МикроРНК являются классом малых некодирующих РНК размером около 22 пар нуклеотидов, выполняющих роль регуляторов экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Принято считать, что микроРНК вызывают репрессию экспрессии генов посредством распознавания комплементарных сайтов в 3’-нетранслируемом регионе мРНК-мишени [1]. На сегодняшний день известно порядка 1000 разновидностей микроРНК у человека. Необходимо отметить, что каждый отдельный вид микроРНК может связываться с различными мРНК-мишенями и, наоборот, мРНК может находиться под контролем сразу нескольких разновидностей микроРНК [2]. Было выявлено, что изменения уровня и активности микроРНК наблюдаются при многих злокачественных новообразованиях [3]. Показано, что дисрегуляция микроРНК может лежать в основе функционирования их в качестве онкогенов и опухолевых супрессоров из-за способности влиять на ход клеточного цикла, а также регулировать выраженность апоптоза, внося, таким образом, вклад в развитие мутационного фенотипа опухоли [4].

Перспективным в плане прикладного использования оценки особенностей уровня микроРНК является тот факт, что микроРНК экспрессируются тканеспецифично, что делает возможным использование данных молекул в дифференциальной диагностике онкологических заболеваний. Так, при анализе профиля микроРНК при раке молочной железы было выявлено повышение уровней miR-21 и miR-155, регистрировалось достоверное снижение miR-125b, miR-145 [5]. Показано, что эктопическая экспрессия miR-21 повышает рост клеток рака молочной железы, способствует увеличению HER-2 опосредованной миграции опухолевых клеток, а также развитию метастазирования [6]. Последние исследования выявили ряд микроРНК при колоректальном раке, которые расцениваются как потенциальные факторы прогнозирования. Определено, что при данном виде новообразования регистрируется снижение miR-150, а у пациентов с достоверно низкими показателями определяется статистически значимое снижение продолжительности жизни [7].

Меланома кожи является высокоагрессивным злокачественным новообразованием, лечение диссеминированных форм которого представляется серьезной проблемой, несмотря на достижения последних лет в отношении разработки лекарственных препаратов на основе ингибирования онкогена BRAF, а также на основе регуляторов иммунного ответа [8]. Сохраняется актуальным вопрос об идентификации прогностических маркеров метастазирования, диагностических маркеров при меланоме кожи. МикроРНК расцениваются как перспективные биомаркеры в связи с тем, что регулируют одномоментно функцию многих генов-мишеней, кодирующих белки; напрямую воздействуют на функциональный продукт гена — мРНК, а также хорошо сохраняются в тканях, фиксированных в формалине и залитых в парафин.

Цель настоящего исследования — исследование характера экспрессии микроРНК при меланоме кожи и меланоцитарных невусах.

Исследование выполнялось на базе ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого», ГБУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского», ГБУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро», утверждено на локальном этическом комитете ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» (протокол № 44/2012 от 15.11.2012).

В исследовании использовали биоптаты от пациентов с меланомой кожи и слизистых и с меланоцитарными невусами. Из 35 пациентов с меланомой кожи и слизистых 29 были с первичной формой меланомы и 6 с рецидивом опухоли. Средний возраст пациентов составил 57 лет. По клинико-морфологическому типу распределение было следующим: поверхностно распространяющаяся меланома кожи составила 51,6%, узловая меланома кожи — 32,3%, лентиго-меланома — 9,7%, акральная лентигинозная — 3,2%, меланома слизистых — 3,2%. В группу пациентов с доброкачественными меланоцитарными новообразованиями кожи вошли 16 человек.

Перед выделением микроРНК из биоптатов кожи оценивали соответствующие срезы от каждого образца, окрашенные гематоксилином и эозином. Выбирали образцы с преимущественным содержанием только опухолевых клеток на срезе. Для выделения микроРНК готовили серийные срезы, заливали ксилолом и инкубировали при температуре 50 °C в течение 30 мин. Затем после центрифугирования удаляли ксилол и дважды промывали в 100% этаноле. В дальнейшем осуществляли выделение РНК с использованием набора Рибозоль В («Амплисенс», Россия). Реакция обратной транскрипции выполнялась со специфичными 5х праймерами («Applied Biosystems», США) к каждой микроРНК, а также с использованием набора Реверта («Амплисенс», Россия). В последующем производилась постановка ПЦР в реальном времени с использованием реакционной смеси TaqMan Universal Master Mix II («Applied Biosystems», США), наборов для детекции микроРНК TaqMan MicroRNA Assays hsa-let-7b-5p, hsa-miR-155−5p, hsa-miR-205, hsa-miR-21−5p, hsa-miR-200c. Нормализацию сигнала осуществляли с помощью U6 snRNA («Applied Biosystems», США). Определяли величину Сt, соответствующую количеству циклов, при которых кривая флюоресценции пересекала заданный уровень фона. Каждый эксперимент выполняли в двух технологических повторах с дальнейшим расчетом среднего значения.

Сравнения уровней экспрессии микроРНК в исследуемых группах проводили с использованием непараметрического дисперсионного анализа Краскела—Уоллиса, при получении p<0,05 переходили к многогрупповым сравнениям. Различия показателей при многогрупповых сравнениях считали достоверными при p<0,05.

Выполненное исследование показало достоверное изменение экспрессии miR-205 при меланоме кожи по сравнению с доброкачественными меланоцитарными новообразованиями (табл. 1). При этом отмечено статистически значимое снижение miR-205 при сравнении результатов экспрессии не только в группах пациентов с невусами и с меланомой кожи, но и при сравнении результатов экспрессии у всех пациентов с меланомой кожи и у пациентов с невусами (р<0,05). Выявлена тенденция к увеличению уровня экспрессии микроРНК у пациентов с первичной меланомой кожи и рецидивом опухоли (см. рисунок). Достоверных изменений уровня экспрессии других микроРНК выявлено не было.

Полученные результаты указывают, что изменения уровня микроРНК в опухолевой ткани неоднозначны. Так, в публикациях [2, 9] отмечено выявление изменений miR-let-7b при оценке микроРНК, выделенных из тканей, заключенных в парафиновые блоки. D. Philippidou и соавт. [10] показали изменения miR-155 между неметастазирующей и диссеминированной формами меланомы кожи V. Grignol и соавт. [11] выявили, что, помимо увеличения уровня в 8 раз по сравнению с доброкачественными меланоцитарными новообразованиями кожи, miR-21 регулирует миграцию, выживаемость и инвазивный рост клеток меланомы. В то же время в нашем исследовании статистически значимых различий экспрессии вышеуказанных микроРНК выявлено не было. С учетом потенциально возможного использования микроРНК в качестве прогностических и диагностических маркеров сохраняется актуальность дальнейшей сравнительной оценки экспрессионных профилей микроРНК независимыми научными лабораториями для отбора актуальных молекул-маркеров.

С учетом данных литературы о нарушениях экспрессии микроРНК при меланоме кожи, в том числе в изолированных культурах клеток меланомы, стоит предположить, что отсутствие изменений уровня микроРНК в клетках меланомы в данном исследовании может быть обусловлено гетерогенностью опухолевой ткани, наличием клонального/эпигенетического разнообразия в пределах одной опухоли, которые могут обеспечивать дискоординированный паттерн экспрессии микроРНК в опухолевых клетках и как следствие отсутствие изменений суммарного уровня микроРНК в опухоли. Косвенно этот факт может подтверждать результаты, полученные в отношении miR-205: определялись статистически достоверные изменения в клетках первичной меланомы по сравнению с доброкачественными меланоцитарными новообразованиями, но отсутствовали таковые при сравнении результатов в невусах и клетках рецидивирующей меланомы. Известно, что рецидивирующие опухоли характеризуются высоким уровнем нестабильности генома, что обеспечивает мутационный фенотип, а также особым микроокружением, результатом взаимодействия с которым, в том числе, является рецидив опухоли [12].

В настоящем исследовании выявлено, что уровень miR-205 в рецидивирующих опухолях не отличался от показателей контрольной группы, что может быть обусловлено вышеуказанными процессами. С другой стороны, выявленные изменения miR-205 свидетельствуют о нарушении функциональной активности данной микроРНК. Так, в нескольких исследованиях показано, что miR-205 функционирует в качестве онкосупрессора в равной степени, как и miR-200c [13]. Выявлено, что два вышеуказанных вида микроРНК были единственными из 735 тестированных в материалах меланомы кожи, выделенных из парафиновых блоков и показавших статистически достоверное снижение при меланоме по сравнению с невусами, а также статистически значимые различия между первичными меланомами и метастазами. При этом дальнейшие исследования in vitro для оценки интенсивности пролиферации, инвазивного роста в трансфектированных клетках меланомы кожи с повышенной экспрессией miR-205, miR-200c не дали достоверных различий с контролем.

Нами не было выявлено различий в характере экспрессии микроРНК в зависимости от клинико-морфологической формы меланомы кожи (табл. 2), что может указывать на универсальный тканеспецифичный характер изменений профиля микроРНК при развитии патологических изменений, а также на необходимость дальнейших исследований возможной связи между вышеуказанными факторами.

Исследование поддержано Российским фондом фундаментальных исследований (Р.Т.Г. 13−04−01381), грантом фонда Президента Р.Ф. (Р.Т.Г. МД-901.2013.7).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Т.Г.Р.

Выполнение эксперимента: Ю.И.Ш., Н.В.П.

Статистическая обработка данных: Н.В.П., М.Б.А., Ю.И.Ш.

Написание текста: Т.Г.Р.