Рак молочной железы (РМЖ) является ведущим (21,2%) онкологическим заболеванием среди женского населения, лидируя (15,9%) при этом и в структуре смертности [1—3]. По заболеваемости РМЖ Свердловская область находится на уровне общероссийских показателей. В 2021 г. было зарегистрировано 1992 новых случая рака [2—5].
Известно, что 5—10% случаев РМЖ являются наследственными формами, треть из которых обусловлена наличием герминальной мутации в генах BRCA1 и BRCA2 [6]. Это самый распространенный наследственный опухолевый синдром: носительство мутаций в популяции варьирует от 1:800 до 1:1000 и сопряжено с высоким риском развития к 70-летнему возрасту РМЖ (45—75%), рака яичников (40—59%), а также контралатерального РМЖ (64—83%) [7, 8]. Встречаемость мутаций и их спектр зависят от популяции. Несмотря на то что один из этих генов, в частности BRCA1, имеет длину более 80 тыс. пар оснований и может иметь несколько сотен вариантов патогенетических изменений в последовательности, определены наиболее встречаемые мутации и разработаны диагностические панели на определение основных мутаций в конкретной популяции [9]. В российской популяции наиболее частая мутация — инсерция 5382insC в гене BRCA1, это так называемая founder-мутация для славянской популяции [9,10].
Гены BRCA1,2 участвуют в механизме восстановления двунитевых разрывов ДНК путем гомологичной рекомбинации и, соответственно, в поддержании стабильности генома [11]. Вследствие наличия герминальной мутации в этих генах и инактивации второго аллеля (другие соматические мутации, эпигенетические события) процесс репарации происходит с ошибками, что приводит к дерегуляции клеточного цикла и генетической нестабильности [12].
Такие генетические события не смогли не отразиться на особенностях заболевания, вызываемого ими. Показано, что наследственная и спорадическая формы РМЖ имеют различную клиническую, диагностическую и морфологическую картину [13]. Это позволяет фенотипически выделить группу пациенток, которым необходимо проводить генетическое тестирование на носительство мутаций в генах BRCA1, 2.
Как указывают E.Warner и соавт. [14], чувствительность маммографии для выявления РМЖ у носителей мутации генов BRCA оценивается в 30%, что намного ниже, чем ее предполагаемая чувствительность в 83% в общей популяции, при этом даже при ежегодном рентгенологическом обследовании РМЖ, ассоциированный с мутациями BRCA, почти в половине случаев диагностируется менее чем через 1 год после получения нормальных результатов маммографии [15, 16]. Снижение чувствительности маммографии в этом случае обусловлено множеством причин. РМЖ, ассоциированный с BRCA, имеет более высокую скорость роста, что приводит к интервальному РМЖ [17]. Кроме того, пациентки с мутацией BRCA — чаще всего молодые женщины с плотным рентгенологическим фоном, что также затрудняет диагностику [18].
Применение цифрового томосинтеза молочной железы в данном случае предпочтительно для носителей мутации BRCA с плотностью молочной железы C и D [19].
По данным J. Veltman и соавт. [20], BRCA-ассоциированные злокачественные новообразования молочной железы часто являются медуллярными карциномами, имеющими визуальные признаки доброкачественного процесса, что приводит к ложноотрицательным результатам [21].
Важно отметить, что женщины, носители мутации BRCA-генов, с выявленными маммографическими изменениями должны быть дообследованы, им необходимо проводить УЗИ и биопсию [22].
При УЗИ выявляются хорошо очерченные гипоэхогенные однородные образования с хорошей звукопроводностью [23].
При включении в алгоритм обследования МРТ молочных желез, по данным E. Warner и соавт. [24], 97% случаев РМЖ были 0 или I стадии, что подтверждает способность МРТ-визуализации диагностировать ранние стадии и потенциально излечимые формы рака в этой популяции.
Важно отметить, что в ряде случаев маммография может выявлять случаи DCIS, сопровождающиеся микрокальцинатами, которые может пропустить МРТ. Поэтому для скрининга носителей мутации BRCA в настоящее время рекомендуются комбинация МРТ-визуализации и маммографии [25].
Цель исследования — определение клинико-диагностических характеристик РМЖ, ассоциированного с наследственными мутациями в генах BRCA1, 2, в популяции женщин, проживающих на территории Свердловской области.
Материал и методы
Были проанализированы результаты обследования 722 больных РМЖ с октября 2019 по ноябрь 2021 г. Диагноз РМЖ установлен согласно рекомендациям ВОЗ и гистологически подтвержден в ГАУЗ СО «СООД» и других медицинских учреждениях.
Критериями включения в исследование были установленный гистологически диагноз РМЖ и наличие как минимум одного из факторов: возраст до 45 лет, трижды негативный РМЖ в возрасте до 60 лет, второй РМЖ в любом возрасте, первично-множественный рак, отягощенный семейный анамнез. У всех пациенток было взято информированное добровольное согласие об использовании биологического материала для генетического исследования.
Критерии исключения — отсутствие какого-либо одного фактора из перечисленных выше, а также добровольного информированного согласия.
Всем больным проведено молекулярно-генетическое исследование, включающее поиск распространенных в славянской популяции мутаций в генах BRCA1, 2. ДНК получали из цельной периферической крови. Забор крови производили в вакуумные пробирки с антикоагулянтом этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). Экстракцию ДНК проводили с помощью комплекта реагентов «РИБО-преп» (Амплисенс, ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия).
Для анализа мутаций использовали набор «Пироскрин BRCA-скрин» (Амплисенс, ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия) для определения 6 наиболее распространенных в славянской популяции мутаций (табл. 1).
Таблица 1. Список определяемых мутаций в генах BRCA 1, 2
| Мутация, локус | Последовательность для анализа | Reference SNP |
| 185delAG, BRCA1 | T[CT]AAGATTTTCTGC | rs80357713 |
| 300T>G (C61G), BRCA1 | T/GGTCCTTTATGTA | rs28897672 |
| 2080delA, BRCA1 | [T]CTTTATCTCT | rs80357522 |
| 4153delA, BRCA1 | GA[A]GAAAGAGGA | rs80357711 |
| 5382insC, BRCA1 | [G]ATTCTCTTG | rs80357906 |
| 6174delT, BRCA2 | [A]CTTGCTGTG | rs80359550 |
Согласно инструкции, первым этапом проводили ПЦР с праймерами с целью амплификации материала. Далее ПЦР-продукт иммобилизовали с помощью стрептавидиновой сефарозы, подготавливали одноцепочечную ДНК с помощью вакуумной рабочей станции PyroMark Q24 (Qiagen, Германия), отжигали соответствующими праймерами для секвенирования. Дальнейшая реакция пиросеквенирования происходила в приборе PyroMark Q24 (Qiagen, Германия).
Полученные пирограммы анализировали с помощью специального программного обеспечения, сравнивали с ожидаемой пирограммой здорового генотипа (рис. 1).
Рис. 1. Пирограммы дикого и мутантного гена BRCA1 на примере мутации 5382insC (анализ обратный).
Далее группу пациенток с установленным фактом наличия мутации описывали по следующим признакам: возраст, стадия заболевания, гистологический диагноз, данные иммуногистохимического исследования (статус рецепторов эстрогена, прогестерона, HER2, маркера пролиферативной активности Ki-67), наличие семейного онкологического анамнеза, а также развитие синхронного, метахронного или первично- множественного процесса. В некоторых случаях были доступны не все данные о пациентках.
Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных программ Microsoft Excel, MedCalc.
Данные цифровых лучевых методов диагностики зачастую демонстрируют признаки доброкачественного образования. Так, на маммограммах (рис. 2, а, цв. вклейка) выявляется гиперденсное неоднородное образование с достаточно четкими контурами. При УЗИ (рис. 2 б, г, цв. вклейка) — гипоэхогенная неоднородная структура, на СЭГ 4-й эластотип, STR 7,9, умеренно васкуляризированная. При МРТ с ДКУ (рис. 2 д, е, цв. вклейка) определяется фокус, на первых минутах интенсивно накапливающий контрастное вещество с признаками вымывания к 3-й минуте (кривая 3-го типа). Морфологически (рис. 2, в, цв. вклейка) — это неоднородная структура с очагами некроза, периваскулярной инвазией.
Рис. 2. Медуллярная карцинома правой молочной железы, ассоциированная с BRCA1 мутацией. Мультимодальный подход к диагностике.
а — маммограмма: в правой медиолатеральной проекции, ближе к хвостовой части молочной железы выявлено гиперденсное неоднородное образование с достаточно четкими контурами; б, г — УЗИ с соноэластографией (СЭГ) и цветным допплеровским картированием: лоцируется гипоэхогенная неоднородная структура при СЭГ 4-й эластотип, STR 7,9, умеренно васкуляризированная; д, е — МРТ с ДКУ, определяется уплотнение в верхненаружном квадранте, на первых минутах интенсивно накапливающее контрастное вещество, с признаками вымывания к 3-й минуте (кривая 3-го типа); в — макропрепарат, неоднородная структура с очагами некроза, периваскулярная инвазия.
В связи с вышеизложенным важно иметь в виду, что при выявлении вновь появившихся уплотнений в молочных железах у носителей BRCA-мутаций необходимо провести морфологическую верификацию даже при кажущемся доброкачественном характере изменений. При стратификации по системе BI-RADS в этих случаях следует исключить категорию 3.
Знание таких особенностей диагностики поможет оценить необходимость соответствующего генетического тестирования, что является важным этапом диагностического исследования женщин с РМЖ для правильного понимания механизмов возникновения заболевания, прогнозирования течения, а также подбора оптимальной схемы лечения.
Результаты
Молекулярно-генетическое исследование было успешным у всех 722 пациенток. Из них 8,6% (62 пациентки) имели мутацию в генах BRCA1, 2. Встречаемость мутаций по типам показана в табл. 2.
Таблица 2. Выявленные мутации и их встречаемость
| Тип мутации | Количество пациенток | |
| абс. | % | |
| 5382insC, BRCA1 | 47 | 75,78 |
| 300T>G (C61G), BRCA1 | 7 | 11,33 |
| 2080delA, BRCA1 | 4 | 6,45 |
| 4153delA, BRCA1 | 2 | 3,22 |
| 185delAG, BRCA1 | 1 | 1,61 |
| 6174delT, BRCA2 | 1 | 1,61 |
Пациентки с подтвержденной мутацией входили в возрастной диапазон от 25 до 65 лет на момент постановки диагноза. Средний возраст составил 43,2 года (95% ДИ 40,85—45,50).
Сведения о клинической распространенности диагностированной опухоли отсутствовали у 1 (1,61%) пациентки. В остальных случаях распространенность первичной опухоли среди BRCA-ассоциированных РМЖ выглядела следующим образом: с T1 (опухоль 2 см или менее) было 10 (16,39%) пациенток, с T2 (от 2 до 5 см) — 37 (60,65%), с T3 (более 5 см) —12 (19,67%), с T4 (опухоль с прорастанием в грудную стенку и/или кожу) —2 (3,29%) пациентки.
Только 27 пациенток из 62 были опрошены на предмет встречаемости онкологических заболеваний у родственников. Установлено, что из 27 пациенток 24 (88,88%) имели отягощенный семейный онкологический анамнез. В 5 случаях злокачественные новообразования встречались более чем у одного прямого родственника. Список злокачественных новообразований и частота их встречаемости отображена в табл. 3.
Таблица 3. Частота встречаемости злокачественных новообразований у пациенток с подтвержденным BRCA-ассоциированным РМЖ
| Злокачественное новообразование | Частота встречаемости | |
| абс. | % | |
| Рак молочной железы | 14 | 48,28 |
| Орофарингеальный рак | 3 | 10,34 |
| Рак яичников | 2 | 6,89 |
| Рак матки | 2 | 6,89 |
| Рак поджелудочной железы | 1 | 3,45 |
| Рак желудка | 1 | 3,45 |
| Рак легких | 1 | 3,45 |
| Рак печени | 1 | 3,45 |
| Рак перикарда | 1 | 3,45 |
| Рак простаты | 1 | 3,45 |
| Рак почки | 1 | 3,45 |
| Лейкоз | 1 | 3,45 |
Первично-множественный рак встретился у 8 (12,90%) пациенток из 62. При этом в 7 из 8 случаев вторая локализация онкологического процесса — яичники. В одном случае у пациентки развился рак миндалины за 8 лет до постановки диагноза РМЖ.
Синхронный рак диагностирован в 2 (3,22%) случаях, метахронная форма заболевания — в 11 (17,74%).
Из 62 пациенток у 3 не было гистологического и иммуногистохимического заключения (диагноз был поставлен более 15 лет назад). Абсолютно у всех пациенток с известным гистологическим диагнозом (59 случаев) была диагностирована инвазивная карцинома неспецифического типа.
Степень дифференцировки опухоли была известна в 49 случаях. У 32 (65,31%) больных была отмечена низкая степень дифференцировки G3. Умеренно-дифференцированная карцинома G2 BRCA-ассоциированного РМЖ встретилась в нашем исследовании у меньшинства — 17 (34,69%) пациенток. Высокодифференцированные опухоли G1 с мутациями в генах BRCA отсутствовали.
Результаты стандартного (рецепторы эстрогена, прогестерона, рецептора эпидермального фактора роста 2-го типа, маркера пролиферации Ki-67) иммуногистохимического окрашивания 59 образцов отображены в табл. 4.
Таблица 4. Иммуногистохимические характеристики BRCA-ассоциированного РМЖ
| Характеристика | Частота экспрессии рецептора (%) |
| Статус рецептора эстрогена (ER): | |
| позитивный | 20 (33,90) |
| отрицательный | 39 (66,10) |
| Статус рецептора прогестерона (PR): | |
| позитивный | 14 (23,73) |
| отрицательный | 45 (76,27) |
| Статус рецептора эпидермального фактора роста 2-го типа (HER2): | |
| позитивный | 10 (16,95) |
| отрицательный | 49 (83,05) |
Более наглядно эти данные отображены на рис. 3.
Рис. 3. Иммуногистохимические характеристики BRCA-ассоциированного РМЖ.
Стоит отметить, что в 4 случаях, при которых результаты окрашивания HER2 оценены как 2+, было проведено дополнительное исследование методом гибридизации in situ и только в 2 случаях была выявлена амплификация гена HER2. Обращает на себя внимание тот факт, что большинство BRCA-ассоциированных опухолей не имело иммуногистохимического окрашивания, т.е. относилось к тройному негативному фенотипу РМЖ.
Распределение образцов по молекулярным подтипам РМЖ отображено на рис. 4.
Рис. 4. Молекулярно-генетические подтипы BRCA-ассоциированного РМЖ.
Уровень экспрессии гена Ki-67, маркера пролиферативной экспрессии, был высоким у большинства пациенток: в 52 (88,13%) случаях отмечен уровень более 20%, и только в 7 (11,87%) показатели были ниже порогового значения в 20%. При этом медиана в выборке составила 75% экспрессии (ДИ 95% 60—80%).
Обсуждение
Во многих исследовательских работах показано, что наследственный РМЖ, ассоциированный с мутациями в генах BRCA1, 2, имеет отличительные особенности и характеризуется наиболее агрессивным течением. Кроме того, спектр мутаций в этих генах отличается в различных этнических и территориальных группах, что играет важную роль при выборе метода тестирования пациентов в таких многонациональных странах, как Россия [26].
В нашем исследовании из 722 пациенток, проживающих на территории Свердловской области, мы обнаружили мутацию в 8,6%. С учетом особенностей территориальной распространенности мутаций в генах BRCA1, 2 возникают трудности с сопоставлением результатов других исследований. Так, в российских исследованиях встречаются данные о частоте мутаций от 3,2 до 12%. В географически и этнически близкой Челябинской области этот показатель составил около 5,7%. Помимо особенностей состава популяций стоит отметить, что в исследованиях были разные критерии включения женщин, проходящих тестирование (возраст, наличие отягощенного онкологического анамнеза, клинические особенности течения заболевания и др.), а также использовались разные методы тестирования и, соответственно, отличный спектр определяемых мутаций [27].
Как и в большинстве российских исследований, в Свердловской области преобладает founder-мутация 5382insC в 20-м экзоне гена BRCA1 (более 75% женщин с мутацией). Следующие по распространенности мутации — 300T> G (C61G), 2080delA в том же гене. Спектр найденных мутаций в нашем исследовании соответствует таковому в аналогичных исследованиях в восточно-европейских популяциях, на территории европейской части России [27].
Клинический портрет пациенток с BRCA-ассоциированным РМЖ — это ранний возраст постановки диагноза, отягощенный семейный онкологический анамнез, первично-множественный онкологический процесс, метахронный и билатеральный характер заболевания [28]. В нашем исследовании средний возраст пациенток с мутацией на момент постановки диагноза составил 43,2 года. Из доступных нам данных по онкологическому анамнезу пациенток у 88% были установлены случаи онкологических заболеваний у прямых родственников. Практически в половине случаев это был РМЖ, также в анамнезе встречался рак яичников, матки и орофарингеальный рак. О связи мутаций в генах BRCA1, 2 с РМЖ и яичников известно еще с 1990-х годов, позднее стало известно об ассоциации этих генетических нарушений с другими типами рака, в том числе с раком простаты, матки, желудка, поджелудочной железы [28]. Не так давно стало известно о взаимосвязи поломок гена BRCA1, 2 с плоскоклеточными раками головы и шеи [29]. В нашем исследовании не было цели установить, являлись ли эти случаи орофарингеального рака в семейном анамнезе пациенток спорадическими или наследственными, но однозначно стоит отметить важность медико-генетического консультирования таких семей и акцентировать внимание не только на «традиционных» формах BRCA-ассоциированных заболеваний.
Учитывая, что исследование проводилось с октября 2019 г. и не отражало полной картины динамики заболевания пациенток, уже на момент написания статьи замечено, что для лиц с BRCA-ассоциированным РМЖ характерно наличие первично-множественного процесса (12,9%), а синхронный или метахронный процесс возник более чем в 20%. В долгосрочной перспективе во многих исследованиях показано, что риск развития контралатерального процесса у пациенток с мутацией варьирует от 58 до 70% [29, 30].
Морфологическая картина BRCA-ассоциированного РМЖ — инвазивная карцинома неспецифического типа (100% случаев) с низкой степенью дифференцировки (G3 в более 65% случаев, G2 — в 35%). По данным разных авторов [30], частота G3 BRCA-ассоциированных опухолей варьирует от 66 до 84% по сравнению с 30—40% в спорадических формах РМЖ.
Характерны и результаты иммуногистохимического исследования опухолей с мутациями в генах BRCA1, 2. Тройной негативный фенотип был отмечен в 64% случаев (ER-PR-HER2-). В большинстве BRCA-дефицитных опухолей отсутствует экспрессия генов рецептора эстрогена (66% случаев) и прогестерона (76% случаев). Что касается экспрессии гена рецептора эпидермального фактора роста HER2, то в нашем исследовании она отсутствовала в 83% случаев. Менее чем в 12% образцах маркер пролиферативной активности Ki-67 был ниже порогового значения (20%). Полученные результаты коррелируют с обзорными данными литературы [30].
Заключение
Анализ генов BRCA1, 2 особенно актуален для женщин молодого возраста с отягощенным онкологическим анамнезом, чаще инвазивными неспецифическими карциномами G3 и G2, а также тройным негативным фенотипом. В случае отрицательного результата при тестировании на распространенные мутации в славянской популяции должно быть рекомендовано исследование генов BRCA1, 2 методом высокопроизводительного секвенирования NGS, в первую очередь для пациенток с вероятностным характером наследственного заболевания. Данные цифровых лучевых методов диагностики особенно при тройном негативном иммуногистохимическом подтипе демонстрируют признаки доброкачественных изменений, поэтому при выявлении вновь появившихся узловых образований в молочных железах показана их морфологическая верификация.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Н.И. Рожкова, Н.В. Казанцева
Сбор и обработка материала — М.А. Голотюк, А.А. Бережной
Статистическая обработка — А.А. Бережной
Написание текста — М.А. Голотюк, А.А. Бережной, С.А. Шевченко
Редактирование — С.А. Шевченко, А.В. Дорофеев, И.В. Борзунов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.