Болезнь Грейвса (БГ), или диффузный токсический зоб, — распространенное аутоиммунное поражение щитовидной железы, развивающееся у генетически предрасположенных лиц. БГ характеризуется тиреотоксикозом и присутствием в крови маркеров аутоиммунного процесса [1–3]. Ведущая роль в патогенезе аутоиммунного тиреотоксикоза отводится нарушениям регуляции иммунного ответа, а также дисбалансу в активации различных субпопуляций Т-хелперов: Th-1, Th-2, Th-17 [4, 5]. В развитии заболевания участвуют различные медиаторы иммунных реакций: интерлейкины, хемокины, факторы роста [6, 7]. Однако в целом природа и точная роль триггерных факторов остаются неизвестными.

В связи с этим интерес представляет оценка содержания иммунорегуляторных белков, влияющих на синтез и транспорт гормонов и цитокинов, а также активно участвующих в воспалительных и аутоиммунных процессах, контролирующих клеточную пролиферацию и апоптоз. К ним относятся α2-макроглобулин (α2-МГ) и лактоферрин (ЛФ). Первый является ингибитором протеиназ, высвобождающихся при воспалении, и транспортером гормонов и цитокинов; кроме того, α2-МГ участвует в распознавании и презентации инфекционных антигенов, регуляции пролиферации и апоптоза клеток, а также ремоделировании тканей [8]. ЛФ, обладающий выраженными антибактериальными и противовирусными свойствами, регулирует синтез цитокинов и является высокочувствительным маркером воспаления [9]. В литературе практически отсутствуют данные о роли вышеперечисленных белков в развитии БГ, а также о взаимосвязи их уровня с содержанием некоторых провоспалительных цитокинов и хемокинов при данной патологии.

Цель исследования — оценка содержания некоторых цитокинов (ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8 и ИФН-γ), а также а2-МГ и ЛФ в крови пациенток с БГ в стадии декомпенсации и после лечения.

Проведено открытое обсервационное одноцентровое когортное контролируемое нерандомизированное исследование, посвященное оценке уровня иммунорегуляторных белков и некоторых цитокинов в сыворотке крови пациенток (44,3±3,5 года) с верифицированной БГ до и после начала стандартного лечения тиамазолом [10]. Показатели исследовались на этапе клинической манифестации тиреотоксикоза (рецидив или впервые диагностированное заболевание), через 4–6 и 18–24 мес после начала лечения. В качестве контроля использовали пробы сывороток 25 здоровых женщин сопоставимого возраста.

Диагноз БГ основывался на характерной клинической картине, лабораторных показателях и данных УЗИ щитовидной железы. В исследовании участвовали пациентки с острой формой заболевания на момент первичного обследования, без тяжелой сопутствующей патологии. Все женщины подписывали информированное согласие на участие в исследовании. В исследовании не участвовали пациентки с тиреотоксикозом, обусловленным деструкцией тиреоидной ткани (тиреотоксическая фаза аутоиммунного тиреоидита, подострый тиреоидит, послеродовый тиреоидит, лучевой тиреоидит), с амиодарон-индуцированным тиреотоксикозом и тиреотоксикозом, вызванным избыточной продукцией ТТГ (ТТГ-продуцирующая аденома гипофиза или гипофизарная резистентность к тиреоидным гормонам), а также женщины с новообразованиями в щитовидной железе неуточненной этиологии и обострениями сопутствующих заболеваний, способных исказить клиническую картину и иммунологический профиль.

Исследование проводилось на базе эндокринологического отделения и поликлиники № 1 МБЛПУ «Городская клиническая больница № 1» Новокузнецка. Лабораторные показатели определялись в НИЛ иммунологии НГИУВ — филиала ФГБОУ РМАНПО.

Исследование проводилось в течение 3 лет (в период с 2015 по 2017 г.). Пробы сыворотки получали при первичном обследовании (острая стадия БГ), на фоне лечения (через 4–6 мес), а также через 1,5–2 года после назначения лечения.

Терапия БГ проводилась в соответствии с клиническими рекомендациями по диагностике и лечению тиреотоксикоза [10]. Тиамазол назначали в дозе 20–30 мг/сут; дозу постепенно снижали до поддерживающей 10–15 мг/сут. Эутиреоидное состояние достигалось через 4–6 мес. В течение 1,5–2 лет 28 (56%) пациенток получали монотерапию тиамазолом, а 22 (44%) — 10–15 мг/сут тиамазола и 50–75 мкг/сут левотироксина (схема «блокируй и замещай»). Адекватность определялась клинически эутиреоидным состоянием пациенток, мониторированием уровней свободного Т4 и ТТГ каждые 2–3 мес и антител к рецептору ТТГ каждые 6 мес. В сыворотке определяли содержание иммунорегуляторных белков (α2-МГ и ЛФ), цитокинов (ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8 и ИФН-γ) и АТ-рТТГ. Пробы крови получали на каждом из 3 запланированных этапов обследования, сыворотку отделяли центрифугированием, замораживали и хранили при –20 °С до одновременного исследования всех образцов.

Основной конечной точкой исследования была концентрация цитокинов ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-γ и иммунорегуляторных белков α2-МГ и ЛФ у пациенток с БГ до и после лечения тиреотоксикоза.

Дополнительными конечными точками были показатели функциональной активности щитовидной железы — уровни ТТГ, свободного Т4 и АТ-рТТГ.

Разделения больных на подгруппы в зависимости от пола, возраста, степени тяжести и схемы лечения не проводилось.

Концентрацию α2-МГ определяли методом количественного низковольтного иммуноэлектрофореза в пластинах агарозного геля с использованием специфических тест-систем (НИЛ иммунологии НГИУВ — филиал ФГБОУ РМАНПО, Россия).

Уровни ЛФ, ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-γ, ТТГ и свободного Т4 определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) при помощи соответствующих тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Содержание АТ-рТТГ оценивали методом ИФА с использованием диагностического набора Roche diagnostics (Швейцария).

Протокол исследований был одобрен локальным этическим комитетом НГИУВ — филиала ФГБОУ РМАНПО (№ 1 от 26.01.15).

Принципы расчета размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных: проверка нормальности распределения признаков осуществлялась с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. В зависимости от результатов проверки проводилось парное межгрупповое сравнение показателей методами параметрической (по Стьюденту) либо непараметрической статистики. а) Для анализа результатов исследования при нормальном распределении применен пакет статистических программ InStat-II («GraphPad», США), использовался критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони при сравнении результатов контрольной группы (здоровые) с больными и парный t-критерий Стьюдента при сравнении данных внутри группы больных (разные сроки исследования); количественные данные представлены как M±m; б) при анализе уровней АТ-рТТГ использовали непараметрический критерий Краскела–Уоллиса с применением критерия множественных сравнений Дана; в) оценка наличия клинических признаков болезни проводилась непараметрическими критериями χ² и Краскела—Уоллиса.

Группа БГ включала 30 (60%) женщин с впервые установленным диагнозом и 20 (40%) — с рецидивом заболевания, развившимся у 16 пациенток через 1–3 года после отмены медикаментозного лечения продолжительностью не меньше 1–2 лет; у 4 пациенток рецидив тиреотоксикоза был связан с прекращением приема тиамазола спустя 3–8 мес от начала терапии. В дебюте заболевания и при рецидиве тиреотоксикоза у 42 (84%) пациенток отмечалось снижение массы тела на 4–13 кг; практически у всех была постоянная синусовая тахикардия, у 9 (18%) — пароксизмальная мерцательная аритмия, подтвержденная ЭКГ; у 40 (80%) — преимущественно систолическая артериальная гипертензия с увеличением пульсового давления; у 12% больных выявлялась эндокринная офтальмопатия; у всех имелись неврологические проявления в виде стойкой общей слабости, раздражительности, нарушения сна и в единичных случаях — нарушение менструальной функции и неустойчивый стул. Достижение эутиреоидного состояния через 4–6 мес и к 1,5–2 годам после начала терапии подтверждено статистически (р>0,05).

При первичном обследовании пациенток клинический диагноз тиреотоксикоза был подтвержден соответствующими изменениями уровней ТТГ и свободного Т4 в сыворотке (см. таблицу).

Концентрация α2-МГ в стадии декомпенсации (до начала лечения) статистически значимо превышала контроль. Уже через 4–6 мес лечения уровень этого белка снизился до контрольных значений и оставался неизменным в течение 1,5–2 лет (cм. таблицу). Содержание Л.Ф. также было повышено при манифестации тиреотоксикоза. Терапия в течение 4–6 мес практически не меняла его уровня. Снижение до нормальных показателей отмечалось только к 1,5–2 годам лечения.

Уровень ИЛ-8, синтез которого связан с синтезом ЛФ, превышал контрольные показатели в десятки раз не только в стадии манифестации, но и через 6 мес лечения. Содержание ФНО-α при ДТЗ не отличалось от такового в контрольной группе ни при манифестации тиреотоксикоза, ни через 1,5–2 года после начала лечения. Концентрация ИЛ-6 была существенно повышена при БГ в стадии декомпенсации. На фоне лечения через 4–6 мес его уровень снижался в 3 раза, но достигал контрольных значений только через 1,5–2 года. Содержание ИФН-γ оставалось значимо повышенным независимо от длительности лечения.

Уровень АТ-рТТГ имел тенденцию к снижению на промежуточном этапе терапии и значимо уменьшался через 1,5–2 года терапии, хотя и не достигал концентрации в контрольной группе.

Таким образом, несмотря на достижение эутиреоидного состояния к первым 4–6 мес лечения, нормализация иммунорегуляторных показателей (за исключением ИФН-γ) происходила только к 1,5–2 годам после начала лечения.

Нежелательных явлений в процессе работы отмечено не было.

В дебюте БГ отмечены несбалансированная гиперцитокинемия (увеличение в крови концентрации ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-γ) и ее прямая связь с изменениями содержания иммунорегуляторных белков (α2-МГ, ЛФ). Через 4–6 мес лечения тиамазолом с достижением эутиреоидного состояния наблюдается трехкратное снижение уровня ИЛ-6, однако его полной нормализации не происходит. Уровень ИФН-γ не менялся, а концентрация ФНО-α статистически значимо повышалась (без превышения максимальных референсных значений); содержание АТ-рТТГ также возрастало.

Особенность аутоиммунного воспаления щитовидной железы заключается в том, что фолликулярный эпителий не только отвечает на действие цитокинов, источниками которых являются моноциты и лимфоциты, мигрирующие в железу из сосудистого русла, но и сам продуцирует ряд цитокинов и хемокинов. Доказано, что тиреоциты способны синтезировать ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-α, TGF-β, CXCL-19, CXCL-10 и RANTES [11, 12]. Рецептор CXCR3 экспрессируется в больших концентрациях на лимфоцитах и эндотелиальных клетках, что определяет формирование лимфоидной инфильтрации щитовидной железы. Клинические исследования показывают увеличение уровня сывороточного CXCL-10 при БГ [13]. ИЛ-1, ИФН-γ и ФНО-α стимулируют in vitro продукцию цитокинов фолликулярными клетками щитовидной железы, что может способствовать ее лимфоидной инфильтрации. Кроме того, цитокины повышают экспрессию молекул адгезии на тиреоцитах, продукцию оксида азота и простагландинов этими клетками, дополнительно активируя воспалительные реакции [11]. Высокие концентрации ИЛ-8 и тенденция к увеличению ФНО-α через 4–6 мес лечения отражают продолжающуюся инфильтрацию железы, что отмечено и другими исследователями [7]. В последние годы активно обсуждается роль хемокинов CXCL-9 и CXCL-11, синтез которых активируется ИФН-γ [7]. Эти хемокины связаны с активной фазой болезни. Лечение Б.Г. сопровождается снижением их уровня. Поскольку ИФН-γ является индуктором их синтеза, его высокая концентрация как на промежуточном этапе лечения, так и через 1,5–2 года свидетельствует о высокой активности эффекторной фазы иммунного ответа и является одним из основных факторов, определяющих прогрессирование патологического процесса.

Аутоиммунные заболевания щитовидной железы сопровождаются лимфоидной инфильтрацией тимуса, синтезом различных аутоантител, деструкцией и апоптозом тимоцитов [2, 3]. Известно, что цитотоксический эффект в значительной степени опосредован присутствующими в большом количестве в пораженной щитовидной железе Тh-1-лимфоцитами, активно продуцирующими ФНО-α и особенно ИФН-γ [5]. Избыток ИФН-γ индуцирует экспрессию МНС-II, синтез хемокинов и экспрессию молекул адгезии, способствует экспансии Т- и В-лимфоцитов и макрофагов в тимус, поддерживает развитие аутоиммунных процессов и стимулирует апоптоз тимоцитов [3]. Полученные нами результаты (значительное повышение уровня хемокина ИЛ-8) согласуются с вышеприведенными данными. Несколько меньший вклад в патогенез БГ вносят такие индукторы воспаления и аутоиммунных процессов, как ФНО-α и ИЛ-6. Предполагается, что именно усиленный синтез провоспалительных цитокинов в ответ на инфекционный агент является одним из триггерных механизмов аутоиммунной патологии щитовидной железы [3]. Однако in vitro показана блокада как спонтанной, так и митогенстимулированной секреции ФНО-α лимфоцитами при БГ [14]. Выявленный нами в крови больных относительно низкий уровень провоспалительного ФНО-α подтверждает ранее опубликованные данные о блоке синтеза данного цитокина. Мы не наблюдали полной нормализации уровней ИФН-γ и ИЛ-6 в крови через 4–6 мес лечения, а уровня ИФН-γ и через 1,5–2 года терапии. Это говорит о том, что тимазол, купируя клинические проявления БГ, не устраняет триггерных факторов патогенеза заболевания.

Параллельное повышение уровня острофазовых белков на стадии манифестации БГ (при том, что α2-МГ — негативный реактант воспаления, а ЛФ — позитивный) дополнительно свидетельствует о том, что маркеры воспалительной реакции реагируют на аутоиммунный компонент заболевания, что приводит к дисбалансу различных факторов.

Исходя из полученных результатов и данных литературы, можно предположить, что повышение протеазной активности при воспалении и деструктивных процессах приводит к высвобождению ИЛ-8 и ИЛ-6 из мембран клеток. При этом первый стимулирует синтез ЛФ, а второй — α2-МГ. Избыток ИЛ-6 подавляет синтез ФНО-α. Повышенный уровень ЛФ усиливает воспалительный ответ, особенно на фоне дефицита железа, характерного для патологии щитовидной железы [15]. Продукты воспалительной реакции способны окислять молекулы α2-МГ, что приводит к активному выведению ФНО-α из циркуляции, дисрегуляции синтеза и транспорта цитокинов (приводящей к накоплению ИФН-γ), а также к появлению дефектных иммуногенных молекул α2-МГ, формированию иммунокомплексов с аутоантителами и их накоплению в циркуляции [16]. Кроме того, ИФН-γ блокирует основной клеточный рецептор эндоцитоза — LRP [17], поэтому повышенный уровень данного цитокина может нарушать утилизацию белков и способствовать их накоплению в крови. Учитывая вышеизложенное, можно предположить, что чем выше содержание ЛФ и α2-МГ при БГ и чем медленнее их уровни нормализуются при лечении, тем выше вероятность рецидива заболевания.

Ограничение проведенного исследования определялось 3-летним периодом наблюдения, за который у пациенток с болезнью Грейвса достигнуто состояние стойкой компенсации заболевания. Полученные данные недостаточны для их экстраполяции на всю генеральную совокупность.

При первично выявленной или рецидивирующей болезни Грейвса повышена концентрация цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8 и ИФН-γ), а также иммунорегуляторных белков α2-МГ, ЛФ в сыворотке. Через 4–6 мес лечения на фоне нормализации гормонального статуса уровни α2-МГ и ИЛ-6 снижались, но концентрации ЛФ и ИФН-γ оставались повышенными. Лечение Б.Г. в течение 1,5–2 лет приводило к нормализации всех изученных показателей, за исключением концентрации ИФН-γ и уровня АТ-рТТГ. Высокое содержание иммунорегуляторных белков (α2-МГ и ЛФ) наряду с характерной для аутоиммунных тиреопатий цитокинемией свидетельствует о дисфункции иммунной системы при ДТЗ и диктует необходимость дальнейших исследований в этом направлении.

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке НИР НГИУВ — филиала ФГБОУ РМАНПО, Россия.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: Концепция и дизайн исследования — Маклакова Т.П.; статистическая обработка данных и создание авторских тест-систем — Зорина В.Н., Зорин Н.А.; написание текста — Маклакова Т.П., Зорина В.Н.; редактирование — Зорин Н.А. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Благодарности. Авторы выносят благодарность врачам-ординаторам Янышевой А.В. и Мезенцевой Е.В. за помощь в наборе клинического материала.

Сведения об авторах

*Маклакова Татьяна Петровна, д.м.н., профессор [Tatjana P. Maklakova, PhD, MD, Professor]; +7 (3843) 458418; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8790-9337; eLibrary SPIN: 9314-5582; e-mail: maclacovatat@yandex.ru

Зорина Вероника Николаевна, д.б.н. [Veronika N. Zorina, PhD, MD]; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9183-7663; eLibrary SPIN: 1630-1716; e-mail: nilimmun@.yandex.ru

Янышева Анна Владимировна [Anna V. Yanysheva, MD]; e-mail: Anna-nik_06@mail.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6982-9058

Мезенцева Екатерина Вадимовна [Ekaterina V. Mezentseva, MD]; e-mail: perinatal_nk@mail.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5770-1348

Зорин Николай Алексеевич, д.б.н., профессор [Nikolay A. Zorin, PhD, Professor]; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4865-5826; eLibrary SPIN: 4223-0819; e-mail: macroglobulin@.yandex.ru.