Снижение рождаемости в развитых странах — одна из важнейших современных социально-экономических проблем [1]. По данным российских исследователей [2, 3], бесплодны от 8 до 18% супружеских пар репродуктивного возраста. Мужской фактор является причиной бесплодия в браке не менее чем в 50% случаев, а в 20—30% случаев имеется сочетание мужского и женского факторов [4].

Мужское бесплодие может быть следствием различных эндокринных, генетических, иммунологических, инфекционных, психологических и других факторов. Основными причинами эндокринного бесплодия у мужчин считаются заболевания гипоталамо-гипофизарной области: нарушение секреции гонадотропных гормонов приводит к угнетению сперматогенеза. Не исключено и негативное влияние избыточной массы тела и ожирения на мужскую репродуктивную систему [5, 6]. В мире за последние 30 лет число страдающих ожирением мужчин репродуктивного возраста увеличилось в 3 раза, что, по мнению ряда авторов [1, 7, 8], является причиной ухудшения семиологических показателей и возрастания частоты мужского бесплодия.

Современный семиологический анализ, спермограмма, — это начальный и основной тест, позволяющий выявить радикальные формы спермальной дисфункции, такие как азооспермия (полное отсутствие сперматозоидов в эякуляте), криптозооспермия (единичные сперматозоиды в эякуляте после центрифугирования) и тяжелая олигоастенотератозооспермия (снижение концентрации, двигательной активности и числа морфологически нормальных сперматозоидов). Вместе с тем примерно у 15% мужчин, страдающих бесплодием в браке, сохраняется нормальная концентрация и морфология сперматозоидов, а также достаточное количество прогрессивно подвижных гамет [9].

Оценка морфологии мужской половой клетки под световым микроскопом не позволяет визуализировать состояние ее внутренних структур (например, целостность ДНК, степень компактизации хроматина, наличие нормальной проксимальной центриоли и т. п.). Это заставляет искать новые способы диагностики причин мужского бесплодия [10].

Геном сперматозоида имеет две особенности, которые отличают его от генома соматических клеток: протаминирование ДНК и неспособность ДНК к репарации. ДНК мужской половой клетки сверхскомпактизирована с помощью протаминов — основных белков небольшой молекулярной массы, богатых аргинином. Такая сверхспирализация ДНК обеспечивает стабильность, транскрипционную инертность и защиту отцовского генома при перемещении по половым путям мужчины и женщины. Способность к репарации ДНК, как и процессы транскрипции и трансляции, теряются на конечной стадии сперматогенеза (спермиогенез), когда сперматиды превращаются в зрелые сперматозоиды.

Таким образом, сперматозоиды лишены способности исправлять повреждения, полученные в период пребывания в эпидидимисе и после эякуляции [11]. Изменения структуры ДНК приводят не только к невозможности оплодотворения и нормального развития эмбриона в преимплантационном периоде, но и к нарушению имплантации и преждевременному прерыванию беременности на ранних сроках гестации [12—15].

Фрагментация ДНК сперматозоидов — относительно недавно идентифицированная причина мужской инфертильности. Степень повреждения ДНК — индекс фрагментации (ИФ) — рассчитывают как отношение числа сперматозоидов с поврежденной ДНК на 100 исследуемых сперматозоидов. При И.Ф. 25—30% потенциал наступления спонтанной беременности считается удовлетворительным, при ИФ 15—24% — хорошим, при ИФ <15% — высоким [15, 16]. В случае ИФ >30% вероятность наступления беременности (как спонтанной, так и в результате ЭКО) крайне низка [17, 18]. Высокие показатели фрагментации ДНК сперматозоидов выявляются у 25,6% пациентов с бесплодием [19].

Программы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) помогают преодолеть большинство форм патологии эякулята и сперматозоида, таких как снижение количества (олигозооспермия) и подвижности (астенозооспермия) клеток, наличие антиспермальных антител, нарушение вязкости эякулята. Однако нарушения ультраструктуры сперматозоида оста. тся на сегодняшний день нерешенной проблемой. Имеются сообщения о том, что при повышенном ИФ ДНК риск невынашивания беременности в программах ЭКО (особенно при интрацитоплазматической инъекции единичного сперматозоида в яйцеклетку, ИКСИ) возрастает в 4 раза [9].

Патофизиологические механизмы, ведущие к фрагментации ДНК сперматозоидов, недостаточно ясны. Известно, что причиной повышения ИФ ДНК могут быть внешние условия (особенно актуальные при ЭКО), такие как время, прошедшее после эякуляции и температура хранения эякулята [11]. Менее изучена роль эндогенных факторов, воздействующих на мужские половые клетки, на протяжении сперматогенеза (рис. 1).

К основным формам повреждения ДНК сперматозоидов относятся разрывы одной или двух цепей ДНК, модификация оснований, присоединение лишних оснований, димеризация пиримидина, окисление. В ответ на повреждение ДНК происходит ее репарация, арест клеточного цикла, апоптоз, мутации de novo, нарушается ответ на стресс.

Одним из негативных внутренних факторов, по мнению C. Dupont и соавт., является ожирение, что, соответственно, и может приводить к той или иной форме мужского бесплодия [20].

На протяжении последних десятилетий во всем мире отмечается прогрессивное ухудшение семиологических показателей. Количество сперматозоидов в эякуляте у американских мужчин репродуктивного возраста ежегодно уменьшается на 1,5%. Подобная тенденция наблюдается в Европе и Австралии [21]. Отмечается также увеличение числа супружеских пар, обращающихся за ЭКО по поводу мужского фактора бесплодия [7, 8]. Все больше данных свидетельствует о том, что на фертильность мужчин негативно влияет ожирение, однако механизмы, посредством которых избыток жировой ткани воздействует на мужскую репродуктивную систему, мало изучены.

Жировая ткань способна не только конверсировать андрогены в эстрогены, но и секретировать множество биологически активных веществ (адипокинов), регулирующих работу гипоталамо-гипофизарно-яичковой оси и влияющих на сперматогенез. Изменения концентрации адипокинов при ожирении могут влиять на репродуктивную систему мужчины как непосредственно, так и в результате формирования инсулинорезистентности, которая выявляется у 50% мужчин с нарушением жирового обмена [22].

В формировании инсулинорезистентности важную роль играют лептин, адипонектин и резистин; высокие концентрации провоспалительных цитокинов ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8 и С-реактивного белка (С-РБ) обусловливают характерное для ожирения состояние хронического воспаления и оксидативного стресса [1]. Оксидативный стресс приводит к увеличению одно- и двуцепочечных разрывов хроматина в головке сперматозоида, ослаблению акросомальной реакции, что в свою очередь снижает частоту оплодотворения (fertility rate — FR), вероятность имплантации эмбрионов (implantation rate, IR) и наступления беременности (pregnancy rate — PR) в программах ЭКО [23, 24]. С увеличением ИФ ДНК сперматозоидов частота эмбрионов с патологическим количеством пронуклеусов (>2) возрастает с 8 до 20% случаев [25, 26].

T. Jensen и соавт. при обследовании 1558 молодых мужчин в возрасте 18—21 года с ИМТ 25 кг/м² и более выявили снижение концентрации и общего количества сперматозоидов в эякуляте на 21,6 и 23,9% соответственно по сравнению с мужчинами с нормальным ИМТ. Количество морфологически нормальных сперматозоидов при ИМТ 25 кг/м² и более также было снижено [1]. C. Dupont и соавт. в исследовании с участием 3030 бесплодных мужчин (средний возраст 37,6±6,2 года, средний ИМТ 25,8±4,0 кг/м²) нашли, что количество повреждений ДНК сперматозоидов, выявляемых методом TUNEL, у пациентов с ожирением было в 3,9 выше, чем у мужчин с нормальным ИМТ [27]. При использовании метода COMET была выявлена положительная зависимость между нарушением жирового обмена и числом сперматозоидов с фрагментацией ДНК [28]. В других работах связь между ожирением у мужчины и ухудшением макроскопических показателей эякулята, а также числом повреждений ДНК не нашла подтверждения [29].

Важно отметить, что среди детей, рожденных от мужчин с ожирением, возрастает частота ожирения, сахарного диабета (СД), нарушений репродуктивной функции, а также аутизма [30].

Для выявления нарушения структуры ДНК сперматозоидов применяются прямые и непрямые методы.

С помощью прямых методов выявляют уже имеющиеся поломки ДНК; непрямые методы позволяют оценить подверженность спермальной ДНК повреждениям после внешнего воздействия, например добавления уксусной кислоты. Наиболее широко используемыми прямыми методами являются TUNEL, NT, COMET [31].

В основе метода TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated Nick End Labeling) лежит присоединение флюоресцентномеченых нуклеотидов к 3’-гидроксильному концу фрагмента разрушенной ДНК. Визуализация встроенных фрагментов возможна с помощью люминисцентного микроскопа и проточной цитометрии. При NT (ник-трансляции, In-Situ Nick Translation assay) к 3’-гидроксильному концу ДНК присоединяются радиоактивные нуклеотидные остатки [31—33].

Метод СOMET (Single Cell Gel Electrophoresis) предполагает обработку сперматозоидов лизирующими растворами для экстракции белков, после чего проводят электрофорез депротеинизированных нуклеоидов, в ходе которого нити ДНК мигрируют к аноду. Получаемая картина напоминает комету с головой и хвостом. Голова кометы состоит из высокомолекулярной ДНК, хвост — из низкомолекулярной, образовавшейся в результате разрывов ДНК. Полученные «кометы» окрашивают флюоресцентным красителем. Чем выше уровень фрагментации, тем большее количество ДНК при электрофорезе будет располагаться в зоне хвоста кометы [31—34].

К наиболее известным непрямым методам диагностики разрывов ДНК относятся SCD, AO, SCSA, DBD-FISH. При SCD (Sperm Chromatin Dispertion test, Halo Sperm) сперматозоиды обрабатывают вначале раствором кислоты, затем лизирующим буфером, что приводит к удалению большинства ядерных белков. В результате происходит деспирализация ДНК, при этом цельные нити нефрагментированной ДНК демонстрирует массивный, хорошо визуализирующийся ореол дисперсии («halo-эффект») в отличие от фрагментированных цепочек, образующих минимальный ореол. Метод окраски акридином оранжевым (AO, Acridine Orange test) основан на различной чувствительности фрагментированной и интактной ДНК к кислотной денатурации. Высушенные на воздухе мазки эякулята фиксируются в растворе метанол—уксусная кислота и окрашиваются акридином оранжевым (флюорохром). Под воздействием ультрафиолетового излучения флюорохром флюоресценцирует зеленым светом, когда он связан с двухцепочечной ДНК, и испускает красную флюоресценцию в сперматозоидах с денатурированной, одноцепочечной ДНК. Исследование SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) сходно с AO, но благодаря применению проточной цитометрии после окрашивания дает лучшие результаты. В ходе теста DBD-FISH (DNA Break Detection-Fluorescence In Situ Hybridization) сперматозоиды вначале обрабатываются щелочным раствором, который разрушает белки и деспирализует ДНК, а затем средой, содержащей флюоресцентно-меченые ДНК-зонды. Зонды связываются с одноцепочечной ДНК. Чем выше степень фрагментации ДНК, тем больше образуется одноцепочечных фрагментов и тем выше степень фрагментации [31, 32, 35—37].

Цель настоящего исследования — оценка связи между имт мужчин репродуктивного возраста, параметрами спермограммы, ИФ ДНК сперматозоидов, а также в изучении влияния имт на исходы программ ЭКО и ЭКО/ИКСИ.

В исследование включен 191 пациент (в возрасте от 25 до 45 лет) из обратившихся в отделение ВРТ ФГБУ ЭНЦ М.З. России за период с апреля 2013 г. по апрель 2014 г. с жалобами на отсутствие наступления беременности в браке при регулярной половой жизни без использования методов контрацепции. Средняя продолжительность бесплодного брака составила 6,1±3,2 года [2—15]. Лечение бесплодия проводилось стандартным методом ЭКО, а также у 83 пациентов микрохирургическим методом оплодотворения путем интрацитоплазматической инъекции единичного сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИКСИ). Пациенты были разделены на группы в зависимости от ИМТ. Пациенты 1-й группы имели нормальный ИМТ (18—24,9 кг/м²), 2-й группы — избыточную массу тела (ИМТ =25—29,9 кг/м²), в 3-ю группу — пациенты с ожирением (ИМТ 30 кг/м² и более).

При обследовании у всех пациентов проводили семиологический анализ с оценкой по критериям ВОЗ (2010 г.); оценка морфологии сперматозоидов проводилась по строгим критериям Крюгера на предокрашенных стеклах фирмы Cell-uv.

Для определения фрагментации ДНК был использован метод АО в силу его низкой себестоимости, простой техники исполнения, наличия доступного лабораторного оборудования и высокой степени информативности. Исследовали 1,0 мл разжиженного эякулята, который центрифугировали с 9,0 мл физиологического раствора в течение 20 мин при скорости 300 g. Супернатант удаляли, из суспендированного осадка готовили мазок. После высушивания на воздухе в течение 10 мин при комнатной температуре мазок погружали в раствор метанол—уксусная кислота в соотношении 3:1 на 5 мин. Высушенный фиксированный мазок окрашивался АО в течение 3 мин. Затем препарат промывали дистиллированной водой и обезвоживали в течение 1 мин в 70% растворе этанола. После высушивания препарата оценивали ИФ ДНК. Для визуализации сперматозоидов использовался флюоресцентный микроскоп Olympus BX51 c 600-кратным увеличением. Подсчет И.Ф. ДНК проводился по формуле: число клеток с фрагментированной ДНК, деленное на 100 проанализированных сперматозоидов.

Эффективность лечения бесплодия в программах ЭКО и ЭКО/ИКСИ определяли по частоте наступления клинической беременности (визуализация плодного яйца на 21-й день после переноса эмбриона в полость матки) из расчета на перенос эмбрионов (pregnancy rate, embryo transfer, РR/ET); использовали формулу:

Определяли также частоту репродуктивных потерь, включающих биохимические беременности (положительный результат анализа крови на β-чХГ без УЗ-визуализации плодного яйца в полости матки), внематочные беременности, самопроизвольное прерывание и замершие беременности (miscarriage rate, MR%). Кроме того, для каждой группы пациентов рассчитывали коэффициент рождения живых здоровых детей — «Тake home baby» (THB) — по формуле:

В 1-ю группу был включен 61 (32%) пациент, во 2-ю группу — 92 (48%) пациента и в 3-ю группу (ожирение) — 38 (20%) (рис. 2).

Средний возраст пациентов по группам составлял 33,2±4,9 года (колебания 25—47 лет); 36,0±5,1 (24—47) и 35,3±5,6 (27—59) года соответственно.

Среди пациентов с нормальным ИМТ нормозооспермия была выявлена у 30 (49,2%) мужчин. Олигоастенотератозооспермию (ОАТ) диагностировали у 12 (19,7%) мужчин. Снижение только концентрации сперматозоидов, или их подвижности, или одновременное ухудшение обоих показателей (олигоспермия/астенозооспермия/олигоастенозооспермия, О/А/ОА) было выявлено у 6 (9,8%) пациентов. Тератозооспермия (Т), характеризующаяся уменьшением числа сперматозоидов с нормальной морфологией, обнаружена у 13 (21,3%) мужчин (рис. 3).

В группе пациентов с избыточной массой тела (2-я группа) нормозооспермия была диагностирована у 49 (53,2%) мужчин; ОАТ, О/А/ОА и Т — у 21, 7 и 15 пациентов (22,8, 7,7 и 16,3% соответственно) (рис. 4).

Среди пациентов с ожирением нормозооспермию выявили у 16 (42,1%) мужчин. ОАТ была диагностирована у 12 пациентов; О/А/ОА и Т — у 4 и 6 мужчин соответственно (31,6, 10,5 и 15,8%) (рис. 5).

После проведения семиологического анализа эякулята всем пациентам было выполнено исследование уровня фрагментации ДНК сперматозоидов методом АО.

Среди пациентов 1-й группы ИФ ДНК сперматозоидов был нормальным (менее 30%) у 21 (34,5%) мужчины и высоким (30% и более) у 40 (65,5%). У 2 (3,3%) пациентов ИФ был менее 15%, у 19 (31,2%) — находился в пределах 15—30%. Среди пациентов этой группы с высоким ИФ у 3 (4,9%) мужчин этот показатель достигал 80,1—100%, у 10 (16,4%) ИФ находился в пределах 50,1—80% и у 27 (44,2%) — в пределах 30,1—50% (рис. 6).

Во 2-й группе (пациенты с избыточной массой тела) отмечалось уменьшение числа мужчин с ИФ ДНК 30% и менее (26 пациентов, 28,3%); при этом у 66 (71,7%) пациентов показатель повреждения ДНК превышал 30%. ИФ <5% был выявлен у 3 (3,3%) мужчин этой группы, у 23 (25%) его величина находилась в пределах 15—30%, у 39 (42,4%) — в 30,1—50%, у 22 (23,9%) — в 50,1—80% и у 5 (5,4%) — в 80,1—100% (рис. 7).

В 3-й группе лишь у 4 (10,5%) мужчин показатели повреждения ДНК не превышали 30%; у 34 (89,5%) ИФ ДНК сперматозоидов был высоким. Ни у одного из обследованных этой группы ИФ не был менее 15%. У 4 (10,5%) он находился в пределах 15—30%, у 12 (31,6%) — в 30,1—50%, у 20 (52,6%) — в 50,1—80% и у 2 (5,3%) — в 80,1—100% (рис. 8).

Таким образом, отмечается явная тенденция к увеличению числа мужчин с высоким ИФ ДНК сперматозоидов среди пациентов с избыточной массой тела и ожирением.

Выбор способа оплодотворения (стандартный метод ЭКО или ИКСИ) зависел от параметров эякулята на день проведения пункции фолликулов, количества полученных ооцитов (в случае, если было получено менее 5—7 яйцеклеток, применялось ИКСИ) и предыдущих протоколов ЭКО (если показатели оплодотворения при стандартном ЭКО были 50% и менее, проводили ИКСИ), а также уровня ИФ ДНК сперматозоидов.

В группе пациентов с нормальным ИМТ оплодотворение стандартным методом ЭКО было проведено сперматозоидами 5 (17,9%) пациентов с нормозооспермией, метод ИКСИ был применен у 23 (82,1%). Беременность наступила у 9 пациенток (PR=32,1%) и закончилась родами у 6 (THB =66,7%). У 2 (22,2%) женщин произошло самопроизвольное прерывание беременности на сроке 5 и 9 нед соответственно; у 1 (11,1%) пациентки была диагностирована замершая беременность на сроке 7 нед. Среди пациенток данной группы ни у одной не было отмечено биохимической и внематочной беременностей. Таким образом, MR составил 33,3%.

В парах, где у партнера имелся избыток массы тела, ЭКО проводили эякулятом 8 (19,5%) пациентов. ИКСИ использовали в 80,5% случаев (33 пациента). Беременность наступила у 15 пациенток (PR=36,6%); у 13 беременность закончилась родами (THB=86,7%). У 2 (13,3%) пациенток была диагностирована замершая беременность на сроке 7 и 8 нед. Биохимическая беременность зарегистрирована у 6 (14,6%) пациенток. В данной группе отсутствовали внематочные беременности и самопроизвольные прерывания беременности. Таким образом, MR составил 27,9%.

В группе пациентов с ожирением (n=14) ЭКО было проведено сперматозоидами лишь 1 (7,1%) пациенту с Т, у которого концентрация и подвижность гамет были достаточными. Микрохирургическая техника оплодотворения использовалась в 92,9% случаев (13 пациентов). Беременность наступила у 3 пациенток и у всех закончилась родами (PR=ТНВ=21,4%). Биохимическая беременность регистрировалась у 4 (28,6%) пациенток. Замерших, внематочных и самопроизвольных прерываний не было выявлено ни у одной пациентки. MR составил 28,6%.

Проведенное исследование не выявило отчетливого влияния ИМТ мужчины на параметры эякулята: среди пациентов 1-й, 2-й и 3-й групп доля мужчин с различными формами патозооспермии была примерно одинаковой. Однако с увеличением ИМТ отмечается возрастание в эякуляте числа сперматозоидов с фрагментированной ДНК (r=0,656): у пациентов 2-й и 3-й группы обнаружено статистически значимое увеличение числа сперматозоидов с поврежденной ДНК (р=0,0159 и р=0,03 соответственно). С увеличением ИМТ партнера отмечалось также снижение частоты наступления клинической беременности; возрастала доля биохимических беременностей и увеличивалась частота репродуктивных потерь. Таким образом, избыточная масса тела и ожирение у мужчин, даже при нормальных показателях спермограммы, является самостоятельным фактором риска бесплодия и неэффективного лечения супружеской пары в программах ЭКО.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Витязева И.И., Трошина Е.А., Алташина М.В.

Сбор и обработка материала — Алташина М.В., Мун Т.В.

Статистическая обработка данных — Витязева И.И., Алташина М.В.

Написание текста — Витязева И.И., Алташина М.В., Мун Т.В., Трошина Е.А..

Редактирование — Витязева И.И., Трошина Е.А..