- Издательство «Медиа Сфера»
Среди хронических неинфекционных заболеваний патология щитовидной железы (ЩЖ) занимает одно из первых мест по заболеваемости и территориальной распространенности [1—3]. В структуре заболеваний ЩЖ аутоиммунным тиреопатиям (АИТП) принадлежит одно из ведущих мест. Согласно данным последних исследований [4], АИТП — сложные полигенные болезни, развитие которых определяется множеством генетических, эндогенных и экзогенных факторов.
В последние годы активно изучается способность иммунной системы влиять на функциональное состояние ЩЖ [5—7]. Установлена, в частности, способность провоспалительных лимфо- и монокинов оказывать прямое воздействие на гормональную активность тиреоидных клеток. Большое значение в развитии аутоиммунных заболеваний ЩЖ придается нарушению апоптоза лимфоцитов [8, 9].
В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение интенсивности апоптоза лимфоцитов крови и участия α-фактора некроза опухоли (ФНО-α) и интерферона γ (ИФН-γ) в ее модуляции при аутоиммунном тиреоидите (АИТ) и диффузном токсическом зобе (ДТЗ).
Материал и методы
В исследование был включен 81 пациент (2 мужчины и 78 женщин в возрасте 19—60 лет) с диагнозом хронического АИТ и ДТЗ. Все больные были разделены на группы в зависимости от нозологической формы и функциональной активности ЩЖ. В 1-ю группу были включены 46 пациентов с АИТ (при этом ранее был диагностирован гипотиреоз, пациенты получали заместительную терапию левотироксином не менее 6 мес и на момент обследования была достигнута компенсация гипотиреоза), 2-ю группу составили 20 пациентов с АИТ с гипофункцией ЩЖ (не получавшие заместительную терапию). В 3-ю группу вошли 15 пациентов с ДТЗ (тиреотоксикоз различной степени тяжести). В контрольную группу были объединены 15 условно здоровых добровольцев (мужчина и 14 женщин) аналогичного возраста.
Диагноз АИТ и ДТЗ устанавливали на основании характерных клинико-лабораторных признаков. Диагноз АИТ верифицировали на основании характерных ультрасонографических признаков, обнаружения в сыворотке крови повышенного титра антитиреоидных антител (антител к тиреопероксидазе и/или тиреоглобулину) и первичного гипотиреоза в момент обследования либо в анамнезе заболевания — манифестного или стойкого субклинического. При диагностике ДТЗ обращали внимание на наличие характерных жалоб и клинической картины тиреотоксикоза, данных физикального обследования, характерных ультрасонографических признаков, наличие в сыворотке крови повышенного титра антитиреоидных антител (антител к тиреопероксидазе и/или тиреоглобулину), характерных изменений гормонального статуса — низкий уровень тиреотропного гормона (ТТГ) в сочетании с повышенной концентрацией свободных фракций трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4) [2, 4]. Критериями исключения пациентов из исследования были наличие в анамнезе и на момент обследования видимой сопутствующей инфекционной и неинфекционной патологии, онкологических заболеваний, вакцинация и прием иммуномодулирующих препаратов в течение 6 мес, предшествующих исследованию.
Материалом для исследования служила периферическая кровь, забранная из локтевой вены утром натощак в количестве 5 мл.
Апоптотический потенциал лимфоцитов периферической крови оценивали путем идентификации клеток CD95 в условиях in vitro с помощью моноклональных антител CD95 (Сорбент, Москва) в лимфоцитотоксическом тесте по методу Р.В. Петрова и соавт. [10]. Для количественного определения концентраций ФНО-α и ИФН-γ в сыворотке крови использовали наборы реагентов α-ФНО-ИФА-БЕСТ и γ-интерферон-ИФА-БЕСТ (Вектор-Бест, Новосибирск).
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0. Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, применяли непараметрический критерий Манна—Уитни, а для выборок, подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали критерий Стьюдента. Степень зависимости между параметрами внутри исследуемых групп оценивали с помощью ранговой корреляции Спирмена. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05 [11].
Результаты и обсуждение
Согласно современным представлениям [5, 12], АИТ и ДТЗ рассматриваются как заболевания, обусловленные генетическим дефектом Т-супрессоров. Этот дефект способствует выживанию «запрещенных» клонов Т-лимфоцитов, которые появляются в результате случайной мутации и способны к взаимодействию с антигенами рецепторного аппарата фолликулярного эпителия, оказывая повреждающее действие на тиреоциты. Т-супрессоры при взаимодействии с В-лимфоцитами индуцируют синтез антител. Кроме того, экзогенные антигены, имеющие в своем составе перекрестные антигены с компонентами мембраны тиреоцитов, способствуют выработке аутоантител [1]. Как при АИТ, так и при ДТЗ, обнаруживаются антитела к тиреоидным антигенам — тиреоидной пероксидазе, тиреоглобулину [6, 13]. Другая фракция иммуноглобулинов, получивших название «тиреостимулирующие иммуноглобулины» (ТСИГ), при связывании с рецепторами к ТТГ способна вызывать гиперфункцию тиреоцитов, усиление синтеза и секреции гормонов. В активной фазе заболевания ТСИГ определяются у 90% больных ДТЗ. Гиперфункция ЩЖ, возникающая под влиянием ТСИГ, сопровождается гипертрофией ее паренхимы, повышением концентрации тиреоидных гормонов в крови [1, 13].
Огромную роль в функционировании иммунной системы играет апоптоз, обеспечивающий элиминацию лимфоцитов с генными мутациями или с неадекватной специфичностью рецепторов, чужеродных клеток, аутоагрессивных лимфоцитов, старых и «отработавших» клеток, выполнивших свою функцию [14—16]. Реализация программы клеточной гибели, в том числе при аутоиммунных заболеваниях, на настоящее время активно изучается, причем наибольший интерес вызывает регулирующее влияние на апоптоз биологически активных веществ — цитокинов [14—19]. Выявлена группа цитокинов: ФНО, интерлейкин (ИЛ)-1, β-токоферол, способных индуцировать апоптоз. Цитокининдуцированный апоптоз — сложный механизм. В этом виде апоптоза на клетку не действуют внешние антиапоптотические факторы, отсутствует генетическая блокада апоптоза, не активируются репарационные процессы. Другая группа цитокинов (ИЛ-2, 3, 4, 10, ИФН-α) запускает программу защиты от апоптоза посредством активации белков Вcl-2, Bcl-х [13, 20, 21].
В ходе исследования было установлено, что уровень презентации рецепторов CD95 на лимфоцитах у больных АИТ в состоянии эутиреоза соответствовал таковому у здоровых доноров, в то время как в группе больных АИТ с гипофункцией ЩЖ и при ДТЗ отмечалось достоверное увеличение количества лимфоцитов CD95+ по сравнению с нормой в среднем в 2 раза (см. таблицу).
Известно, что зрелые Т- и В-лимфоциты в неактивном состоянии лишены мембранного рецептора Fas и экспрессируют протоонкогены Всl-2 и Всl-xl, что определяет их устойчивость к индукторам апоптоза [21]. Положение меняется на обратное при активации лимфоцитов, что, несомненно, наблюдается в случае развития антитиреоидного аутоиммунитета. Увеличение экспрессии Fas/CD95 на лимфоцитах сопровождается ростом чувствительности клеток к соответствующему лиганду — Fas-L, связывание с которым определяет запуск программы гибели клеток [9, 22, 23]. Следовательно, учитывая, что увеличение уровня экспрессии рецептора Fas на лимфоцитах отражает их готовность к апоптозу, которая в условиях активации клеток аутоантигеном (как при АИТП) и взаимодействия Fas-R с Fas-L реализуется в гибель клетки, мы можем расценивать увеличение числа лимфоцитов CD95+ у пациентов с АИТ в стадии гипотиреоза и у больных с ДТЗ в качестве признака не только повышенной «предуготовленности» лимфоцитов к апоптозу, но и активации программированной гибели клеток.
Увеличение числа лимфоцитов CD95+ у больных АИТ в стадии гипотиреоза также могло быть связано с функциональным состоянием ЩЖ. Тиреоидные гормоны способны оказывать мембранотропный эффект, влиять на электрическую стабильность и мембранный потенциал лимфоцитов. Свободные тиреоидные гормоны регулируют пассивный ток натрия внутрь клеток через ионные каналы, который при избытке гормонов усиливается, при недостатке — тормозится [24]. В соответствии с этим усиливается или тормозится активный ток натрия в обратную сторону, что направлено на поддержание нормального трансмембранного электрохимического потенциала клеток. В свою очередь падение трансмембранного потенциала является одним из наиболее значимых факторов запуска каскада реакций гибели клетки [25, 26].
Другое возможное объяснение гибели лимфоцитов у больных с АИТП — изоляция иммунологически «привилегированных» зон от проявлений активности эффекторных клеток иммунной системы. К числу таких зон относится ткань ЩЖ, клетки которой с целью «самообороны» эспрессируют лиганд Fas. В результате эффекторные Т-лимфоциты, экспрессирующие рецептор Fas, неизбежно гибнут в процессе миграции через данный барьер вследствие взаимодействия рецептора Fas с лигандом Fas барьерных клеток [27].
Как отмечалось выше, немаловажную роль в модуляции апоптоза играют цитокины, прежде всего ФНО-α. Апоптоз, индуцированный ФНО, реализуется через специфические рецепторы — TNF-R1 и TNF-R2. ФНО-α относят к гомологам лиганда Fas, что свидетельствует о его высокой апоптогенной активности. Кроме того, апоптоз, индуцированный связыванием TNF-α с TNF-R1, подобно взаимодействию Fas-R с Fas-L, может осуществляться через путь FADD—каспаза 8, а также сходный с ним адапторный белок TRADD (TNF-R-associated death domain). В то же время гиперэкспрессия TRADD ведет не только к запуску апоптоза, но и к активации ядерного фактора κВ (NFkB), который предотвращает индуцированную ФНО гибель клетки [22, 23, 27].
При изучении содержания ФНО-α в сыворотке крови у больных АИТП показано многократное повышение концентрации цитокина независимо от формы заболевания и функционального состояния ЩЖ (см. таблицу). Наряду с этим при корреляционном анализе у больных с АИТ с гипотиреозом выявлена положительная связь между концентрацией ФНО-α и численностью лимфоцитов CD95+ в крови (r=0,739; р<0,05), что подтверждает данные литературы [27] о способности ФНО-α (равно как и ряда иных провоспалительных цитокинов — ИЛ-1, 2, ИНФ-γ и др.) индуцировать экспрессию Fas-R на мембране клеток.
По мнению ряда исследователей [9, 28], уровень продукции ФНО-α при АИТП определяется выраженностью аутоиммунного процесса. По данным литературы, при контакте с антигеном происходит активация антигенраспознающей функции иммунокомпетентных клеток с последующей выработкой ими ряда цитокинов, участвующих в индукции аутоиммунного процесса, в частности ФНО-α. Этот фактор играет важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний ЩЖ, поскольку принимает непосредственное участие в регуляции пролиферации антигенспецифических клонов Т-, В-лимфоцитов и продукции аутоантител. Он также обладает способностью усиливать экспрессию на поверхности тиреоцитов антигенов гистосовместимости (HLA) II класса, что может обусловливать нарушение процессов антигенного распознавания и запуск антитиреоидного иммунитета. Наряду с этим ФНО-α осуществляет коррекцию численности цитотоксических лимфоцитов, поражающих собственную ЩЖ, т.е. представляет собой некий компонент защитной реакции макроорганизма, контролирующей «силу» аутоиммунного процесса. Это позволяет предполагать, что повышение содержания ФНО-α в крови у больных АИТП может быть не только критерием оценки активности аутоиммунного процесса, но и позитивным прогностическим признаком, что совершенно очевидно зависит от степени увеличения концентрации цитокина.
Определенную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний играет ИФН-γ. Существует мнение [6, 28, 29], что ИФН-γ ингибирует транскрипцию гена тиреоглобулина, модулирует функционирование и пролиферацию фолликулярных клеток ЩЖ, экспрессию HLA II класса на поверхности тиреоцитов.
Содержание ИФН-γ в сыворотке крови у пациентов с АИТ в состоянии эутиреоза оказалось пониженным. При этом у больных АИТ с гипофункцией ЩЖ и ДТЗ концентрация данного цитокина сохранялась в пределах контрольного уровня (см. таблица).
По всей видимости, сохранение уровня ИФН-γ в крови в пределах нормы у больных АИТ с гипотиреозом и пациентов с ДТЗ также следует считать благоприятным фактором, поскольку ИФН-γ, являясь эффективным механизмом отрицательной обратной связи контроля гиперпродукции провоспалительных цитокинов, нормализует количество клеток CD95+, стимулирует процессы репарации ДНК, что служит фактором защиты клеток от преждевременной гибели [6, 15, 16, 30]. Однако значимых корреляций между концентрацией ИФН-α и содержанием ФНО-α и лимфоцитов CD95+ в крови у больных АИТ и ДТЗ нами не зарегистрировано.
Таким образом, полученные в ходе настоящего исследования результаты свидетельствуют о стимуляции апоптоза циркулирующих лимфоцитов у больных ДТЗ и АИТ с гипофункцией ЩЖ, которая в последнем случае проявляет выраженную взаимосвязь с повышенным уровнем в крови ФНО-α. Указанные изменения, по нашему мнению, представляют большой интерес, поскольку имеют не только научную, но и практическую значимость и могут быть использованы как в оценке нарушений иммунного статуса при АИТ и ДТЗ, так и для прогнозирования течения, предупреждения неблагоприятных исходов и обоснования дифференцированного подхода к выбору тактики иммунокорригирующей терапии отдельных клинических форм аутоиммунного поражения ЩЖ.
Выводы
1. Признаком стимуляции апоптоза при АИТ в стадии гипотиреоза и ДТЗ является увеличение содержания «предуготовленных» к апоптозу лимфоцитов CD95+ в крови.
2. Течение АИТ и ДТЗ сопровождается увеличением содержания ФНО-α в сыворотке крови, сочетающимся при АИТ с уменьшением концентрации ИФН-α в крови.
3. Уровень CD95-позитивных циркулирующих лимфоцитов при АИТ в состоянии гипотиреоза зависит от содержания ФНО-α в сыворотке крови.