Рак молочной железы (РМЖ) — одна из наиболее часто выявляемых онкологических патологий, составляет 22,3—24,5% от всех впервые диагностируемых случаев рака у женщин [1, 2]. Установлено, что причиной смерти пациенток с РМЖ в 75,5 — 90% случаев является прогрессирование — формирование отдаленных метастазов [3]. Наиболее часто (у 75% пациенток) отдаленные метастазы при прогрессировании РМЖ выявляются в костной ткани [4]. Вероятность прогрессирования в первые 5 лет после диагностирования РМЖ зависит от возраста, стадии и морфологического подтипа и составляет 60,6% [5].

У пациенток с РМЖ и высоким риском прогрессирования, составляющих до 20% от общего числа случаев с первично выявленной опухолью, свою эффективность показала предоперационная (неоадъювантная) лекарственная терапия (НЛТ), включающая в зависимости от подтипа опухоли или химиотерапию, или ее сочетание с таргетной терапией [6]. Известно, что НЛТ при РМЖ может стать причиной нарушения гемостаза, в ряде случаев приводящего к развитию венозной тромбоэмболии (ВТЭ), которую диагностируют в 3,5 раза чаще, чем в здоровой популяции [6, 7]. Причем почти в половине случаев имеется не только тромбоз глубоких вен голени, но и тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА) [6], что само по себе может обусловливать смертельный исход у пациенток [7]. Еще больше усугубляет проблему то, что у большинства пациенток с РМЖ опухоль выявляют в возрасте старше 55 лет [2]. Как известно, среди предикторов развития ВТЭ возраст занимает одну из главенствующих позиций [6]. Учитывая все вышесказанное, всестороннее изучение особенностей гемостаза на самых начальных этапах лечения РМЖ, например, при проведении НЛТ, является актуальной задачей современной онкологии.

Нарушение агрегатного состояния крови, характеризующееся склонностью к тромбообразованию, также является и неблагоприятным фактором высокого риска опухолевой прогрессии [8, 9]. На практике сочетание клинического проявления такой склонности, например, как ВТЭ и злокачественной опухоли (чаще желудочно-кишечного тракта), получило название синдрома Труссо (Trousseau syndrome) [10, 11]. Патогенез потенцирования отдаленного метастазирования за счет развития склонности к торомбообразованию до конца не изучен [9]. Например, некоторые авторы [12, 13] предполагают, что формирование нейтрофильных внеклеточных ДНК-ловушек (НВЛ) может обусловливать как высокий риск развития ВТЭ, так и провоцировать отдаленное метастазирование, например, в легкие.

Последнее время в литературе появились сообщения о потенциальной возможности диагностировать предрасположенность к тромбообразованию у онкологических пациентов методом пространственной тромбодинамики (ПТД), в ходе которой выявляют не только склонность к спонтанному образованию тромба, но и ускорение образования индуцированного сгустка. Некоторые авторы [14—16] предлагают обозначать совокупность данных ПТД, свидетельствующих о склонности к тромбообразованию, как гиперкоагуляцию (ГК). В ряде случаев прогнозировать развитие ВТЭ у онкологических пациентов, например, в послеоперационном периоде, позволяет измерение воспалительных маркеров крови и определение тромбоцитарно-лимфоцитарного (ТЛИ) и/или нейтрофильно- лимфоцитарного индексов (НЛИ) [17]. Однако приходится признать, что на сегодняшний день особенности изменения параметров гемостаза у онкологических пациентов, в том числе у пациенток с РМЖ, получающих НЛТ, изучены недостаточно.

Цель настоящего проспективного исследования — выявление факторов, ассоциированных с нарушением гемостаза у пациенток с РМЖ при проведении НЛТ.

Материал и методы

Настоящее проспективное исследование выполнено в рамках Госзадания Минздрава Московской области по разделу «Наука» (НИР №47). В исследование включена 31 пациентка с впервые выявленным РМЖ. Условием включения являлось отсутствие клинических признаков ВТЭ (тромбоз глубоких вен голени, ТЭЛА) и удовлетворительное функциональное состояние испытуемой (ECOG 0-1). Возраст включенных в исследование пациенток с РМЖ составлял 58 (средний 47—66) лет (табл. 1). Наиболее часто клинические характеристики опухоли соответствовали следующим параметрам: cT2 — 68% пациенток, cN0 — 77%. У 18 (59%) пациенток фенотип РМЖ характеризовался как люминальный B-подтип. Анализ экспрессии HER2new в клетках опухоли показал, что наиболее часто (у 52% пациенток) выявляли негативный (0 баллов) статус HER2new.

Таблица 1. Характеристики пациенток, включенных в исследование

Забор крови осуществляли не ранее чем через 3 нед после завершения 1 цикла НЛТ. Доцетаксел являлся наиболее частым компонентом схемы НЛТ, препарат использовался у 16 (52%) пациенток. Сочетание доксорубицин+циклофосфамид применялось у 12 (39%) пациенток, таргетная терапия (трастузумаб±пертузумаб) — у 5(16%).

Для исследования нарушения гемостаза выявляли наличие ГК методом ПТД, для чего осуществляли забор крови из локтевой вены в объеме 2,7 мл в пробирку с цитратом натрия и последующим центрифугированием в течение 15 мин при оборотах 16^.1000 g. Далее 1000 мкл верхнего слоя плазмы повторно центрифугировали в течение 5 мин при оборотах 10^.1000 g. С целью изучения динамики роста фибринового сгустка и спонтанного тромбообразования кювету с плазмой помещали в лабораторную диагностическую систему Thrombodynamics analyzer system T-2 на 30 мин. Программное обеспечение анализатора позволяло получать следующие параметры: Vi (в мкм/мин) — начальная скорость индуцированного роста сгустка в течение 2—6 мин после начала исследования; V (в мкм/мин) — средняя скорость индуцированного роста сгустка в течение 15—25 мин после начала исследования и Tsp (в мин) — время появления спонтанных сгустков в объеме плазмы. Если хотя бы 1 из 3 вышеназванных параметров не соответствовал референтным значениям, диагностировали ГК. По данным коагулограммы ГК диагностировали на основании показателя АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время) в случае, если данный показатель был меньше 25,1 с. Гиперфибриногенемию определяли в случае увеличения уровня фибриногена крови более 4,5 г/л.

Для исследования НВЛ в периферической крови осуществляли забор 2 мкл цельной крови в вакуумную пробирку с ЭДТА и готовили мазки по типу «монослой». Далее мазки окрашивали по Романовскому–Гимзе и подсчитывали 200 клеточных структур, включая нативные гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы и базофилы) и НВЛ. Подсчет НВЛ в мазке проводили с помощью системы автоматической микроскопии МЕКОС-Ц2 (ООО «Медицинские компьютерные системы», Россия). Количество НВЛ рассчитывали по следующей формуле:

НВЛ (в %)=N_нвл /N_нат+N_нвл,

где N_нвл — количество НВЛ; N_нат — количество неразрушенных (нативных) гранулоцитов.

Признаком, на основании которого устанавливали наличие НВЛ, считали визуализацию нейтрофильных внеклеточных нитей ДНК (рисунок).

Нейтрофильная внеклеточная ловушка: визуализируется ядро нейтрофила (фиолетовый цвет) с внеклеточными нитями ДНК.

Для исследования воспалительных индексов использовали результаты общего анализа крови, датированного не ранее чем за 5 дней до начала лечения. Значение НЛИ представляло отношение числа нейтрофилов к числу лимфоцитов, ТЛИ — отношение числа тромбоцитов к числу лимфоцитов. Высоким НЛИ считали показатель более 4, а ТЛИ — более 150.

Результаты

Нарушение гемостаза в период проведения НЛТ, о чем в нашем исследовании свидетельствовало выявление ГК по данным ПТД и коагулограммы, диагностировано у 13 (42%) и 1(4%) пациентки соответственно. Гиперфибриногенемия имелась у 12 (39%) пациенток, высокий НЛИ — всего у 2 (7%). Зато высокий ТЛИ выявили у 21 (68%) из 31 пациентки. В крови всех пациенток, получающих НЛТ, визуализированы НВЛ (табл. 2).

Таблица 2. Нарушение гемостаза при проведении неоадьювантной лекарственной терапии рака молочной желез

Примечание. (+) — параметр выявляется; (—) — параметр не выявляется.

С целью выявления предикторов нарушения гемостаза провели сравнительный анализ клинико-морфологических и лабораторных параметров, разделив пациенток на 2 группы: 1-я состояла из 13 (42%) пациенток, у которых по результатам ПТД была диагностирована ГК, 2-я — из 18 (58%) пациенток без признаков ГК (табл. 3). При анализе клинических параметров возраст пациенток 1-й группы оказался ниже, чем 2-й (50 (46—58) лет и 62 (50—67) года соответственно). После статистической обработки стало ясно, что эта разница всего лишь тенденция (p=0,055). Частота выявления пациенток с параметрами cT1 и cN(+) в обеих группах достоверно не отличалась. При анализе морфологических показателей в группах обнаружены уже существенные отличия. Установлена тенденция (p=0,063) к увеличению значения Ki-67 в 1-й группе, чем во 2-й. Также в 1-й группе достоверно чаще (у 54% пациенток; p=0,048) выявлялась низкая дифференцировка опухоли (G3). Молекулярный подтип и уровень экспрессии HER2new не оказывали существенного влияния на развитие ГК. Анализ лабораторных параметров установил, что только количество НВЛ было существенно выше (p=0,017) в 1-й группе. Параметры, характеризующее уровень воспалительных маркеров (фибриногена, НЛИ и ТЛИ), оказались сравнимы в обеих группах.

Таблица 3. Предикторы развития гиперкоагуляции у пациенток с раком молочной железы, получающих неоадъювантную лекарственную терапию

Обсуждение

Несмотря на то что риск нарушения гемостаза и, как следствие, развития ВТЭ при РМЖ считается не самым высоким, большую часто всех случаев тромбозов, ассоциированных с раком, составляют именно пациентки с РМЖ. Обусловлено это тем, что РМЖ — самая часто выявляемая онкологическая патология у женщин [7]. Провоцировать ВТЭ при РМЖ способны возраст, увеличение массы тела и стадии заболевания, а также сопутствующая патология [7]. Актуальность изучения особенностей нарушения гемостаза при РМЖ обусловлена его негативным влиянием на двухлетнюю выживаемость пациенток при локальной и локорегионарной стадии этой патологии [7].

Уже известно, что проведение химиотерапии при РМЖ повышает риск развития ВТЭ в 10,8 раза. Угроза ВТЭ сохраняется и в течение 3 мес. после ее завершения. Склонность к тромбообразованию, сопровождаемая повышением риска ВТЭ, фиксируется в течение первого месяца после операции при РМЖ, а также в первые 3 мес. после начала лечения тамоксифеном (но не ингибиторами ароматазы). Способствует увеличению риска ВТЭ с 3 до 11% и проведение лучевой терапии у пациенток с РМЖ [6, 7].

Если развитие ВТЭ у онкологических пациентов, в том числе РМЖ, уже привлекает пристальное внимание исследователей и клиницистов [18], то этиология и патогенез ГК, которая теоретически может являться предтечей ВТЭ, на сегодняшний день изучены недостаточно. Обсуждается, например, механизм инициации ГК при проведении химиотерапии у пациенток с РМЖ, заключающийся в секреции опухолевыми клетками IL-1β с последующим формированием НВЛ. Установлено, что вышеописанный механизм обусловливает не только развитие ГК, но и через активацию TGF-β индуцирует прогрессирование опухолевого процесса в ответ на проведение химиотерапии [19]. Высокий уровень НВЛ может лежать и в основе органотропизма при формировании метастазов в печени при РМЖ [20]. Следует отметить, что рост внутри опухолевого уровня НВЛ в ряде случаев способствует более благоприятному течению опухолевого процесса [20]. Другими словами, выявление ГК теоретически может являться не только основанием для профилактики ВТЭ, но и расцениваться как предиктор эффективности лечения и выживаемости, например, у пациенток, получающих НЛТ при РМЖ.

В нашем исследовании установлено, что по данным ПТД у пациенток с РМЖ без клинических признаков ВТЭ во время проведения НЛТ достаточно часто (у 42%) развивается ГК. К нашему удивлению, результаты коагулограммы оказались малочувствительными при диагностике ГК. Полученные данные свидетельствуют, что в период проведения НЛТ при РМЖ имеются показания к более углубленному обследованию реологических свойств крови, результаты которого могут стать основанием для проведения как минимум профилактики тромбоза. Заслуживает внимания и большое число пациенток, у которых обнаружены высокие маркеры/индикаторы воспаления (фибриноген и ТЛИ), ассоциация которых с развитием ГК и/или ВТЭ не исключается [21]. Так, уже известно [17], что в ряде случаев ТЛИ может стать значимым предиктором развития ВТЭ в послеоперационном периоде у онкологических пациентов. Влияние значений индикаторов воспаления во время проведения НЛТ на вероятность развития ВТЭ или выживаемость только предстоит изучить.

В течение проведения НЛТ в крови всех пациенток с РМЖ мы обнаружили НВЛ (neutrophil extracellular traps, NETs). В норме НВЛ наряду с фагоцитозом являются антипатогенным лейкоцитарным защитным механизмом. Инициаторами НВЛ могут быть бактерии, вирусы, воспалительные цитокины (LPS, IL-8, TNFα), а также активированные тромбоциты. Далее происходит транслокация ферментов из цитоплазматических гранул в ядро нейтрофила с последующей деконденсацией ДНК и разрушением ядерной мембраны. На финальном этапе установлены выброс цепей ДНК в экстрацеллюлярное пространство и гибель нейтрофила. Рост числа НВЛ отмечается при опухолевой и вирусной патологии, диабете, атеросклерозе [22, 23]. Предложены несколько классификаций НВЛ, но наиболее часто исследователи ориентируются на визуализацию экстрацеллюлярных нитей ДНК [24].

В нашем исследовании обращает на себя внимание тот факт, что количество НВЛ оказалось достоверно выше у пациенток в случае выявления у них ГК по результатам ПТД (1,6 и 0,9 % соответственно; p=0,017). На основании полученных данных можно предположить, что на этапе лечения РМЖ, предусматривающем проведение НЛТ, формирование НВЛ можно рассматривать как один из индукторов развития склонности к тромбообразованию. Является ли причиной увеличения НВЛ сам факт проведения НЛТ или избыточное образование НВЛ является следствием иных факторов, таких как, например, возраст и связанный с ним риск развития атеросклероза, неизвестно. В рамках настоящего исследования также не представилось возможным установить точные сроки развития склонности к тромбообразованию. Работа по этому направлению будет продолжена.

Особый интерес вызывает тот факт, что у пациенток с ГК достоверно чаще выявлялись и признаки более высокого риска прогрессирования опухолевого процесса. Так, в клетках опухоли пациенток с ГК установлена тенденция к увеличению индекса пролиферативной активности Ki-67. Опухоль у таких пациенток значительно чаще имела и низкую дифференцировку (G3). Как известно, вышеназванные параметры являются негативными предикторами выживаемости при РМЖ [25, 26]. Сопоставляя все вышесказанное, можно сделать вывод, что, не исключая роль лекарственной терапии (в нашем случае НЛТ) в развитии склонности к тромбообразованию, есть основание предполагать, что ГК может быть одним из следствий более злокачественного фенотипа, присущего опухолевым клеткам РМЖ. Следовательно, наряду с иными уже известными прогностическими факторами данные о наличии или отсутствии ГК могут стать предиктором, например, выживаемости у пациенток с РМЖ. Планируется продолжать исследование в этом направлении. Следует также отметить установленную в нашем исследовании тенденцию к снижению возраста пациенток, у которых диагностирована ГК, что противоречит аксиоме, свидетельствующей, что высокий риск склонности к тромбообразованию ассоциирован с возрастом. Этот факт, с нашей точки зрения, также указывает на то, что именно более злокачественный фенотип опухоли в данном исследовании обусловливает развитие ГК. Клиническим подтверждением этого тезиса служит уже известный факт более злокачественного течения РМЖ у лиц молодого возраста [27].

Заключение

Следует отметить, что в период проведения неоадъювантной лекарственной терапии по поводу первично установленного РМЖ у 42, 39 и 68% пациенток диагностируются гиперкоагуляция, гиперфибриногенемия и высокий тромбоцитарно-лимфоцитарный индекс. Также обнаружена ассоциация между выявлением гиперкоагуляции и такими параметрами злокачественности онкологического процесса, как молодой возраст, высокий индекс пролиферативной активности и низкая дифференцировка опухоли. Достоверно более высокий уровень нейтрофильных внеклеточных ДНК-ловушек у пациенток с РМЖ, у которых по данным пространственной тромбодинамики обнаружена гиперкоагуляция, может свидетельствовать о возможном участии нейтрофильных внеклеточных ДНК-ловушек в патогенезе гиперкоагуляции на этом этапе лечения РМЖ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования —Балканов А.С., Василенко И.А.

Сбор и обработка материала —Михайлов И.В., Сахаров М.М.

Статистическая обработка — Метелин В.Б.

Написание текста —Балканов А.С., Михайлов И.В. Сахаров М.М.

Редактирование —Балканов А.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.