За последние десятилетия технический прогресс привел к возрастанию числа мультифакториальных заболеваний и появлению состояний, называемых «идиопатической интолерантностью к факторам внешней среды». По данным литературы [1], развитие этой категории заболеваний связано с нарушением метаболизма и детоксикации ксенобиотиков и эндогенных токсинов.

Детоксикации ксенобиотиков - сложный, многокомпонентный процесс, включающий несколько этапов. На первом этапе чужеродные агенты под действием микросомальных ферментов и цитоплазматических трансфераз образуют промежуточные электрофильные метаболиты, обладающие генотоксическими свойствами. На втором этапе эти жирорастворимые токсичные вещества переводятся в водорастворимые и выводятся из организма. Одним из важнейших ферментов второй фазы детоксикации является N-ацетилтрансфераза. NAT2 - ген, продукт которого ариламин-N-ацетилтрансфераза-2 играет важную роль в ацетилировании ароматических и гетероциклических аминов. Поэтому при нарушениях его функции, обусловленных полиморфизмом кодирующего гена, происходит накопление эндотоксинов, которые в свою очередь усиливают процессы свободнорадикального окисления в клетке [2].

Роль оксидативного стресса при эндометриозе доказана на основании изучения специфических маркеров [3]. Показано, что стадия эндометриоза не связана с количественными характеристиками этого критерия. В литературе [4] представлены также данные о том, что пациентки с полиморфизмом в гене NAT2 имеют ряд клинико-анамнестических особенностей.

Несмотря на то что эндометриоз является доброкачественной патологией, в некоторых случаях его проявления подобны злокачественной опухоли при быстрой прогрессии, вовлечении смежных органов и активном рецидивировании [5, 6]. Причины прогрессирования эндометриоза все еще остаются неизученными [7]. В последние годы большое значение в исследованиях патогенеза эндометриоза отводится влиянию не только неблагоприятных факторов окружающей среды, в частности антропогенным химическим веществам [8, 9], но и свободных радикалов, оксида азота и активных форм кислорода [10-13]. Доказано, что эти вещества нарушают перекисное окисление липидов клеточных мембран, повреждая ДНК и вызывая канцерогенный, мутагенный и цитотоксический эффект [14-17].

Ранее проведенное нами исследование выявило увеличение частоты точечных мутаций гена NAT2 (c.341T>C, c.481C>T и c.803A>G, c.590G>A) у пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза [18]. Результаты работ, посвященных из­учению степени выраженности оксидативного стресса и нарушений функции системы детоксикации у данной группы пациенток, в литературе не представлены, что послужило основанием для настоящего исследования.

Цель исследования - оценка взаимосвязи наличия мутаций гена NAT2 с уровнем эндогенной интоксикации и показателями оксидативного стресса у пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза.

В исследование включены 250 пациенток с бесплодием и эндометриозом, верифицированным при лапароскопии. По результатам генетического обследования пациентки были разделены на две группы, в зависимости от наличия или отсутствия точечных аллельных мутаций гена NAT2. Основную группу составили 198 (79,2%) пациенток с мутациями в аллельных вариантах гена NAT2 (c.341T>C, c.481C>T и c.803A>G, c.590G>A).

Из них: у 87 (43,9%) пациенток выявлено 1-2 мутации (NAT2*5A: c.341T>C, c.481C>T; NAT2*5C: c.341T>C, c.803A>G; NAT2*6: c.590G>A) и у 111 (56,1%) пациенток - 3 и более (NAT2*5B:c.341T>C, c.481C>T и c.803A>G; сочетание NAT2*5 и NAT2*6). В группу сравнения были включены 52 (20,8%) пациентки без мутаций в гене NAT2.

Проведена количественная оценка уровня эндогенной интоксикации (эндотоксический индекс, уровень молекул средней массы) и количественная оценка уровня оксидативного стресса (малоновый альдегид - МА, супероксиддисмутаза - СОД, общая антиоксидантная активность - ОАО) в сопоставлении с наличием точечных мутаций в гене NAT2 (с.341Т>C, c.481C>T, c.590G>A и c.803A>G).

Эндотоксический индекс (ЭИ) рассчитывали по формуле:

Средние молекулы (СМ) - класс соединений с молекулярной массой до 5000 Д, представляющие собой фрагменты незавершенного протеолиза. Определение уровня СМ проводили в сыворотке крови. Применяли скрининговый метод определения уровня СМ в биологических жидкостях, предложенный Н.И. Габриелян (Методические рекомендации Минздрава СССР. М 1985; 19). Сыворотку крови предварительно освобождали от высокомолекулярных белковых продуктов с помощью 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Получаемый кислотный элюат представляет собой грубую или неочищенную фракцию СМ. В состав фракции наряду с соединениями средней молекулярной массы входят соединения, присутствие которых, в силу используемого метода детекции, не влияет на величину получаемых результатов. После реакции биологического субстрата с трихлоруксусной кислотой и предварительного перемешивания, осуществляли центрифугирование при 3000 об/мин в течение 30 мин. Полученный надосадок разводили дистиллированной водой в 9 раз и измеряли его оптическую плотность при длинах волн 254 и 280 нм на спектрофотометре СФ-26 против дистиллированной воды. Использовали кюветы с длиной оптического пути 10 мм. Ответ о величине уровня СМ получали в единицах, численно равных показаниям спектрофотометра, умноженным на 100. В качестве контроля использованы нормативные данные, полученные в научно-диагностической лаборатории Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии (НЦАГиП) им. В.И. Кулакова при обследовании здоровых фертильных женщин [19].

Исследование МА проводилось в лаборатории на базе ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии (НИИЭМ) им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по методу Jagi в модификации M. Ishihara с тиобарбитуровой кислотой. Активность СОД и ОАО определяли в гемолизатах и сыворотке крови спектрофотометрическим кверцитиновым методом.

Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы SPSS (версия 10.0.7) и Statistica (версия 6.0) for Windows. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

Возраст обследованных женщин варьировал от 23 до 39 лет (средний возраст 30,2±0,4 года). Все пациентки обратились в клинику с жалобами на бесплодие, из них 114 (45,6%) больных - с первичным бесплодием, 136 (54,4%) - с вторичным.

При сборе анамнеза помимо основной жалобы на бесплодие у пациенток были выявлены некоторые особенности сопутствующих жалоб: в группе пациенток с мутациями и без них наблюдались дисменорея - у 154 (77,7%) и 17 (32,7%) пациенток соответственно (р<0,05), диспареуния - у 115 (58,1%) и 12 (23,1%) (р<0,05), хроническая тазовая боль - у 118 (59,6%) и 11 (21,1%) (р<0,05), овуляторные боли - у 134 (67,7%) и 16 (30,1%) (р<0,05), артралгия - у 58 (29,3%) и 5 (9,6%) (р<0,05), головная боль - у 188 (94,4%) и 35 (67,3%), ухудшение общего самочувствия - у 190 (96%) и 42 (80,7%) (р>0,05), снижение концентрации внимания, памяти - у 123 (62,1%) и 10 (19,4%) (р<0,05).

Все сопутствующие жалобы были умеренно выраженными, не влияли на качество жизни и не являлись причиной, по которой пациентка обратилась для проведения лечения.

Специфичных симптомов нарушения элиминации вредных агентов не существует, однако они могут включать нарушение концентрации, депрессию, нарушение памяти, слабость, головную боль или артралгии. В литературе [20] доказана взаимосвязь между полиморфизмом генов, кодирующих метаболизм ксенобиотиков и/или ферменты системы детоксикации и риском/тяжестью симптомов или заболеваний.

При оценке данных клинико-лабораторных исследований обратило на себя внимание снижение показателей гемоглобина на 5-15 г/л практически у всех пациенток основной группы: среднее содержание гемоглобина составило 110±3 г/л (норма 120-140 г/л). Общее количество лейкоцитов в данной группе пациенток в 93% случаев приближалось к верхней границе нормы - среднее значение 8,4±0,6·10⁹/л (норма 4,0-9,0·10⁹л), а в лейкоцитарной формуле в 78% случаев отмечался незначительный сдвиг влево (палочкоядерные - 7,7±0,6%, сегментоядерные - 45,2±0,3%).

У 49 (94,2%) пациенток группы сравнения изменений в клиническом анализе крови не наблюдалось, у 2 (3,8%) - выявлена анемия легкой степени, у 1 (1,9%) - эозинофилия без увеличения общего количества лейкоцитов.

У всех пациенток исследуемой группы с целью выявления дисфункции в системе детоксикации проведена качественная и количественная оценка степени эндогенной интоксикации и показателей оксидативного стресса. Результаты исследования представлены в таблице.

Показатели СМ в основной группе и группе сравнения находились в пределах нормативных значений, но при сравнении между группами выявлены статистически значимые различия. В основной группе пациенток средний уровень СМ составил 0,24±0,05 усл.ед. при длине волны 254 нм и 0,28±0,04 усл.ед. в пуле 280 нм, что соответствует верхней границе нормы и по сравнению с пациентками без мутаций в гене NAT2 несколько выше, но без достоверных отличий при длине волны 254 нм (р>0,05) и достоверно выше в пуле 280 нм (р<0,05).

При оценке показателей ЭИ было отмечено, что у пациенток с точечными мутациями в гене NAT2 значение ЭИ254 и ЭИ280 составило 4,73±0,76 и 4,20±0,49 соответственно, что на 20,5 и 16% ниже, чем в группе сравнения (р>0,05). Эти результаты свидетельствуют о более высоком уровне эндогенной интоксикации у пациенток основной группы.

Показатели оксидантного и антиоксидантного статуса у пациенток обеих групп находились в пределах нормативных значений, при этом были выявлены статистически значимые различия между группами.

Анализ продуктов перекисного окисления - МА и системы антиоксидантной защиты организма (СОД и ОАО) в крови пациенток показал, что концентрация МА в основной группе достоверно выше, чем в группе сравнения (р<0,05), тогда как количество СОД и ОАО ниже в 1,5 и 1,7 раза соответственно.

Для оценки состояния оксидантного баланса нами было предложено рассчитать коэффициент, наглядно демонстрирующий соотношение про- и антиоксидантных факторов, - его получали путем деления абсолютного показателя СОД на показатель МА (СОД/МА). Нормативные значения были рассчитаны с учетом референсных границ и составили 378,5-496,3. Повышение этого показателя свидетельствовало об антиоксидантном сдвиге, понижение - о прооксидантном. Коэффициент оксидантного баланса составил в основной группе 250±30,6, в группе сравнения - 754±56,7 (р<0,05). Выявленные изменения оксидантного баланса демонстрируют наличие прооксидантного сдвига у пациенток с эндометриозом и полиморфизмом в гене NAT2, несмотря на то что все показатели оксидативного стресса в группах больных не выходят за пределы референсных значений.

Таким образом, у пациенток с точечными мутациями гена NAT2 было выявлено достоверное увеличение содержания молекул средней массы, снижение ЭИ и наличие прооксидантного сдвига, что указывает на изменения в системах естественной детоксикации и может играть роль в развитии таких заболеваний, как эндометриоз, о чем свидетельствуют также данные других исследователей [25].

По данным Environmental PerformanceIndex (EPI) 2012 г., Россия находится на 106-м месте из 132 стран по экологической обстановке в регионах. Общий индекс экологического здоровья нашей страны едва превышает 45%. При этом тенденции к улучшению экологии за последние годы не наблюдается, и в рейтинге стран, пытающихся изменить экологическую ситуацию, Россия находится на последнем месте. По данным мировых исследований [21, 22], в промышленно развитых странах (США, Бельгия, Израиль, Италия) частота встречаемости эндометриоза выше, чем в развивающихся странах. Эти данные также были подтверждены при экспериментальных исследованиях по изучению роли галогенизированных ароматических углеводородов в этиологии эндометриоза [4].

Кроме того, в последнее время проводятся исследования, посвященные изучению маркеров оксидативного стресса в фолликулярной жидкости и сыворотке крови у пациенток с бесплодием и эндометриозом, связанные с поиском механизмов, приводящих к снижению фертильности как при естественном зачатии, так и при использовании вспомогательных репродуктивных технологий и низкому качеству яйцеклеток. Показано снижение антиоксидантной активности у пациенток с бесплодием и эндометриозом, что влияет как на фолликулогенез, так и на качество ооцитов и эмбрионов [23]. Согласно данным литературы [24, 25], с одной стороны, оксидативный стресс влияет на активность ферментов, метаболизирующих ксенобиотики, с другой - изменение активности ацетилирования ксенобиотиков и токсинов приводит к увеличению оксидативного стресса.

Оксидантный-антиоксидантный статус и активность ферментов, метаболизирующих ксенобиотики, взаимосвязаны и могут меняться в зависимости от воздействия факторов внешней среды. Так, некоторые продукты могут влиять на их активность: полифенон-Б, содержащийся в черном чае, снижает вероятность развития рака молочной железы, влияя на активность систем ацетилирования, оксидантный статус, ангиогенез и пролиферацию [26]; экстракт полифенола, содержащийся в красном вине, активирует гены системы NAT2 [27].

Значительное повышение интенсивности свободнорадикального окисления при одновременном снижении активности антиоксидантной защиты приводит к увеличению токсичных продуктов перекисного окисления липидов, нарушающих свойства мембран, изменяющих ионную проницаемость, повреждающих биоэнергетические механизмы.

Изменения в работе многокомпонентной антиоксидантной системы и регуляции определенного уровня перекисного окисления липидов нарушают нормальное функционирование клеток, в том числе и эндометрия, что может явиться провоцирующим фактором в распространении и прогрессировании генитального эндометриоза [28-30]. Известно, что многие химические вещества (ртуть, мышьяк, кадмий, формальдегид) обладают эмбриотоксичностью, тератогенностью и оказывают влияние на репродуктивную функцию как у женщин, так и у мужчин [31-33].

Доказано, что эндоплазматическая сеть и транспортные системы в митохондриях и в ядре стромальных клеток эндометрия служат источниками активных форм кислорода. В железистых клетках в течение всего менструального цикла образуется СОД. По данным исследователей [34], она играет большую роль в децидуальной трансформации эндометрия под действием прогестерона, усиливающего ее активность.

Таким образом, тонкий баланс между антиоксидантной системой и оксидативным стрессом в эндометрии способствует прикреплению эмбриона, а на ранних сроках беременности поддерживает его развитие.

Сочетание этих факторов, очевидно, влияет не только на репродуктивную функцию женщины, но и на эффективность лечения бесплодия.

В связи с этим у 110 пациенток проведен анализ отдаленных результатов лечения бесплодия в зависимости от уровня эндогенной интоксикации и оксидативного стресса.

Среди незабеременевших пациенток у 53 (77,9%) были выявлены мутации в системе гена NAT2, что сочеталось с наиболее низкими показателями ЭИ254 и ЭИ280 (4,33±0,84 и 4,02±0,99 соответственно), высоким содержанием МА (4,9±0,91 мкмоль/л) и снижением содержания СОД [1131,3±55,37 (Е на 1 г Hb)]. Коэффициент оксидантного стресса, рассчитанный по формуле, представленной выше, составил 230,8±35,7, что достоверно ниже нормативных значений и свидетельствует о выраженном прооксидантном сдвиге.

Среди забеременевших пациенток всего у 15 (35,7%) пациенток был выявлен полиморфизм в гене NAT2, что существенно ниже по сравнению с незабеременевшими женщинами (р<0,05). При этом в данной группе больных достоверных отличий показателей ЭИ, МА и СОД от нормативных величин не выявлено. Значение коэффициента оксидативного стресса составило 380,5±60,7, что соответствовало референсным значениям. Не исключено, что в данном случае играют роль компенсаторные механизмы, либо благоприятные факторы внешней среды, позволяющие сохранять нормальную функцию антиоксидантной системы и систем детоксикации. В группе забеременевших пациенток без мутаций в гене NAT2 значения ЭИ254 и ЭИ280 в 1,2 и 1,3 раза выше, чем у женщин с мутациями.

При сравнении концентрации МА выявлено, что у незабеременевших женщин с мутациями в гене NAT2 его концентрация достоверно выше, тогда как уровень СОД и ОАО ниже почти в 1,7 раза по сравнению с забеременевшими пациентками с мутациями. Согласно данным зарубежных исследователей, СОД - антиоксидант «первой линии», влияющий на качество ооцитов (которое возможно оценить при проведении программ вспомогательных репродуктивных технологий - ВРТ). Клетки кумулюса яичника и фолликулярная жидкость обеспечивают защиту яичника от оксидативного повреждения, при этом СОД может рассматриваться как потенциальный маркер эффективности программ ВРТ. В женской репродуктивной системе активные формы кислорода и антиоксиданты играют важную физиологическую роль в процессах фолликулогенеза, роста ооцитов, регресса желтого тела и оплодотворения. Так, в ряде исследований [35] показано, что повышение уровня маркера оксидативного повреждения 8-гидроксил-2-деоксигуанозина в гранулезе и кумулюсе яичников связано с понижением способности ооцитов к оплодотворению, низким качеством эмбрионов и снижением вероятности имплантации.

Полученные в проведенном исследовании результаты совпадают с данными литературы [36], показывающими повышение показателей оксидативного стресса в сыворотке крови и фолликулярной жидкости у пациенток с бесплодием и эндометриозом, что отрицательно влияет на качество ооцитов при проведении программ ВРТ. Пациентки с высоким уровнем антиоксидантного статуса являются наиболее перспективными в отношении эффективности программ ВРТ [37].

Примечательны данные об изменениях состояния баланса про- и антиоксидантной системы в экстраэмбрионической мембране и эндометрии. Согласно результатам исследования K. Al-Guborky и соавт. [38], концентрация МА в карункулярной, интеркарункулярной и экстраэмбриональной ткани в эндометрии не изменяется с момента имплантации до 21 дня постимплантационного периода. Однако отмечено повышение содержания активности СОД и каталазы с 16-го до 21-го дня постимплантационного периода в карункулярной ткани [38]. Не исключено, что изменения про- и антиоксидантного баланса на системном уровне, выявленные в настоящем исследовании, сочетаются с локальными изменениями и влияют на вероятность имплантации, изменяя характеристики эндометрия.

Таким образом, проведенное исследование показывает, что группа пациенток с бесплодием и перитонеальной формой эндометриоза является неоднородной по состоянию системы детоксикации и про-, антиоксидантного баланса на системном уровне. Выявленные изменения взаимосвязаны с наличием или отсутствием точечных мутаций гена NAT2: при их наличии отмечено увеличение уровня эндогенной интоксикации и прооксидантный сдвиг. Данная когорта больных может иметь неблагоприятный прогноз в отношении частоты наступления маточной беременности после лечения.

Благодарность. Выражаем особую благодарность профессору, доктору медицинских наук В.А. Бурлеву за участие в обсуждении данной статьи, всестороннюю поддержку и весомый вклад в изучение патогенеза эндометриоза.