Волченко Н.Н.

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена, Москва

Славнова Е.Н.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздрава России

Флюоресцентная in situ гибридизация для определения амплификации гена HER2 при цитологическом исследовании у больных раком молочной железы

Авторы:

Волченко Н.Н., Славнова Е.Н.

Подробнее об авторах

Прочитано: 1878 раз


Как цитировать:

Волченко Н.Н., Славнова Е.Н. Флюоресцентная in situ гибридизация для определения амплификации гена HER2 при цитологическом исследовании у больных раком молочной железы. Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. 2014;3(1):30‑32.
Volchenko NN, Slavnova EN. Fluorescence in situ hybridization for the determination of HER2 gene amplification during cytological study in patients with breast cancer. P.A. Herzen Journal of Oncology. 2014;3(1):30‑32. (In Russ.)

Рекомендуем статьи по данной теме:
Воз­мож­нос­ти ци­то­ло­ги­чес­кой ди­аг­нос­ти­ки он­ко­ци­тар­ных и он­ко­ци­то­ид­ных по­ра­же­ний слюн­ной же­ле­зы. Он­ко­ло­гия. Жур­нал им. П.А. Гер­це­на. 2024;(4):11-21
Ве­ду­щие тен­ден­ции за­бо­ле­ва­емос­ти ра­ком мо­лоч­ной же­ле­зы в Рес­пуб­ли­ке Крым. Он­ко­ло­гия. Жур­нал им. П.А. Гер­це­на. 2024;(4):42-47
Кап­су­ляр­ная кон­трак­ту­ра пос­ле ре­конструк­тив­но-плас­ти­чес­ких опе­ра­ций по по­во­ду ра­ка мо­лоч­ной же­ле­зы. Он­ко­ло­гия. Жур­нал им. П.А. Гер­це­на. 2024;(6):78-83
Экспрес­сия тран­сфер­ри­но­вых ре­цеп­то­ров 1 и β1-ин­тег­ри­нов кор­ре­ли­ру­ет со ста­ту­сом ре­цеп­то­ров эс­тро­ге­нов и им­мун­ной ин­фильтра­ци­ей при ра­ке мо­лоч­ной же­ле­зы. Ар­хив па­то­ло­гии. 2024;(4):23-30
Ин­до­ци­анин зе­ле­ный — не­отъем­ле­мая часть ре­конструк­тив­ной хи­рур­гии мо­лоч­ной же­ле­зы с ис­поль­зо­ва­ни­ем пер­фо­ран­тных лос­ку­тов. Хи­рур­гия. Жур­нал им. Н.И. Пи­ро­го­ва. 2024;(8):34-40
Вли­яние прог­рам­мы кар­ди­орес­пи­ра­тор­ных тре­ни­ро­вок на уро­вень мо­ле­кул меж­кле­точ­ной ад­ге­зии у па­ци­ен­ток с пос­тмас­тэк­то­ми­чес­ким син­дро­мом. Воп­ро­сы ку­рор­то­ло­гии, фи­зи­оте­ра­пии и ле­чеб­ной фи­зи­чес­кой куль­ту­ры. 2024;(4):45-51
Диаг­нос­ти­чес­кая цен­ность флю­орес­цен­тной лим­фог­ра­фии для би­оп­сии сиг­наль­ных лим­фа­ти­чес­ких уз­лов при ра­ке мо­лоч­ной же­ле­зы. Обоб­ща­ющий опыт нес­коль­ких спе­ци­али­зи­ро­ван­ных цен­тров. Хи­рур­гия. Жур­нал им. Н.И. Пи­ро­го­ва. 2024;(10):49-61
Ког­да мас­тэк­то­мия не­из­беж­на, или сво­бод­ная пе­ре­сад­ка сос­ко­во-аре­оляр­но­го ком­плек­са в со­че­та­нии с ре­конструк­ци­ей. Плас­ти­чес­кая хи­рур­гия и эс­те­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2024;(4):60-64
Слож­ный слу­чай ре­конструк­ции мо­лоч­ной же­ле­зы пос­ле вы­пол­не­ния од­но­мо­мен­тной ауто­ло­гич­ной ре­конструк­ции и раз­ви­тия ли­по­нек­ро­за лос­ку­та. Плас­ти­чес­кая хи­рур­гия и эс­те­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2024;(4):77-83
Экспрес­сия бел­ка NDRG1 в об­раз­цах ра­ка мо­лоч­ной же­ле­зы, вза­имос­вязь с ре­ги­онар­ным ме­тас­та­зи­ро­ва­ни­ем. Ар­хив па­то­ло­гии. 2024;(6):36-42

Применение таргетной терапии в лечении онкологических больных обусловило необходимость в повседневной клинической практике определения молекулярных мишеней лекарственных препаратов. Одним из таких препаратов является герцептин (транстузанаб), представляющий рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело, связывающееся с рецепторами 2-го типа человеческого эпидермального фактора роста HER2 на поверхности опухолевых клеток. Высокая эффективность герцептина обусловлена как прямой цитотоксичностью, так и непосредственным блокированием пролиферации, стимуляцией апоптоза, антиангиогенной активностью. Онкоген HER2 расположен в хромосоме 17 (17q21). Гиперэкспрессия онкопротеина HER2/neu, связанная с амплификацией гена HER2, встречается в 10—30% инвазивных раков молочной железы с плохим прогнозом, но, с другой стороны, эти опухоли поддаются лечению герцептином [1, 2, 4]. Экспрессия онкопротеина HER2/neu может определяться иммуноцитохимически. При неопределенном (2+) иммуноцитохимическом герцепт-статусе для определения наличия либо отсутствия амплификации гена HER2 необходимо применять метод гибридизации in situ.

Гибридизация in situ — это метод прямого выявления нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в клеточных структурах. Метод позволяет определить специфические нуклеотидные последовательности непосредственно в клетках, так как зонд наносят прямо на клеточный образец, содержащий генетический материал, при этом морфология изучаемых клеток не меняется [3, 5].

Целью настоящего исследования явилась разработка метода FISH (флюоресцентной in situ гибридизации) для определения амплификации гена HER2 при предоперационном цитологическом исследовании тонкоигольных аспирационных биоптатов у больных инвазивным протоковым раком молочной железы (РМЖ).

Исследовали аспирационные тонкоигольные биоптаты у 110 больных инвазивным протоковым РМЖ, проходивших лечение в МНИОИ им. П.А. Герцена. Клеточный материал (после пункции) помещали в специальную питательную среду накопления, в микропробирку, содержащую 800 мкл среды. Взвесь клеток распределяли по 50—100 мкл в контейнеры центрифуги системы Сytospin-3 («Shandon», Великобритания) и центрифугировали в режиме 1000 об./мин в течение 5 мин. Полученные препараты использовали для иммуноцитохимических (ИЦХ) реакций с антителами к онкопротеину с-erbB-2 (HER2/neu) («Dako») и метода FISH с использованием коммерческого набора HER2 FISH («Dako»). Предварительно проводили контроль качества полученных монослойных мазков, для чего два цитопрепарата окрашивали рутинным методом по Лейшману для цитологического анализа. При наличии в мазках достаточного количества исследуемого клеточного материала (не менее 300 клеток), проводили иммунохимическую реакцию и FISH-реакцию на оставшихся неокрашенных цитопрепаратах.

Интенсивность ИЦХ-экспрессии антител с-erbB-2(HER2/neu) оценивали полуколичественно. После проведения иммуноцитохимической реакции с антителами к онкопротеину с-erbB-2 (HER2/neu) изучали мембранное окрашивание. Отрицательной ИЦХ-реакцией (0) считали отсутствие мембранного окрашивания или выявление его менее чем в 10% клеток (рис. 1,). Окрашивание слабой интенсивности мембран более чем 10% клеток опухоли оценивали как 1+ (рис. 2,). Неопределенной ИЦХ-реакцией (2+), требующей проведения FISH-исследования, являлось умеренное мембранное окрашивание более 10% клеток опухоли или сильное мембранное окрашивание менее 30% опухолевых клеток (рис. 3,). Положительной ИЦХ-реакцией (3+) считали сильное полное мембранное окрашивание более 30% опухолевых клеток (рис. 4,). Никогда не принимали во внимание окрашивание цитоплазмы.

Рис. 1. Инвазивный протоковый РМЖ. Иммуноцитохимия. Отсутствие экспрессии онкопротеина (0). ×200.

Рис. 1. Экспрессия белка пролиферативной активности Ki-67 в клетках РМЖ. ×100.

Рис. 2. Инвазивный протоковый РМЖ. Иммуноцитохимия. Слабая экспрессия онкопротеина (1+). ×200.

Рис. 2. Экспрессия онкопротеина с-erbB-2 в клетках РМЖ (+2). ×200.

Для определения амплификации гена HER2 проводили флюоресцентную гибридизацию in situ. Для исследования использовались флюоресцентные зонды HER2 FISH («Dako»). Цитологический материал, прочно зафиксированный на высокоадгезивных предметных стеклах, обрабатывали пепсином, чтобы облегчить проникновение зонда к ядерной ДНК. Благодаря нагреванию происходила денатурация ДНК и последующая гибридизация одноцепочечной ДНК, комплементарной к внесенному зонду. Несвязавшиеся зонды затем отмывали и проводили анализ FISH-реакции с помощью флюоресцентного микроскопа Axio Imager A1 («Zeiss»).

Оценку наличия амплификации гена HER2 проводили путем подсчета количества сигналов, которыми помечен ген HER2 (красный сигнал) и сигналов, метящих центромерный участок 17-й хромосомы (зеленый сигнал). Сигналы визуализировали с помощью флюоресцентного микроскопа. Определяли среднее значение количества копий гена HER2 на ядро. Подсчитывали соотношение красных и зеленых меток в 20 ядрах.

1. Если среднее значение количества копий гена HER2 более 6 на ядро или соотношение красных меток к зеленым 2,2 и более, то констатировали наличие амплификации.

2. Если среднее значение количества копий гена HER2 менее 4 на ядро или соотношение красных меток к зеленым менее 1,8, то констатировали отсутствие амплификации.

3. Если среднее значение количества копий гена HER2 4—6 на ядро или соотношение красных меток к зеленым 1,8—2,2, констатировали наличие неопределенного HER2-статуса, что требовало дополнительного исследования не менее 40 опухолевых ядер или повторения FISH-реакции.

В результате проведенного исследования в 22 случаях РМЖ ИЦХ-реакцию оценили как 3+, в 11 — 2+, что требует проведения FISH-реакции, в 66 — ИЦХ-реакция была слабой интенсивности (+) и в 11 — экспрессия отсутствовала (0).

При проведении FISH-реакции во всех 22 случаях РМЖ с ИЦХ-реакцией 3+ обнаружили амплификацию гена HER2 (рис. 5,), в 77 случаях с отрицательной и слабо положительной ИЦХ-реакцией амплификация не выявлена (рис. 6,). В группе 2+ амплификация гена HER2 была обнаружена у 7 больных и в 4 случаях она отсутствовала (таблица).

Рис. 3. Инвазивный протоковый РМЖ. Иммуноцитохимия. Умеренная экспрессия онкопротеина (2+). ×200.

Рис. 3. Экспрессия Р.Э. в клетках РМЖ: 8 баллов. ×200.

Сравнение гормонального и HER2-статуса при раке молочной железы показало следующие данные. У 23 (79%) из 29 больных инвазивным протоковым РМЖ с наличием амплификации гена HER2 экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона отсутствовала. У 71 (87,5%) из 81 больной инвазивным РМЖ неспецифического типа с отсутствием амплификации гена HER2 наблюдалась экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона.

Таким образом, проведенное исследование показало возможность FISH-метода для определения амплификации гена HER2 на цитологических препаратах до начала какого-либо лечения и необходимость ее подтверждения при умеренно выраженной (2+) иммуноцитохимической экспрессии HER2/neu.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.