Рак желудка (РЖ) остается одной из наиболее частых причин смерти от злокачественных опухолей во всем мире [1, 2]. Определение факторов, влияющих на прогноз РЖ, важно как для диагностики, так и для поиска новых схем лечения этого заболевания. Одним из таких факторов является выраженность воспалительных изменений в опухоли и прилежащих тканях. Однако оценка его роли в опухолевой прогрессии неоднозначна. Одни авторы считают, что высокая инфильтрация опухоли и прилежащих тканей иммунными клетками может быть связана с противоопухолевой активностью и с лучшей выживаемостью онкологических больных [3, 4]. Другие предполагают, что опухолеассоциированные лимфоциты и макрофаги могут быть связаны с опухолевой прогрессией [5—8]. При этом следует отметить, что большинство исследований связано с изучением роли Т-лимфоцитов и макрофагов в опухолевой прогрессии [3, 8, 9], тогда как роль В-лимфоцитов остается практически неизученной. В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение особенностей перитуморальной инфильтрации слизистой оболочки желудка (СОЖ) В-лимфоцитами и их связь с клиническими характеристиками РЖ.

В проспективное исследование включены 73 пациента с РЖ, радикально оперированных (R0) в Оренбургском областном клиническом диспансере с января 2009 г. по июль 2010 г. Средний возраст пациентов составил 61,2±9,3 года (от 34 до 78 лет, медиана — 61 год). Мужчин было 43 (58,9%), женщин — 30 (41,1%). Опухоль локализовалась в верхней трети у 14 (19,2%) пациентов, в средней трети — у 18 (24,7%) и нижней трети — у 41 (56,1%). Кишечный тип рака желудка был отмечен у 41 (56,2%) больного и диффузный — у 32 (43,8%). Высокодифференцированная аденокарцинома (G1) наблюдалась у 27 (36,9%) пациентов, умереннодифференцированная (G2) — у 14 (19,3%), низкодифференцированная аденокарцинома и недифференцированный РЖ — у 9 (12,3%) и перстневидно-клеточный рак (ПКР) — у 23 (31,5%). Распределение больных по стадии заболевания было следующим: T1—2N0M0 — у 34 (46,6%), T3N0M0 — у 9 (12,3%), T3—4N1M0 — у 9 (12,3%) и T3—4N2M0 — у 21 (28,6%) больного.

Субтотальная проксимальная резекция была выполнена 10 (13,7%) пациентам, субтотальная дистальная резекция — 56 (76,7%) и гастрэктомия — 7 (9,5%). Лимфаденэктомия в объеме D2 была выполнена всем пациентам, с элементами D3 — 38 (52,0%). У 7 (12,3%) больных произведены комбинированные операции: в 3 наблюдениях была выполнена спленэктомия, в 2 — резекция поперечной ободочной кишки, в одном — холецистэктомия. В исследование не включали больных с декомпенсацией хронических заболеваний, острой инфекционной патологией, выраженными аллергическими процессами, а также получавшие кортикостероиды, антигистаминные, нестероидные противовоспалительные препараты, неоадъювантную химиотерапию.

После удаления препарата желудок вскрывали по большой кривизне. Выполняли биопсию опухоли и макроскопически неизмененной СОЖ, отступя 3—5 см от проксимального края опухоли. Взятые образцы тканей помещали в нейтральный формалин. Материал проводили по стандартной методике и заливали в парафин. Срезы толщиной 4—5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и иммуногистохимически, с использованием антител к CD20 (Epitope Specific Rabbit Antibody, Thermo Fisher Scientific) в разведении 1:400. Материал для исследования иммуногистохимическими (ИГХ) методами фиксировали 10% нейтральным формалином в течение 24 ч, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37 °C в течение 18 ч. Депарафинизацию и демаскировку антигенов проводили в РТ-модуле при температуре 121 °C в течение 20 мин с последующим остыванием 60 мин. В качестве системы визуализации применялась Ultra Vision LP Detection System HRP Polymer & DAB Plus Chromogen. В качестве отрицательного контроля срезы аналогичным образом инкубировали с раствором для разведения антител (UltrAb Diluent). В перитуморальной области полуколичественным методом оценивали наличие очаговых лимфоидных В-клеточных инфильтратов и количество лимфоидных фолликулов (ЛФ) в СОЖ (нет, единичные — не более 2 в поле зрения, множественные — более 2 фолликулов в поле зрения). Также оценивали наличие обычных и атипичных светлых центров в них. Подсчет плотности диффузных В-лимфоцитов осуществляли, используя увеличение 400, на площади 1200×1800 пикс, принятой за условную единицу площади (УЕП), при разрешении 10 пикс/см (0,42×0,28 мм²). Плотность метрической сетки составила 216 точек.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Плотность В-лимфоцитов выражали как среднее (M) ± стандартное отклонение (σ). Сравнение показателей между группами проводили параметрическим и непараметрическим методами (тесты LSD и Манна—Уитни). Взаимосвязь между показателями определяли, используя непараметрические методы (ранговой корреляции по Spearman и гамма). Достоверность различий частот признаков в изучаемых группах оценивали с помощью критерия χ². Анализ общей и безрецидивной 3-летней выживаемости выполняли по методу Каплана—Мейера. Сравнение показателей выживаемости между группами больных проводили с использованием long-rank теста. Различия между показателями считали достоверными при p<0,05.

Изучение особенностей экспрессии CD20 В-лимфоцитов позволило выделить три типа структур, ассоциированных с этим маркером: индивидуальные В-лимфоциты, расположенные диффузно, ЛФ и очаговые лимфоидные инфильтраты (ЛИ). Диффузно расположенные В-лимфоциты были двух типов. Первый тип был представлен клетками округлой формы с четкими, ровными контурами и тонким ободком цитоплазмы (см.рисунок, а, и далее). Второй — клетками неправильной формы с нечеткими контурами, имеющими большое количество цитоплазматических отростков, вследствие чего экспрессия маркера в них казалась фрагментарной (см. рисунок, б). Очаговые Л.И. граничили непосредственно с инвазивным краем опухоли (см. рисунок, в) и состояли преимущественно из клеток второго типа. ЛФ располагались преимущественно в прилежащей к опухоли СОЖ. Были отмечены ЛФ без светлых центров, со светлыми центрами и ЛФ с атипичными светлыми центрами (см. рисунок, г). В отличие от обычных светлых центров атипичные светлые центры были неправильной формы, часто располагались по периферии фолликула и образующие их клетки не экспрессировали СД20.

Плотность диффузных CD20 В-лимфоцитов в зависимости от клинических характеристик РЖ представлена в таблице. Наиболее низкие значения плотности отмечены при низкодифференцированной аденокарциноме и недифференцированном РЖ (G3—G4), при глубине инвазии опухоли Т1—2 и при наличии метастазов в регионарных лимфатических узлах (N1—2). Также были отмечены положительные корреляции плотности диффузных CD20 В-лимфоцитов в опухоли с наличием очаговых ЛИ (ρ=0,634, t=3,28, р=0,005). Плотность диффузных СД20 В-лимфоцитов была выше при наличии ЛИ, чем при отсутствии (49,0±15,4 и 22,9±12,1 клеток на УЕП соответственно, р=0,009). Связи этого показателя с выживаемостью больных РЖ и с локализацией опухоли и типом роста не выявлено.

Наличие очаговых ЛИ отрицательно коррелировало с гистологическим типом (гамма =–0,524, Z=–2,02, р=0,04) и общей 3-летней выживаемостью (гамма =–0,770, Z=–2,60, р=0,01). Очаговые Л.И. чаще наблюдались при диффузном типе РЖ, чем при кишечном (в 46,7 и 21,4% случаев соответственно, р=0,15). Несмотря на то что связи этого показателя с глубиной инвазии опухоли и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах не выявлено, наличие очаговых CD20 ЛИ сопровождалось статистически недостоверным снижением 3-летней общей выживаемости с 94,7 до 70,0% (р=0,07). Однако связи очаговых ЛИ с 3-летней безрецидивной выживаемостью пациентов РЖ не отмечено.

Аналогично, количество ЛФ в СОЖ, прилежащей к опухоли, коррелировало с гистологическим типом (гамма=0,509, Z=2,39, р=0,02) и 3-летней безрецидивной выживаемостью (гамма =–0,636, Z=–2,51, р=0,01). Множественные Л.Ф. чаще встречались при диффузном типе РЖ, чем при кишечном (в 72,7 и 38,9% соответственно, р=0,07), и при их наличии отмечено снижение 3-летней безрецидивной выживаемости с 75 до 40%, р=0,08). В то же время связи этого показателя с 3-летней общей выживаемостью не выявлено.

Наличие ЛФ с атипическими светлыми центрами коррелировало только с выраженностью желудочной дисплазии (гамма =0,833, Z=3,22, р=0,001). Чаще всего они выявлялись при тяжелой степени дисплазии желудочного эпителия (в 50,0 и 12,5% соответственно при наличии или отсутствии и тяжелой или умеренной степени дисплазии желудочного эпителия, р=0,02).

Роль опухолеинфильтрирующих иммунных клеток в прогрессии злокачественных опухолей подтверждена в большом количестве исследований. Полагают, что основные механизмы могут быть связаны с секрецией иммунными клетками цитокинов, хемокинов, факторов роста и протеаз [6, 7, 10], активацией ангиогенеза [4, 5, 11], с участием иммунных клеток в ремодуляции экстрацеллюлярного матрикса, способствующих инвазии опухолевых клеток и метастазированию в отдаленные органы [4, 6]. Роль В-лимфоцитов в опухолевой прогрессии остается малоизученной. Наши результаты свидетельствуют о неоднородности структур, экспрессирующих CD20, в перитуморальной области СОЖ. Они были представлены диффузными В-лимфоцитами, ЛФ и очаговыми Л.И. При этом интересно, что высокая плотность диффузных В-лимфоцитов была статистически значимо связана с начальными стадиями заболевания и не связана с отдаленными результатами лечения РЖ, тогда как наличие очаговых ЛИ и множественных ЛФ было связано с диффузным типом РЖ и ухудшением отдаленных результатов лечения этой патологии.

Данные литературы малочисленны и неоднозначны. Ряд авторов свидетельствуют о том, что повышение количества В-лимфоцитов является прогностически благоприятным признаком, так как связано со специфическим противоопухолевым иммунитетом [12, 13]. Однако другие исследователи отметили, что В-лимфоциты могут способствовать прогрессии злокачественных новообразований. Так, было показано, что в опухолеинфильтрирующих В-лимфоцитах отмечается активация «сигнального белка и активатора транскрипции 3» (STAT3). Известно, что STAT3 играет важную роль в опухолевом ангиогенезе, участвуя в регуляции экспрессии эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF) и других про-ангиогенных факторов [14, 15]. Было показано, что плотность опухолеинфильтрирующих В-лимфоцитов прямо коррелирует с уровнями экспрессии VEGF, матричной металлопротеиназы 9 (MMP9) и фактора, индуцируемого гипоксией 1а (HIF1a) [16, 17]. Увеличение уровня В-лимфоцитов с активированным STAT3 было отмечено при раке желудка, легких, печени, простаты и было связано с ухудшением отдаленных результатов лечения [16]. Кроме того, было показано, что В-лимфоциты и сами могут являться источником VEGF-A, играющего ключевую роль в лимфо- и ангиогенезе [18], а В-лимфоциты, экспрессирующие интерлейкин 10, могут способствовать поляризации М1 макрофагов, обладающих противоопухолевой активностью, в М2 макрофаги, обладающие способностью стимулировать рост и метастазирование злокачественных опухолей [19, 20].

Таким образом, проведенное исследование позволило установить неоднородность структур, экспрессирующих CD20 в перитуморальной области СОЖ при Р.Ж. Полагаем, что отмеченные корреляции СД20, ЛИ и ЛФ с диффузным типом роста опухоли и отдаленными результатами лечения свидетельствуют о важности дальнейших исследований для изучения роли В-лимфоцитов в прогрессии РЖ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.Б.Р.

Сбор и обработка материала: М.А.С.

Написание текста: М.А.С.

Редактирование: А.Б.Р.

Конфликт интересов отсутствует.