Чувствительность различных клеточных культур к респираторно-синцитиальному вирусу человека из клинического материала пациента

Одним из наиболее распространенных патогенов во всем мире является респираторно-синцитиальный вирус человека (human respiratory syncytial virus — HRSV) [1]. Он вызывает заболевания нижних дыхательных путей, поражающие людей всех возрастов, однако наиболее серьезные симптомы проявляются у новорожденных, младенцев, пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом [2]. По данным глобального исследования общая смертность от HRSV может достигать 94 600—149 400 человек каждый год [3]. Поскольку респираторно-синцитиальная инфекция не оставляет стойкого иммунитета, реинфекция возможна в любом возрасте [4, 5]. В России ежегодный эпидемический подъем заболеваемости вирусной инфекцией наблюдается поздней осенью, зимой и ранней весной [6].

Респираторно-синцитиальный вирус представляет собой одноцепочечный РНК-вирус рода Orthopneumovirus семейства Pneumoviridae [7]. Среди трудностей, связанных с изучением вируса и созданием новых подходов к терапии вызываемых им заболеваний, следует отметить отсутствие единой модели респираторно-синцитиальной инфекции на животных из-за различных фенотипов заболевания, вызываемых вирусом у разных видов [8—13]. Кроме того, многие авторы подчеркивают сложность культивирования HRSV в культурах клеток [14]. Большинство исследований in vitro проводили с использованием постоянных клеточных линий дыхательных путей (HEp-2, A549, BEAS-2B) либо первичных эпителиальных клеток, полученных из дыхательных путей легких человека. Недостатком последних является ограничение в клиническом материале для получения первичных культур клеток. Таким образом, для выделения и изучения HRSV охарактеризован узкий клеточный спектр [15].

В данной работе были проанализированы взаимодействия исследуемого вируса с диплоидной культурой клеток легкого эмбриона человека (ЛЭЧ-3) и перевиваемой клеточной линией карциномы человека (HeLa). Полученные результаты в дальнейшем позволят получить информацию об эффективности репликации HRSV в разных культурах человеческого происхождения и его влиянии на митотический цикл различных типов клеток. Эти данные могут быть полезны для более глубокого понимания патогенеза вирусной инфекции и разработки новых подходов к ее терапии.

Работа проведена с использованием двух типов клеток, чувствительных к HRSV: диплоидных культур клеток ЛЭЧ-3 и перевиваемых клеток HeLa из коллекции ФНИИВИ «Виром» Роспотребнадзора. Первые выращивали в смеси равных объемов сред Eagle МЕМ (HiMedia, Индия) и Medium 199 (HiMedia, Индия) с добавлением 10% сыворотки Fetal Bovine Serum (HiMedia, Индия) в пластиковых флаконах с площадью 25 см² (Corning, США). HeLa культивировали с использованием Medium 199 с 10% FBS.

Для выделения HRSV были отобраны носоглоточные мазки от больных с острой респираторной вирусной инфекцией (ОРВИ) с положительным результатом ОТ-ПЦР на его наличие и отрицательным на другие респираторные вирусы («АмплиСенс Influenza virus A/B-FL» и «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL», Россия).

С целью изучения чувствительности клеточных культур к HRSV клинический материал вносили в культуральные плоскодонные пробирки (TFS, США) с монослоем исследуемых клеток и инкубировали при +37 °C в условиях CO₂ инкубатора (Binder, Германия). Визуальную оценку признаков цитопатического эффекта (ЦПЭ) вируса проводили каждые 24 ч под инвертированным микроскопом Primovert (Carl Zeiss AG, Германия). При наличии дегенеративных изменений в монослое отбирали супернатант и подтверждали вирусную активность HRSV методом ОТ-ПЦР.

Динамику репликации HRSV в каждой культуре клеток определяли измерением титра вируса в вируссодержащей жидкости (MOI 1) в разные временные точки на 96-луночных культуральных планшетах (SPL Life Sciences, Корея). Результаты учитывали по выявлению характерного ЦПЭ при совместном культивирования при +37 °C с повышенным содержанием CO₂ в течение 14 сут. Значение 50% тканевой цитопатической дозы (lg ТЦПД₅₀/см³) рассчитывали по методу Рида и Менча [16].

Митотическую активность клеток определяли на 1000 клеток (‰) при пересчете 6000—8000 клеток, учитывая клетки в поздней про-, мета-, ана- и телофазах. Аберрантные митозы классифицировали по схеме, предложенной И.А. Аловым [17]. Для определения патологических форм митоза считали 300 делящихся клеток, принимая во внимание клетки с фрагментацией ядер, а также ядрами неправильной формы (лопастные, почкующиеся и гигантские) [18].

Статистическая обработка данных выполнена с помощью программного обеспечения Microsoft Office Excel 2019. Достоверность различий средних значений показателя инфекционного титра в клетках ЛЭЧ-3 и HeLa подтверждали с помощью t-критерия Стьюдента. Достоверность различий между значениями митотической активности оценивали параметрическими и непараметрическими критериями (F-критерий Фишера и U-критерий Манна-Уитни) сравнения независимых выборок. Достоверность различий считали статистически значимой при уровне значимости 0,05.

Диплоидная культура клеток ЛЭЧ-3, используемая в работе в фазе активной пролиферации, представляла собой фибробластоподобные клетки, обладающие ориентированным ростом, указывающим на наличие контактного торможения. Ядра овальные, вытянутые. Митотическая активность клеток на 3 сутки роста составила 16,8±0,06‰. Количество патологических форм митоза было незначительным и составляло не более 1,7±0,8% от числа делящихся клеток.

Перевиваемая линия клеток HeLa отличалась эпителиоподобной формой клеток (реже — полигональные или вытянутые). Ядра овальные, крупные. Митотический индекс на 3-и сутки роста соответствовал 56,0±1,51 ‰. Количество аномальных форм митоза в этой культуре составляло 25,7±0,89% от числа делящихся клеток.

Для выделения HRSV было проведено 3 слепых пассажа в условиях монослоя исследуемых клеток. Первые морфологические изменения в монослое ЛЭЧ-3 были отмечены на 3-и сутки после заражения и характеризовались утончением веретенообразных клеток. Цитопатические перестройки в линии HeLa наблюдались несколько раньше — на 2-е сутки эксперимента было отмечено набухание и вакуолизация клеток. На 4-е сутки ЦПЭ в обеих клеточных культурах носил специфический для HRSV характер. В монослое зараженных клеток выделялись отдельные симпласты различной формы: для ЛЭЧ-3 чаще веретенообразной (рис. 1), а для HeLa — округлой (рис. 2).

Рис. 1. Цитопатический эффект (ЦПЭ) на культуре клеток ЛЭЧ-3 при увеличении объектив Primo Plan-ACHROMAT 10´/0,25 Ph 1, окуляр WF 10×/20.

а — интактная монослойная культура клеток; в — зараженная культура HRSV на 4-е сутки.

Рис. 2. Индикация репродукции вируса в культуре клеток HeLa по цитопатическому эффекту (ЦПЭ) 3 при увеличении объектив Primo Plan-ACHROMAT 10´/0,25 Ph 1, окуляр WF 10×/20.

а — интактная монослойная культура клеток; в — зараженная культура HRSV на 4-е сутки.

Сравнительное изучение накопления HRSV в клетках ЛЭЧ-3 и HeLa на четвертом пассаже выявило, что в ЛЭЧ-3 инфекционный титр вируса составлял 5,50±0,17, что на 1,5—2,0 выше, чем вирусная нагрузка в HeLa — 3,57±0,04 (рис. 3). Митотическая активность клеток HeLa, заряженных HRSV, была резко угнетена в течение всего срока наблюдения относительно контроля (56,0±1,51) и изменялась в диапазоне от 12,2±1,3 до 34,6±0,9. Коэффициент фаз для незараженной культуры составлял 1,4±0,8, а для инфицированных клеток этот показатель увеличился, достигая 4,5±0,74 в 1-е сутки после заражения.

Рис. 3. Сравнительная характеристика репродукции HRSV в клеточных линиях ЛЭЧ-3 и HeLa в течение 14 дней.

Таким образом, клеточная культура ЛЭЧ-3 является более чувствительной к HRSV, чем HeLa. Кроме того, в диплоидных клетках репликация вируса наблюдалась на 2—12-е сутки, а в эпителиальных — на 2—10-е сутки.

Изучение митотического цикла клеток является важным аспектом вирусологических исследований, особенно при изучении влияния вирусов на клетки хозяев и патогенез вирусных инфекций. Митотическая активность клеток ЛЭЧ-3 в 1-е сутки после заражения HRSV увеличивалась по сравнению с контролем (16,8±0,06‰), достигая 24,2±0,2 ко 2-му дню исследования (таблица). По мере развития дегенеративных процессов в культуре под действием вируса митотическая активность клеток снижалась до 8,8±0,04 ‰ на 4-е сутки. Величина коэффициента фаз зараженных клеток ЛЭЧ-3 в 2 раза превышала уровень незараженной культуры, что свидетельствует о превалировании числа профаз и метафаз над количеством ана- и телофаз.

Характеристика показателей митотического режима клеток ЛЭЧ-3 и HeLa, зараженных HRSV

Примечание. * — достоверное различие по критерию Фишера (F_теор<F_крит, p≤0,05); ** — достоверные различия по критерию Манна—Уитни (U_теор≤U_крит, p≤0,05).

Как в клетках ЛЭЧ-3, так и HeLa уже на следующий день после заражения наблюдалось увеличение числа патологических митозов (3,0±0,55 и 53,0±1,1 соответственно). В обеих клеточных культурах при заряжении HRSV основная доля аномалий митозов была представлена патологическими метафазами. Результаты качественной характеристики патологии метафаз показали, что основную часть патологических митозов в культурах составляли метофазы с отставанием хромосом, колхициноподобные и трехполюсные. Кроме того, для клеток ЛЭЧ-3 характерной была патология типа пиктнотической телофазы.

Оценивая ответную реакцию клеток изучаемых культур на заражение HRSV, можно отметить общую закономерность, характерную для клеток фибробластопободного и эпителиоидного типов. Однако изменения митотической активности в сравниваемых культурах были различны — стимуляция в фибробластоподобных клетках и угнетение в эпителиоподобной культуре HeLa.

Изучение патогенеза и разработка лекарственной терапии для заболеваний, вызываемых HRSV, являются важными задачами в медицинской науке. Применение in vitro моделей позволяет более детально изучить молекулярные и клеточные механизмы, связанные с патогенезом HRSV, без необходимости проведения экспериментов на живых организмах.

Создание экспериментальной модели in vitro может способствовать изучению различных аспектов вирусной инфекции, включая основные механизмы взаимодействия вируса с клетками дыхательной системы, влияние на иммунную систему и эффективность потенциальных противовирусных препаратов. Такая модель может быть полезной для определения молекулярных мишеней, связанных с репликацией вируса, и для изучения механизмов проникновения вируса в клетки.

Анализ чувствительности клеток к HRSV имеет важное значение при выборе клеточной модели для изучения патогенеза и лекарственной терапии данного вируса. Результаты показывают, что клетки ЛЭЧ-3 проявляют более явные морфологические изменения и имеют более высокие титр вируса (5,50±0,17) в сравнении с клетками HeLa (3,57±0,04). Это свидетельствует о более выраженной реакции клеток ЛЭЧ-3 на инфекцию HRSV. Также важными показателями для выбора клеточной модели ЛЭЧ-3 являются минимальное количество патологических митозов и длительная сохраняемость клеточного пласта в контрольной и экспериментальных группах (до 12—14 сут, относительно HeLa, у которых монослой сохранялся до 8—10 дней).

Рекомендуется использовать клеточную линию ЛЭЧ-3 для работы с HRSV, несмотря на чувствительность к данному вирусу, указанную в паспорте обеих культур клеток. Однако следует отметить, что выбор клеточной модели может зависеть от конкретных целей и задач исследования, а также от доступности и специфических требований протоколов проведения эксперимента.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФБУН ФНИИВИ «Виром» Роспотребнадзора №14-21 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 121041500044-2).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.