Введение

2,6-ди(пропан-2-ил)фенол (2,6-бис(пропан-2-ил)фенол, 2,6-бис(изопропил)фенол, 2,6-дипропан-2-илфенол, пропофол, диприван) (2,6-ди(П-2-ил)Ф) — средство для общей анестезии в медицине и ветеринарной практике [1—5]. 2,6-ди(П-2-ил)Ф также применяется в психиатрии для введения пациентов с лечебной целью в состояние амнезии [6]. Описано использование этого диалкилфенола в косметологии [7]. Показана способность 2,6-ди(П-2-ил)Ф ингибировать пролиферацию стволовых клеток жировой ткани [8].

Органолептически 2,6-ди(П-2-ил)Ф характеризуется как прозрачная слегка желтоватая жидкость со слабым специфичным запахом. Эта субстанция плавится и кипит соответственно при температурах 18 и 256 °C. Слабую кислотность 2,6-ди(П-2-ил)Ф характеризует величина pKa, составляющая 11,1 (20 °C), уровень липофильности — величина logP, равная 3,79. Это соединение относительно мало (0,158 г/л) растворимо в воде и хорошо — в толуоле, хлороформе, этилацетате, этаноле, ацетоне. Плотность (0,995 г/см³ при 20 °C) 2,6-ди(П-2-ил)Ф несколько уступает плотности воды [2].

Передозировка 2,6-ди(П-2-ил)Ф в процессе применения может усилить фармакологические и побочные эффекты или вызвать смерть. Внутривенная ЛД₅₀ равна 53 мг/кг (мыши) и 42 мг/кг (крысы). Пероральная ЛД₅₀ (в виде масляного раствора) равна 1230 мг/кг (мыши) и 600 мг/кг (крысы) [9].

В научных источниках и сообщениях средств массовой информации приводятся сведения о летальных отравлениях 2,6-ди(П-2-ил)Ф, явившихся следствием ошибок в лечении, некоторых видов злоупотреблений, а также использования в суицидальных или криминальных целях [10—13].

Таким образом, 2,6-ди(П-2-ил)Ф представляет несомненный интерес как опасный токсикант. Вместе с тем вещество в судебно-химическом отношении изучено недостаточно. Мало изучена локализация 2,6-ди(П-2-ил)Ф у теплокровных при отравлениях с летальным исходом.

Цель исследования — изучение локализации 2,6-ди(П-2-ил)Ф у теплокровных при смертельном отравлении вследствие попадания яда в желудок.

Материал и методы

Изучаемым объектом явился 2,6-ди(пропан-2-ил)фенол (2,6-ди(П-2-ил)Ф) производства Sigma-Aldrich chemistry (США), содержащий 97,0% основного вещества.

В качестве подопытных животных были использованы крысы-самцы в возрасте 3,5—4,0 мес породы Wistar. В составе опытных групп в проведенном исследовании задействовали 25 крыс, масса каждой составляла 270—330 г. Эти подопытные особи были разделены на 5 групп по 5 представителей в каждой. Каждой крысе внутрижелудочно (при помощи зонда) вводили по 1800 мг 2,6-ди(П-2-ил)Ф на 1 кг массы тела животного (приблизительно тройная средняя летальная доза). Вещество вводили в виде раствора в подсолнечном масле. Гибель животных наблюдалась в интервале 30—70 мин с момента ввода отравляющего агента.

Трупы особей вскрывали, из них отбирали ткани и содержимое органов, а также кровь. Пробы одинаковых биоматриц, взятых от погибших крыс одних и тех же групп, объединяли. Объединенные пробы диспергировали (размер получаемых частиц 2—5 мм), перемешивали и брали определенные их навески на анализ. Когда количество объединенной пробы не превышало 20,0 г, ее анализировали целиком. Если это количество было более 20,0 г, то для анализа брали 10,0 г [14].

Проводили определение содержания 2,6-ди(П-2-ил)Ф в полученных аналитических пробах и пересчитывали на 100,0 г биоматериала.

Наряду с этим проводили контрольное исследование на 5 особях группы сравнения.

Изолирование. В каждом случае определяли массу взятой аналитической пробы, после чего к ней добавляли изолирующий агент (смесь этилацетат-ацетон в соотношении 7:3) так, чтобы его количество по массе вдвое превышало массу аналитической пробы, и настаивали 30 мин, каждые 8—10 мин энергично перемешивая смесь.

Жидкую вытяжку сливали с частиц плотного субстрата, фильтруя в коническую колбу. Затем изолировали повторно, придерживаясь вышеописанных условий. Вторую вытяжку объединяли с первой в выпарительной чашке, а затем отгоняли растворитель, поместив чашку в поток воздуха комнатной температуры [15, 16].

Очистка. К остатку в чашке прибавляли 10,0 мл трихлорметана и растворяли остаток при перемешивании. Трихлорметановый раствор дважды по 3 мин встряхивали с порциями (каждая 10,0 мл) щелочного (pH 11,0—11,5) буфера, переводя аналит (в ионизированной форме) из органической фазы в водную. Водно-щелочное извлечение 3 мин встряхивали с 10,0 мл диэтилового эфира, эфирный слой удаляли, а в водный слой добавляли 3,8 г электролита (натрия сульфат), доводили pH раствора до 2—4 24% HCl, а затем экстрагировали молекулярную форму аналита этилацетатом (20,0 мл ×2) и удаляли при 18—22 °C в токе воздуха растворитель из экстракта. Остаток с аналитом подвергали растворению в 2,0—3,0 мл смеси гексан-ацетон (7:3), вводили в растворенной форме в полупрепаративную (190×10 мм) колонку силикагеля L 40×100 мкм и вымывали аналит подвижной фазой гексан-ацетон (7:3). Сбор элюата проводили фракциями по 2,0 мл. Фракции (с 7 по 11 (13,0—22,0 мл)), в которых возможно нахождение 2,6-ди(П-2-ил)Ф, сливали в выпарительную чашку, а растворители испаряли, поместив чашку в поток воздуха комнатной температуры.

Остаток трижды обрабатывали трихлорметаном порциями по 2,0—3,0 мл, последовательно внося образующиеся растворы в мерную колбу на 10,0 мл, а затем доводили жидкое содержимое колбы до метки этим же растворителем. В фарфоровые чашки А и Б помещали по 2,5 мл полученного раствора, трихлорметан испаряли, поместив чашки в поток воздуха комнатной температуры.

Идентификация с использованием метода газовой хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией (ГХ-МС). Остаток из чашки А растворяли в 25,0 мл трихлорметана (раствор 1). Затем 1,0 мл раствора №1 разбавляли до 10,0 мл трихлорметаном в мерной колбе (раствор 2); 4,0 мкл последнего (№2) раствора (хроматографируемая проба) вводили с делением потока 1:2 в колонку DB-5 ms EVIDEX (25 м×0,2 мм) с иммобилизованной фазой (толщина 0,33 мкм), представляющей собой полисилоксан с процентным соотношением метильных и фенильных заместителей 95:5. Для определения использовали газожидкостный хроматограф Agilent Technologies 6850 Network с МС-детектором 5973 Network, выдерживая температуру инжектора 250 °C, интерфейса детектора 300 °C, квадруполя — 150 °C. Температуру колонки с 70 °C (выдержка 3 мин) со скоростью 20 °C/мин повышали до 290 °C. В качестве газа-носителя применяли гелий, пропуская его со скоростью 3/4 мл/мин, молекулы аналита разрушали посредством электронного удара (70 эВ), интервал сканирования составлял 40—400 m/z, регистрацию проводили по полному ионному току.

Идентификация с применением метода тонкослойной хроматографии (ТСХ). Остаток из чашки Б растворяли в 5,0 мл этилацетата. 0,2 мл этого раствора переносили на стартовую линию пластины (10,0×5 см) «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ в виде полосы размерами примерно 4,0 см длиной и 1,0 см шириной. В качестве вещества-свидетеля отдельно на линию старта помещали 2,6-ди(П-2-ил)Ф-стандарт в виде 5,0—10,0 мкл 0,1% этилацетатного раствора в форме круга диаметром около 0,3 см. Пластины высушивали и помещали в предварительно насыщенные парами растворителя хроматографические камеры объемом около 0,6 дм³. Хроматографировали с целью идентификации и одновременной очистки при использовании динамической фазы гексан-диэтиловый эфир (9:1). Затем хроматограммы извлекали из камеры, высушивали 1 мин в токе воздуха комнатной температуры и облучали ультрафиолетовым (УФ) светом с длиной волны 254 нм. Критерием идентификации аналита служила величина абсолютного коэффициента подвижности (Rf).

Идентификация с применением метода УФ-спектрофотометрии. После идентификации методом ТСХ аналит в течение ¼ ч вымывали из сорбента 5,0 мл 95% этанола. Элюат спектрофотометрировали (прибор СФ-2000; l=1,0 см) в диапазоне 200—360 нм, идентифицируя аналит по конфигурации спектра и его экстремумам. В качестве фоновой жидкости использовали элюат, полученный в контрольном опыте.

Количественное определение. По оптической плотности, регистрируемой при аналитической длине волны, вычисляли содержание 2,6-ди(П-2-ил)Ф в биоматрице, используя уравнение регрессии и учитывая операции, предусмотренные методикой.

Результаты и обсуждение

Продолжительность удерживания в капиллярной колонке 2,6-ди(П-2-ил)Ф-стандарта и аналита, выделенного из ряда органов и крови при идентификации методом ГХ-МС, находилась в пределах 5,73—5,77 мин. Вид полученных при этом хроматограмм представлен на рис. 1 и 2. Масс-спектры 2,6-ди(П-2-ил)Ф-стандарта и аналита, изолированного из разных биоматриц трупов отравленных животных, в целом совпадали и содержали комплекс сигналов заряженных осколков, представленный в табл. 1. Предельно обнаруживаемое количество 2,6-ди(П-2-ил)Ф методом ГХ-МС в предлагаемых условиях — 0,01 нг в хроматографируемой пробе.

Рис. 1. Внешний вид газожидкостных хроматограмм 2,6-ди(пропан-2-ил)фенола.

а — выделенного из желудка; б — выделенного из содержимого желудка; в — выделенного из тонкого кишечника с содержимым; г — выделенного из сердца; д — выделенного из мышц; е — вещества-стандарта.

Рис. 2. Внешний вид газожидкостных хроматограмм 2,6-ди(пропан-2-ил)фенола.

а — выделенного из селезенки; б — выделенного из легких; в — выделенного из крови; г — выделенного из почек; д — выделенного из печени; е — вещества-стандарта.

Таблица 1. Особенности масс-спектров 2,6-ди(П-2-ил)Ф, выделенного из биологических объектов

При исследовании извлечений из органов и крови крыс контрольной группы, которым введение 2,6-ди(П-2-ил)Ф не проводилось, это вещество рекомендуемыми методами не обнаруживалось. При длине волны 273 нм (является аналитической) оптическая плотность этанольного элюата из участка хроматограммы, аналогичного участку локализации 2,6-ди(П-2-ил)Ф, не превышала 0,022 единиц оптической плотности (фоновое поглощение остатков эндогенных соединений, извлеченных из 1,0 г биоматрицы и присутствующих в 1,0 мл элюата).

По результатам хроматографирования в тонком слое сорбента пятно аналита на хроматограммах имело светло-лиловую окраску и обладало величиной абсолютного коэффициента подвижности Rf, равной (0,73±0,04), что соответствовало величине этого же коэффициента стандарта 2,6-ди(П-2-ил)Ф.

К особенностям электронного спектра, выявленным в результате изучения поглощающей способности аналита в среде этанола 95%, можно отнести присутствие двух полос поглощения в УФ-области (λ_max.— 218 и 273 нм) (значения молярного коэффициента экстинкции соответственно равны 25019±442 и 1840±26).

Спектры поглощения растворов, полученных при исследовании вытяжек из органов и тканей экспериментальных животных, также соответствовали по форме спектру поглощения раствора стандарта 2,6-ди(П-2-ил)Ф.

В связи с тем, что коротковолновая полоса располагается на границе низковолновой зоны светопропускания этанола и в этой области спектра наиболее выражено поглощение примесей эндогенных соединений биоматрицы, при идентификации аналита наиболее предпочтительно принимать во внимание характеристики полосы поглощения с максимумом 273 нм.

Значения максимумов поглощения (для обеих полос), а также полуширины на половине высоты и фактора асимметрии (для длинноволновой полосы) в электронных спектрах стандарта 2,6-ди(П-2-ил)Ф и этого же вещества, выделенного из биоматриц трупов животных, приведены в табл. 2. Как видно из таблицы, свойства электронного спектра 2,6-ди(П-2-ил)Ф в этаноле делают возможным идентификацию аналита с необходимой селективностью.

Таблица 2. Особенности электронных спектров 2,6-ди(П-2-ил)Ф, выделенного из биологических объектов

Из-за низкого уровня фонового поглощения в области расположения длинноволнового максимума (273 нм; среда этанола) его целесообразно использовать в качестве аналитического для количественного определения аналита методом электронной спектрофотометрии.

На основе измерений уровня поглощения этанольных растворов стандарта 2,6-ди(П-2-ил)Ф различной концентрации в области 273 нм рассчитано уравнение регрессии, имеющее следующий вид:

A=0,010596 C — 0,000355,

где A — оптическая плотность, C — концентрация аналита (мкг/мл) в растворе, подвергающемся фотометрированию.

Результирующие данные, позволяющие оценить характер распределения 2,6-ди(П-2-ил)Ф у теплокровных животных (на примере крыс), отравленных путем внутрижелудочного введения тройной LD₅₀ (600 мг/кг×3) данного токсиканта, приведены в табл. 3.

Таблица 3. Результаты определения 2,6-ди(пропан-2-ил)фенола (2,6-ди(П-2-ил)Ф) в организме теплокровных животных (крысы)

Как видно из представленных результатов, 2,6-ди(П-2-ил)Ф (мг/100 г) в наибольшей степени содержится в содержимом желудка (378,94±41,51) и его тканях (175,20±17,12). Среди остальных биоматриц значительное количество исследуемого токсического соединения обнаружено в сердце (142,79±13,08) и селезенке (117,83±16,23) и несколько меньшие количества — в легких (112,32±29,54) и тонком кишечнике (97,10±11,66). В мышцах, почках, крови и печени 2,6-ди(П-2-ил)Ф распределяется относительно равномерно: найденное количество аналита колеблется в интервале (47,25—79,48)±(4,52—9,44) мг на 100 г биоматериала.

Выводы

1. Изучен характер локализации 2,6-ди(пропан-2-ил)фенола в паренхиматозных (печень, почки, легкие, мышцы, селезенка), полых (сердце, желудок, тонкий кишечник) органах и крови теплокровных животных (крыс), отравленных посредством внутрижелудочного введении тройной средней летальной дозы данного соединения.

2. Разработана схема определения 2,6-ди(пропан-2-ил)фенола в биоматериале на основе изолирования смесью этилацетат-ацетон (7:3), идентификации методами ТСХ, спектрофотометрии и ГХ-МС и количественного определения спектрофотометрическим методом.

3. 2,6-ди(пропан-2-ил)фенол обнаруживался в неизменном виде в крови и во всех исследованных полых и паренхиматозных органах отравленных крыс. Наибольшее количество токсиканта (мг/100 г) найдено в содержимом желудка (378,94±41,51), его тканях (175,20±17,12), сердце (142,79±13,08) и селезенке (117,83±16,23).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.