На рис. 2—5: а — пациенты без тромботических событий; б — пациенты с тромботическими событиями.
Гетерозиготная мутация С/Т в гене ITGA2_807_C>T отмечена у 55,36% пациентов группы ТС, а гомозиготная мутация С/С — у 35,71% пациентов группы ТС. Гомозигота Т/Т верифицирована в 8,93% случаев. Из пациентов без ТС 65,04% имели гетерозиготную мутацию С/Т, 15,45% — гомозиготную мутацию Т/Т, тогда как гомозигота С/С была у 19,51% больных (рис. 3). Известно, что наличие мутации 807_C>T в гене ITGA2 может значительно повышать скорость адгезии и агрегации тромбоцитов [14].
Рис. 3. Частота мутаций в локусе ITGA2_807_C>T в клинических группах.
Согласно данным литературы, ген субъединицы β3 интегрина (ITGB3) ассоциирован с риском развития тромбозов [15]. В нашем исследовании гетерозиготная мутация в локусе фактора, контролирующего тромбоцитарное звено гемостаза ITGB3_1565_T>C, отмечена у 31,96% пациентов группы ТС, что в 2 раза чаще, чем у пациентов контрольной группы. При этом гомозиготные мутации не верифицированы у пациентов анализируемых клинических групп.
Мутации в локусе, ответственном за экспрессию ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1), являются наиболее часто выявляемыми в общей популяции пациентов с установленными факторами риска тромбозов [16], что также подтверждено настоящим исследованием. Так, гетерозиготная мутация 5G/4G отмечена у 73,21% пациентов группы с верифицированными ТС, гомозиготная мутация 4G/4G — у 17,86% пациентов (рис. 4).
Рис. 4. Частота (%) мутаций в локусе PAI-1 в клинических группах.
Частота гетерозиготных мутаций в локусе F13_G>T составила 17,89% у пациентов группы без ТС, а доля гомозиготных изменений — 0,81%, тогда как у пациентов группы ТС частота гетерозиготных мутаций была ниже — 10,71%, а частота гомозиготных мутаций была сравнительно выше — 3,57% (рис. 5). Ранговые корреляции Спирмена в отношении вероятности наступления ТС для F13_G>T установлены на низких значениях (R= –0,047).
Рис. 5. Частота (%) мутаций в локусе F13_G>T в клинических группах.
Заключение
Данные, представленные в настоящем исследовании, подтверждают тот факт, что тромботические события являются частым осложнением периоперационного периода у пациентов с врожденными пороками сердца, подвергнутых кардиохирургической коррекции. Верификация дополнительных факторов риска, наследственной предрасположенности для реализации тромботических осложнений является особо актуальной в отношении пациентов с гемодинамической коррекцией при сложных структурно-функциональных нарушениях сердечно-сосудистой системы.
Проведенный нами анализ выявил роль концентрации PAI-1 в реализации тромботических событий, а также высокую частоту гетерозиготных и гомозиготных мутаций в локусе, ответственном за экспрессию PAI-1. Нами установлена большая частота гетерозиготных мутаций гена субъединицы ITGB3, в 2 раза чаще, чем в контрольной группе. Верифицирована высокая частота гетерозиготной мутации 807_C>T в гене ITGA2, что может способствовать повышению скорости адгезии и агрегации тромбоцитов. Говоря о вероятных механизмах возникновения полиморфизма в указанных аллелях генов, следует указать на роль гипоксии как универсального патогенетического механизма. Это открывает перспективы для дальнейших исследований, направленных на изучение причин возникновения тромботических событий и частоты их реализации в соответствии с генетической предрасположенностью и прочими факторами риска в популяции пациентов неонатального и раннего детского возраста с врожденными пороками сердца.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.