Введение

Гипертрофически измененные глоточные миндалины (носоглоточные миндалины) входят в состав кольца лимфоидной ткани (кольца Пирогова—Вальдейера). Эта патология может возникать у детей в возрасте от 2 до 12 лет, нередки различные коморбидные состояния, когда размер ткани становится чрезмерным для занимаемого ею пространства носоглотки [1]. Как правило, гипертрофия глоточной миндалины (ГГМ) исчезает к 16 годам [2]. ГГМ может приводить к обструкции верхних дыхательных путей и, как следствие, затруднению носового дыхания, что может быть связано с нарушениями сна, гипоназальной речью, храпом [1]. Пациентов с ГГМ можно лечить как хирургическим способом (аденотомия), так и консервативно (топические назальные глюкокортикостероиды) [3—6]. Правильная и своевременная диагностика патогенеза развития ГГМ необходима для верного выбора тактики лечения этого заболевания, так как хирургический метод не всегда необходим и, в случае аллергической природы ГГМ, может привести не только к викарной гипертрофии трубных миндалин, но и к развитию хирургического стресса, что было показано в ряде экспериментальных [7—10] и клинических исследований [11—15].

В силу анатомического расположения ткань глоточной миндалины связана с различными патогенными факторами. Ткань глоточной миндалины участвует в работе иммунной системы слизистой оболочки глотки [16] и связана с гуморальным и клеточным ответом [17]. Секретируя антитела, B-лимфоциты играют важную роль. В то же время различные субпопуляции B-лимфоцитов способны подавлять иммунный ответ [18]. Цитокины обладают способностью контролировать стимуляцию, активацию, пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов [19]. Предыдущие исследования показали, что интерферон-γ (IFNγ), интерлейкины (IL-2, IL-4, IL-10 и IL-12) и кахектин-α (TNFα) могут контролировать и усиливать локальный иммунный ответ в глоточной миндалине [20]. Активируя CD8+ T-лимфоциты, IL-10 может оказывать иммуностимулирующее действие на B-лимфоциты [21]. Есть данные, что IL-10 оказывает прямое влияние на B-лимфоциты, включая предотвращение апоптоза, усиление пролиферации и дифференцировки плазматических клеток [22]. Кроме того, у детей с хроническим тонзиллитом и ГГМ выявлено повышение уровня провоспалительных цитокинов, в том числе IL-10 [23]. Цитокин IL-10 играет важную иммунорегуляторную и противовоспалительную роль. Цитокин IL-10 кодируется геном интерлейкина 10 (IL-10), который является высокополиморфным. Генетический полиморфизм IL-10 находится в проксимальной области, включая rs1800896, rs1800871 и rs1800872, образуя различные гаплотипы, связанные с продукцией IL-10 [24].

Некоторые данные свидетельствуют о том, что ткань глоточной миндалины может быть резервуаром бактерий и вирусов из-за специфического расположения глоточной миндалины [3, 16]. Так, в небных и глоточной миндалинах детей были обнаружены ЦМВ, герпесвирус 6 типа и вирус Эпштейна—Барр (ВЭБ) [25, 26]. Члены семейства Herpesviridae подразделяются на подсемейства Alphaherpesvirinae (α), Betaherpesvirinae (β) и Gammaherpesvirinae (γ) [27]. Вирусы простого герпеса 1, 2 и ветряной оспы относятся к подсемейству Alphaherpesvirinae, тогда как цитомегаловирус (ЦМВ), вирусы герпеса человека 6 и 7 относятся к подсемейству Betaherpesvirinae [28]. В то же время к подсемейству Gammaherpesvirinae относятся ВЭБ и вирус герпеса человека 8 типа. В течение жизни каждый человек может быть инфицирован одним или несколькими герпесвирусами [29]. Характерно, что вирусы герпеса сохраняются в организме хозяина в виде пожизненной инфекции после первичной инфекции. В то же время тяжелое течение заболевания и смертность, вызванные подсемействами Alphaherpesvirinae (α) и Betaherpesvirinae (β), отмечаются редко [29].

До сих пор исследования в основном были сосредоточены на генетических полиморфизмах IL-10 и их связи с опухолевыми заболеваниями [30—33]. Поэтому в некоторых исследованиях поднимается вопрос о возможности использования полиморфизма IL-10 rs1800872 и IL-10 rs1800896 в качестве генетических биомаркеров рака желудка [30]. Другое исследование предполагает, что аллель IL-10-1082 G может коррелировать с наличием плоскоклеточного рака [31]. По данным других авторов, полиморфизм IL-10 может играть существенную роль в развитии рака предстательной железы [32]. Сообщается о роли генетического полиморфизма IL-10 (rs1800896-1082G/A) в устойчивости к герпесвирусным инфекциям [34]. Кроме того, предполагалось, что восприимчивость к опоясывающему герпесу определяется генетически [35]. Была проведена ограниченная и предварительная работа для оценки роли генетического полиморфизма IL-10 и инфекции HHV6, CMV и вируса Эпштейна—Барр в ГГМ у детей. Поэтому основной целью настоящего исследования была оценка роли полиморфизма гена IL-10 rs1800896 и инфекций HHV6, CMV и EBV у детей с АГ.

Пациенты и методы

В исследование были включены 144 пациента в возрасте от 2 до 11 лет, 80 (55,5%) мальчиков и 64 (45,5%) девочки, находившиеся на обследовании в оториноларингологическом отделении клиники Витерра с предварительным диагнозом ГГМ в период с декабря 2019 по апрель 2020 г. По результатам эндоскопического исследования носа и боковых рентгенограмм дети были разделены на три группы. В основную группу вошли пациенты с ГГМ (n=106), в группу сравнения — пациенты без ГГМ (n=38).

Основная группа с ГГМ была разделена на три подгруппы в зависимости от размеров глоточной миндалины. Размер глоточной миндалины определяли по расстоянию между сошником и тканью глоточной миндалины [36]. В первую подгруппу (n=28) вошли пациенты с ГГМ 1-й степени, у которых глоточные миндалины занимали только верхний сегмент в носоглоточной полости. Во вторую подгруппу (n=39) вошли пациенты с ГГМ 2-й степени, у которой глоточные миндалины занимали верхнюю половину носоглоточной полости. В третью подгруппу (n=32) вошли пациенты с ГГМ 3-й степени (максимальная гипертрофия глоточной миндалины), у которых ГГМ распространялась на носоглоточную полость с обструкцией хоан [36]. Диагноз ГГМ устанавливали на основании эндоскопии полости носа и носоглотки и/или результатов рентгенографии носоглотки в боковой проекции, а также характерного анамнеза (храп, хроническое дыхание через рот, апноэ во сне, средний отит). В общей сложности 104 пациентам была выполнена фиброназофарингоскопия, а 40 пациентам была проведена рентгенография носоглотки в боковой проекции. Из исследования были исключены пациенты с острой инфекцией в полости носа и/или в носоглотке. Оценка каждого пациента включала анамнез заболевания и результаты опроса по симптомам. Были получены информированные согласия родителей до проведения исследования.

Инструментальная диагностика. Боковое рентгенографическое исследование шеи. Предыдущее исследование показало, что использование рентгенографии носоглотки в боковой проекции остается очень надежным и достоверным диагностическим тестом для оценки гипертрофия глоточной миндалины [37]. Кроме того, некоторые исследования показали хорошее соответствие между рентгенологическими и эндоскопическими данными [38]. Для оценки проходимости дыхательных путей выполнялась боковая рентгенограмма шеи по стандартной методике. Рентгенограммы получены на цифровом рентгенографическом комплексе Sitec DigiRAD-FP (Япония). Соотношение гипертрофии глоточной миндалины и носоглотки (коэффициент AH) выражает размер глоточной миндалины; эти отношения были получены с помощью простых линейных измерений по боковым рентгенограммам черепа [39]. Коэффициент АН рассчитывали как отношение расстояния между крайней точкой передней выпуклости тени глоточной миндалины и прямой частью переднего края основного затылка к расстоянию между клиновидно-затылочным синхондрозом и задним концом твердого неба [40].

Фиброназофарингоскопия. Волоконно-оптическая эндоскопия чрезвычайно информативна при оценке размеров глоточной миндалины [41]. Однако применение этого метода возможно не у всех пациентов из-за малого возраста ребенка или его сверхвозбудимости. Волоконно-оптическую видеориноскопию (Pentax Europe GmbH, Германия), проводимую одним и тем же оториноларингологом, использовали для получения полного изображения хоан. Перед выполнением назальной гибкой эндоскопии у всех пациентов применяли местную анестезию и вазоконстрикцию, без какой-либо седации.

Данные опроса родителей. В анкете родителям испытуемых задавали вопрос о наличии у детей аллергических заболеваний, лекарственной аллергии, пищевой аллергии, хронических заболеваний, как часто их дети болели в течение года, какова продолжительность заболевания и продолжительность грудного вскармливания.

Молекулярно-генетическое исследование. Исследовали полиморфизм G-1082A (rs1800896) гена IL-10 (местоположение: 1q32.1).

Кроме того, определяли наличие в организме трех вирусов (см. таблицу).

Исследуемые типы вирусов герпеса человека

ВЭБ также известен как вирус герпеса человека 4 (HHV-4). Клетки-мишени ВЭБ включают B-лимфоциты и эпителиальные клетки [42]. ЦМВ также называют вирусом герпеса человека 5 (HHV-5). Основными клетками-мишенями ЦМВ являются эпителиальные клетки, моноциты и лимфоциты [43]. Вирус герпеса человека 6 (HHV-6) принадлежит к роду Roseolovirus подсемейства Betaherpesvirinae. Выделяют два варианта HHV-6 — HHV-6A и HHV-6B [44]. И HHV-6A, и HHV-6B проявляют тропизм к CD4+ Т-лимфоцитам [45].

Выделение ДНК. Для генотипирования геномную ДНК из периферической крови детей выделяли с помощью набора для ручного выделения геномной ДНК крови («Синтол», Россия) в соответствии с протоколом. Объем для выделения ДНК составлял 200 мкл, а выход ДНК составлял 10 мкг. Для оценки наличия вирусов были взяты образцы мазков из полости носа. Назальный секрет собирали стерильным стержневым мазком из носа, соблюдая правила асептики.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для изучения полиморфизма гена IL-10 G-1082A (rs1800896) использовали метод ПЦР в реальном времени с применением коммерчески доступных наборов («Синтол», Россия). В каждом наборе используют два аллель-специфических зонда, которые позволяют обнаруживать два аллеля полиморфизма. Использование аллель-специфичной ПЦР в одной пробирке уменьшило количество реакций и конкуренцию аллель-специфичных праймеров при отжиге на матрице, а также позволило лучше разделить аллели гомозиготных генотипов. Рост флуоресценции наблюдали в канале красителя FAM для обнаружения «нормального» генотипа G/G образца дикого типа. Рост флуоресценции наблюдался в канале красителя FAM и R6G при выявлении гетерозиготного генотипа G/A. Рост флуоресценции наблюдался в канале красителя R6G при выявлении гомозигот мутантного типа генотипа А/А. Условия количественной ПЦР были следующими: 95 °C, 3 мин; 70 °C, 15 с, 60 °C, 40 с, 40 циклов. Мы использовали термоциклер CFX96 (Bio-Rad, США) с программным обеспечением CFX Manager TM.

Вирусы определяли количественной ПЦР в реальном времени в соответствии с протоколом (artus HHV-6 RG PCR Kit QIAGEN, Германия). Зонды, специфичные для ДНК HHV-6A, были помечены флуорофором FAM™, а зонды, специфичные для ДНК HHV-6B, были помечены флуорофором, имеющим те же характеристики, что и Cy5. Зонд, специфичный для внутреннего контроля, был помечен флуорофором JOE. Вирусную нагрузку ЦМВ определяли в первых положительных образцах плазмы (мультиплексная ПЦР) с использованием набора для ПЦР Artus CMV RG (Qiagen, Германия) и инструментов Rotor-Gene Q (RGQ) в соответствии с рекомендациями производителя. Выявление ДНК ВЭБ проводили с использованием набора для ПЦР Artus EBV RG.

Статистическая обработка. Для анализа полученных данных были использованы R-language и статистическое программное обеспечение SPSS версии 20. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей между группами проводили с помощью критерия χ² и точного критерия Фишера. Различия считали достоверными при p<0,05. Рассчитывали отношение шансов (ОШ) и 95% доверительный интервал (ДИ).

Результаты и обсуждение

Пациенты. Фиброназофарингоскопия была выполнена 104 пациентам, а 40 пациентов прошли боковую рентгенографию носоглотки. На результатах боковой цефалометрической рентгенографии левая сторона представляет носоглотку пациента без ГГМ, а правая сторона представляет носоглотку с ГГМ.

Из 40 рентгенологических случаев у 10 (25%) больных были обнаружена ГГМ с минимальной степенью, у 16 (40%) — увеличение средней степени, у 12 (30%) — ГГМ в максимальной степени. ГГМ не была обнаружена у 2 (5%) пациентов с предшествующей аденоидэктомией в анамнезе.

Результаты опроса родителей. Мы не обнаружили существенных различий между группами с ГГМ и без нее по лекарственной аллергии, носовым кровотечениям и атопическому дерматиту. Значимые различия выявлены для аллергических заболеваний, включая аллергический ринит и пищевую аллергию, хронический отит и хронический тонзиллит. Аллергические заболевания чаще встречались у больных с ГГМ (основная группа) по сравнению с больными без ГГМ. Аллергическая болезнь преобладала в 1-й и 2-й подгруппах. Среди аллергических заболеваний частота только аллергического ринита была выше у детей с ГГМ (основная группа), чем без ГГМ (группа сравнения). Процент аллергического ринита был больше в первой подгруппе больных ГГМ по сравнению со 2-й и 3-й подгруппами.

Анализ персистенции вирусной инфекции. Всего было собрано и исследовано 144 образца назофарингеального секрета для определения вируса герпеса человека-6, ВЭБ и ЦМВ.

У 81 (56%) из 144 пациентов отмечено инфицирование как минимум одним вирусом. Возраст этих пациентов составил менее 11 лет. Наиболее часто встречался HHV6 (80 пациентов, 55,6%), затем ВЭБ (22 пациента, 15,3%) и ЦМВ (21 пациент, 14,5%).

Rs1800896 полиморфизм гена IL-10. Распределение генотипов IL-10 rs1800896 в контрольной группе и у детей с ГГМ достоверно различалось (χ²=6,71, p=0,03). Частота аллеля А не имела достоверных различий между контрольной группой и детьми с ГГМ (χ²=0,79, p=0,37). Частота генотипа GG имела тенденцию к увеличению в контрольной группе по сравнению с основной группой детей.

Распределение генотипов для полиморфизма rs1800896 гена IL-10 достоверно различалось между тремя подгруппами больных с ГГМ (p≤0,002). Частоты двух аллелей показали достоверное различие между двумя подгруппами: II и III (χ²=6,04, p=0,01) и I и III (χ²=7,87, p=0,005). Достоверно более высокие частоты аллеля G и генотипов GG IL-10 (rs1800896-1082G/A) выявлены в первой подгруппе детей по сравнению с третьей подгруппой. Достоверно более высокие частоты генотипов ГГМ выявлены во 2-й подгруппе по сравнению с 1-й и 3-й подгруппами больных. Частоты генотипов АА были выше в 3-й подгруппе больных по сравнению с 1-й и 2-й подгруппами.

Исследование показало, что частоты HHV6 и ЦМВ в контрольной и основной группах имели существенные различия. HHV6 был наиболее часто выявляемым вирусом у больных ГГМ по сравнению с ЦМВ и ВЭБ. Среди трех подгрупп детей с ГГМ HHV6 и ВЭБ чаще выявлялись в 3-й подгруппе детей. В то же время мы не обнаружили существенных различий в распространении ЦМВ между тремя подгруппами. В некоторых исследованиях изучалось наличие ВПГ, ВЭБ и ЦМВ в тканях глоточной миндалины детей с ГГМ и хроническим аденоидитом [46—48]. Вирус герпеса 8 типа в небных и глоточной миндалинах у детей был обнаружен и показан в исследовании [25]. В то же время другое исследование показало, что ВЭБ обладает тропностью к носоглотке, и у детей старше 25 мес больше шансов стать носителями этого вируса [49]. Вирусы герпеса с высокой частотой обнаруживались в ткани глоточной миндалины детей с ГГМ. Авторы статьи отмечают возможную связь между возникновением ГГМ у больных и наличием герпесвирусов [33]. Наши результаты также предполагают потенциальную связь между наличием HHV6 и CMV и возникновением ГГМ. В проведенном нами исследовании мы показали, что HH6 и EBV могут влиять на развитие у детей максимального размера ГГМ.

Еще одним примечательным открытием этого исследования стало распределение генотипов IL-10 rs1800896 в контрольной и основной группах. Частота генотипа GG была выше в контрольной группе детей. Достоверно более высокие частоты аллеля G и генотипов GG выявлены в 1-й подгруппе детей по сравнению со 2-й и 3-й подгруппами. Мы обнаружили достоверно более низкие частоты аллеля G и генотипов GG и GA в 3-й подгруппе детей по сравнению со 2-й подгруппой. Предыдущие исследования показали значительно более высокие частоты аллеля А и генотипов АА и AG IL-10 (rs1800896-1082G/A) у пациентов, устойчивых к HHV8- и ЦМВ-инфекциям, по сравнению с инфицированными [34]. Опубликованы данные, что аллель IL-10-1082 G значительно чаще отмечен у пациентов с опоясывающим герпесом [50]. Интересно, что другие исследователи показали, что полиморфизм rs1800896 в гене IL-10 может быть связан с заболеваемостью ВЭБ и ВЭБ, ассоциированным с гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом (ВЭБ-ГЛГ) у детей, а генотип АА и аллель А могут быть чувствительными факторами риска для ВЭБ-ГЛГ [51]. Кроме того, в предыдущих работах было показано, что полиморфизм гена MBL2 (SNP 49 C/T rs5030737) [37]; генотипы AG+GG и AG по TLR4-D299G [52]; Ugrp2 [53]; генотипы 2R, 2R, IL-1Ra и T и T IL-1b [54] были связаны с повышенным риском развития гипертрофии глоточной миндалины. Наши результаты позволяют предположить, что генотип GG по IL-10 rs1800896 играет заметную роль в устойчивости к ГГМ и может предотвращать разрастание ткани глоточной миндалины до максимального размера [55].

Заключение

Носоглоточные миндалины представляют собой лимфоэпителиальную ткань, расположение которой представляет собой первую линию защиты от бактерий и вирусов. Мы предполагаем, что наличие инфекций HHV6 и CMV влияет на развивающуюся ГГМ, а инфицирование вирусами HHV6 и EBV может влиять на размер глоточной миндалины. Генотип GG по гену IL-10 G-1082A может играть роль в устойчивости к ГГМ и расширении ткани глоточной миндалины до максимальных размеров. Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения наших данных и выявления возможной роли других полиморфизмов генов интерлейкинов в ГГМ. Поиск предикторов ГГМ продолжается. Необходимы также дополнительные исследования для оценки роли герпесвирусов в патогенезе ГГМ и оценки полиморфизма IL-10 rs1800896 как прогностического предиктора ГГМ. Кроме того, патофизиология этого заболевания не до конца ясна. Выявление факторов, влияющих на иммунологический ответ, позволит получить важные данные для объяснения патогенеза ГГМ. Дальнейшие исследования также должны подтвердить наши выводы и выяснить роль полиморфизмов других генов интерлейкинов в ГГМ. Необходимо продолжить поиск предикторов ГГМ, провести дополнительные исследования для оценки роли герпес вирусов в патогенезе ГГМ. Кроме того, патофизиология заболевания неясна. Выявление факторов, влияющих на иммунологический ответ, позволит получить важные данные для объяснения патогенеза ГГМ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.