Первая часть обзора, опубликованная ранее (в №1 2020), содержала сведения об основных свойствах BMP-2, механизме его действия, аспектах получения активного фактора в бактериальных продуцентах, а также носителях BMP-2 и экспериментальных моделях тестирования эффективности материалов на основе BMP-2 на лабораторных животных.

Вторая часть обзора посвящена совместному применению BMP-2 c другими факторами в составе одного материала, а также медицинскому применению материалов с добавлением BMP-2 бактериального происхождения.

Совместное применение BMP-2 с другими факторами

Помимо разработки новых носителей другим перспективным подходом при создании эффективных и безопасных остеопластических материалов с пониженной концентрацией BMP-2 является совместное применение с другими биологически активными факторами. Механизм восстановления костной ткани чрезвычайно сложен и сопряжен с целым рядом параллельных процессов, связанных с привлечением и дифференцировкой мезенхимальных стволовых клеток, взаимодействием остеобластов и остеокластов, ангиогенезом, минерализацией и перестройкой первичного регенерата. Учитывая разнообразие факторов роста и цитокинов, участвующих в этих биологических процессах, ожидается, что совместное применение биологически активных факторов может привести к более успешным результатам в регенерации костной ткани.

Среди исследований совместного применения BMP-2 с обширным перечнем факторов, оказывающих влияние на процессы регенерации костной ткани, можно выделить использование эритропоэтина (ErythroPOietin, EPO) [1—3], фактора стромальных клеток 1 (Stromal cell-Derived Factor-1, SDF-1) [4—8], фактора роста эндотелия сосудов (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) [9—12], тромбоцитарного фактора роста (Platelet-Derived Growth Factor, PDGF) [12, 13], инсулиноподобного фактора роста 1 (Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1) [14] и фактора роста фибробластов 2 (Fibroblast Growth Factor 2, FGF-2) [15, 16].

При анализе литературы было отдано предпочтение исследованиям BMP-2 бактериального происхождения, в ряде случаев — публикациям без указания выбора продуцента BMP-2 (см. таблицу).

Эритропоэтин, один из гормонов почек, отвечающий за образование красных кровяных клеток, широко используется в медицине для коррекции анемий при хронической почечной недостаточности, онкологических заболеваниях, хронических воспалительных заболеваниях кишечника, трансплантации органов и тканей и др. Помимо основной функции доказано влияние эритропоэтина на процессы остеогенеза и ангиогенеза, что способствует регенерации костной ткани [17, 18]. Эритропоэтин прошел успешную клиническую апробацию при лечении переломов костей голени [19]. Примечательно, что эритропоэтин оказывает влияние на различных этапах восстановления костной ткани, таких как острая воспалительная реакция, образование костной мозоли, минерализация, ангиогенез посредством разнообразных типов клеток, включая остеокласты, остеобласты, эндотелиальные и кровяные клетки и их предшественников [20]. В работе С. Li и соавт. [21] продемонстрирован один из механизмов участия эритропоэтина в процессах образования костной ткани посредством Ephr/ephrin сигнального пути, отвечающего за взаимодействие остеобластов и остеокластов, которое играет определяющую роль в процессах ремоделирования, а также на поздних стадиях восстановления целостности костной ткани. Остеогенез, регулируемый по Ephr/ephrin-сигнальному пути, протекает по независимому от BMP-2 механизму [22], следовательно, при совместном применении BMP-2 и EPO можно рассчитывать на повышение остеоиндуктивных свойств композиционных материалов на их основе при снижении эффективной концентрации каждого из компонентов. Положительный эффект совместного воздействия эритропоэтина и BMP-2, заключающийся в увеличении объема новообразованной кости, а также улучшении ее морфологических параметров, показан на модели краниальных дефектов у мышей [2] (см. табл. 1).

Добавление эритропоэтина приводило к увеличению количества красных кровяных клеток в периферической крови, увеличению популяций гематопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге, а также остеокластогенезу. Совместное применение BMP-2 с эритропоэтином также дало положительные результаты на модели эктопического остеогенеза у мышей при использовании носителя из поликапролактона [1]. Через 4 и 8 нед после имплантации в группе с совместным применением факторов наблюдалось увеличение объема новообразованной кости, минеральной плотности, образование более плотного красного костного мозга по сравнению с желтым костным мозгом в случае BMP-2. Совместное действие BMP-2 прокариотического происхождения в дозах 1 и 10 мкг и рекомбинантного эритропоэтина («Эпостим»), вводимого подкожно в область дефекта в суммарной дозе 6000 МЕ/кг, изучено на модели регенерации краниальных дефектов критического размера у мышей. Эритропоэтин существенно улучшал количественные и качественные характеристики костной ткани в зоне имплантации при совместном применении с BMP-2 как в дозе 1 мкг, так и 10 мкг [3]. Также был выделен эритропоэтин прокариотического происхождения с различными дополнительными доменами для повышения биологической активности и способности связываться с остеопластическим материалом — ДКМ [23]. Согласно результатам исследований in vitro и in vivo активности, наиболее перспективным для дальнейшего исследования в качестве компонента костных материалов является препарат, содержащий гепарин-связывающий домен на С-конце.

Другим перспективным фактором для совместного использования с BMP-2 является фактор стромальных клеток 1 (SDF-1), представляющий собой хемоаттрактант для гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток. SDF-1 играет важную роль в эмбриональном развитии, гематопоэзе, а также регенерации различных тканей, включая костную, привлекая стволовые клетки к месту повреждения [8, 24]. По-видимому, очередность выхода каждого фактора из носителя имеет критическое значение при совместном применении BMP-2 с SDF-1. Так, одновременный выход факторов из коллагеновых губок не приводил к достоверному увеличению показателей новообразованной костной ткани, как на модели краниальных дефектов критического размера у мышей, так и в случае эктопического остеогенеза, по сравнению с одиночным применением BMP-2 [4].

В то время как последовательное высвобождение SDF-1 и BMP-2 из фиброин-наногидроксилапатитового композита приводило к синергическому эффекту in vitro и in vivo [5]. Быстрый выход SDF-1 на первом этапе провоцировал привлечение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга с их последующей дифференциацией в остеобласты под действием постепенно высвобождаемого BMP-2 на втором этапе.

Помимо последовательности выхода существенное влияние на эффективность совместного применения SDF-1 и BMP-2 также оказывает кинетика выхода. Ковалентное связывание обоих факторов на коллагеновом носителе приводило к усиленному эктопическому остеогенезу у крыс по сравнению с методом физической адсорбции [6]. Примечательно, что BMP-2 был добавлен в низкой дозе (2,5 мкг), при которой не наблюдалось эктопического остеогенеза в случае его одиночного применения. Аналогичные результаты показаны в работе S. Zwingenberger и соавт. [7]. Добавление SDF-1 (10 мкг) позволило достигнуть увеличения объема новообразованной костной ткани при пониженной дозе BMP-2 (2,5 мкг), при этом результаты оказались сопоставимы с одиночным применением высокой дозы BMP-2 (15 мкг).

Локальное кровоснабжение имеет критическое значение для эффективной регенерации костной ткани. Торможение ангиогенеза оказывает негативное влияние на образование костной ткани, в то время как стимулирование ангиогенеза приводит к повышению скорости ее регенерации [25]. Таким образом, участие фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), являющегося основным стимулятором васкулогенеза и ангиогенеза, потенциально может усилить остеогенез при совместном использовании с факторами роста кости. VEGF оказывает влияние на процессы прямого и непрямого остеогенеза, а также восстановления повреждений костной ткани [26, 27]. Последовательное высвобождение VEGF и BMP-2 из микрокапсул полилактид-поли(этиленгликоль)-полилактида приводило к усиленной дифференциации мезенхимальных стволовых клеток по ERK1/2 и Wnt-сигнальным путям в случае совместного применения факторов [9]. Однако результаты совместного применения BMP-2 с VEGF in vivo противоречивы [25].

Так, при использовании BMP-2 бактериального происхождения совместно с VEGF наблюдалось достоверное отличие от одиночного применения BMP-2 только через 4 нед после операции, которое исчезало к 12-й неделе, что свидетельствует о взаимодействии факторов на ранних этапах регенерации [10]. При этом в случае совместного использования наблюдалось увеличение площади закрытия дефекта.

Положительные результаты совместного применения BMP-2 и VEGF также получены в экспериментах на модели эктопического остеогенеза у крыс [11], в которых в группе с совместным применением факторов помимо увеличения объема новообразованной костной ткани наблюдалась повышенная васкуляризация. В то же время использование полилактид-ко-гликолевой кислоты в качестве носителя при восстановлении дефектов критического размера большеберцовых костей у овец не привело к достоверному отличию результатов при совместном применении BMP-2, VEGF и PDGF от данных по их применению порознь [12].

Другим важным фактором ангиогенеза является фактор роста тромбоцитов. Применение PDGF также оказывает положительный эффект на восстановление дефектов костной ткани [28]. При совместном применении с BMP-2 усиливался синтез щелочной фосфатазы в мезенхимальных стволовых клетках и инфильтрация клеток при последовательном выходе из альгинат/кальций-фосфатного композита [13].

Аналогичные результаты совместного применения BMP-2 in vitro получены с инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF-1), являющимся важнейшим эндокринным посредником действия соматотропного гормона [14]. IGF-1 — митогенный фактор, влияющий на рост зрелых клеток, а также рост и дифференцировку эмбриональных клеток. Показан положительный эффект IGF-1 на стимуляцию роста и пролиферацию остеобластов, в результате чего наблюдалось усиление роста тканей перидонта in vitro [29].

Факторы роста фибробластов относятся к семейству факторов, участвующих в ангиогенезе, заживлении ран и эмбриональном развитии, основным из которых является FGF-2. Результаты совместного применения BMP-2 с FGF-2 получены на модели краниальных дефектов с применением коллаген/гидроксилапатитного композита [15]. Несмотря на отсутствие отличий в объеме новообразованной костной ткани при совместном использовании факторов по сравнению с одиночным применением BMP-2, в группе BMP-2 + FGF-2 наблюдалось увеличение зоны перекрытия дефекта у старых мышей, при этом у молодых мышей таких отличий не наблюдалось. Другим положительным примером совместного применения BMP-2 с FGF-2 является работа J. Su и соавт. [16]. При восстановлении дефектов нижней челюсти у кроликов наблюдалось увеличение объема новообразованной кости и васкуляризации при совместном применении обоих факторов.

Чрезвычайно широкий перечень существующих носителей, концентрационных соотношений, различных моделей контролируемого выхода факторов из носителя, а также использованных животных моделей обусловливает противоречивость результатов совместного применения BMP-2 с другими факторами и сложность сравнительного анализа исследований. Поиск оптимального состава, соотношения и кинетики выхода различных биологически активных факторов для эффективного восстановления костной ткани является предметом дальнейших исследований.

Первый опыт практического применения материалов с добавлением фактора BMP-2 бактериального происхождения в ортопедии, травматологии, спинальной хирургии и дентальной имплантологии

На базе Национального центра эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи разработаны два композиционных препарата, содержащие в своем составе фактор BMP-2, полученный биосинтезом в клетках бактерий: «ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ Плюс» и «ГАМАЛАНТ-крошка Плюс». Основой композиционного препарата в первом случае являются синтетический нанокристаллический гидроксилапатит и высокоочищенный коллаген I типа, во втором — деминерализованный кортикальный или губчато-кортикальный костный матрикс крупного рогатого скота. Имеется первый опыт практического применения данных препаратов. Так, в ГКБ имени С.П. Боткина в 2011 г. материалы на основе BMP-2 были использованы у 8 пациентов с различными дефектами костной ткани (n=4) и ложными суставами (n=4) после травмы. Всем пациентам было выполнено оперативное лечение металлическими пластинами для достижения абсолютной стабильности костных фрагментов. После установки имплантата костный дефект заполнялся либо «ГАМАЛАНТ-крошкой Плюс», либо смесью «ГАМАЛАНТ-пасты-ФОРТЕ Плюс» и фрагментов аутокости. Во всех случаях через 20—24 нед после операции наблюдалось формирование костной мозоли, при этом функциональный результат у всех пациентов был максимальным [30].

В качестве примера можно привести один из клинических случаев с применением «ГАМАЛАНТ-крошки Плюс». У пациентки Б., 53 лет, произошел поперечный перелом правой плечевой кости со смещением и повреждением лучевого нерва. Пациентке был произведен остеосинтез плечевой кости пластиной, оказавшийся несостоятельным. Через 6 нед была выполнена вторая операция: удаление пластины, ревизия лучевого нерва, реостеосинтез плечевой кости штифтом. В течение 4 лет пациентка жаловалась на боли и выраженную слабость в правой руке, невозможность более 10 мин работать рукой. При обращении в 27-е травматологическое отделение ГКБ имени С.П. Боткина был выявлен ложный сустав плечевой кости с остеолизисом костной ткани в дистальном отделе плеча в месте контакта штифта, после чего была произведена операция по удалению штифта, резекции ложного сустава плечевой кости (укорочение до 3 см), реостеосинтез правой плечевой кости пластиной LCP с использованием материала «ГАМАЛАНТ-крошка Плюс». Через 6 мес после операции у пациентки отмечена консолидация костных фрагментов с формированием костной мозоли и восстановлением функции руки (пациентка снова смогла вязать) [31].

В Республиканской клинической больнице им. Г.Г. Куватова (Уфа) у 5 пациентов в возрасте от 35 до 65 лет с оскольчатыми переломами позвонков с повреждением переднего и заднего костного опорного комплекса, заболеваниями грудного и поясничного отделов позвоночника дегенеративно-дистрофического и диспластического характера (нестабильные формы остеохондроза, спондилоартроз) проводилось оперативное лечение с использованием остепластического материала «ГАМАЛАНТ-крошка Плюс». Использование материала в комбинации с костными ауточипcами при переднем спондилодезе позволяло равномерно и более полно заполнять свободные межфрагментарные промежутки вокруг основного трансплантата. Осложнений не наблюдалось. Через 18—20 нед рентгенологически определялся формирующийся межтеловой костный блок[30, 32].

Композиционный препарат, содержащий в своем составе фактор BMP-2, полученный биосинтезом в клетках бактерий (ErhBMP-2), разработан и доведен до коммерческого использования в Республике Корея. Он представляет собой β-трикальций фосфат/гидроксилапатит (β-TCP/HA) c адсорбированным на нем ErhBMP-2 (Cowellmedi Co, Pusan, Корея) с концентрацией фактора 1,5 мг/мл. Опубликованы результаты сравнительного исследования, включающего 72 пациентов, по заполнению лунок удаленных зубов β-TCP/HA c фактором ErhBMP-2 (опытная группа) и без него (контрольная группа) [33]. В данном исследовании не проводили вычисления показателей, характеризующих эффективность применения материалов, однако общие тенденции были близки к тому, что наблюдалось при лечении с использованием материала «ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ Плюс». Для материала на основе β-TCP/HA с добавлением BMP-2 была показана большая терапевтическая эффективность по сравнению с β-TCP/HA без фактора.

Компания CGBIO Inc. (Seongnam, Корея), производящая широкий спектр остеопластических материалов, выпустила на рынок препараты rhBMP-2 прокариотического происхождения с коммерческим названием NOVOSIS для применения в ортопедии и стоматологии. Препарат rhBMP-2 NOVOSIS-DENT в сочетании с гидроксилапатитом продемонстрировал лучшие показатели по сравнению с материалом Bio-Oss (Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Швейцария) при операциях по поднятию альвеолярного гребня, проведенных на 10 пациентах [34].

Другие возможные направления медицинского применения рекомбинантного фактора BMP-2, синтезированного в клетках E. coli, не связанные с индукцией остеогенеза

Как уже указывалось выше, BMP-2 является многофункциональным регулятором развития, контролирующим процессы клеточной пролиферации и дифференцировки, апоптоза, ангиогенеза и др. при эмбриональном развитии и в постнатальный период жизни. Это определяет широкие возможности применения BMP-2 помимо описанных выше примеров использования материалов на его основе в ортопедической практике, травматологии и стоматологической имплантологии, основанных на способности фактора индуцировать образование новой костной ткани.

Одной из важнейших областей применения рекомбинантного BMP-2, синтезированного в клетках E. coli, может стать его использование для регенерации хрящевой ткани, в частности, для лечения остеоартроза. Так, в работе Y. Tokuhara и соавт. [35] показано, что BMP-2 прокариотического происхождения, введенный в составе желатиновой губки, концентрационно-зависимым образом стимулирует регенерацию хрящевой ткани в экспериментах на модели хирургических дефектов поверхности коленного сустава кроликов диаметром 5 мм.

Недавно показана возможность использования фактора BMP-2 в офтальмохирургии. При тяжелых ожоговых бельмах зрение можно восстановить только оперативным путем — с помощью кератопротезирования. Ткань бельма характеризуется низкими биомеханическими характеристиками, что усложняет проведение операции и приводит к послеоперационным осложнениям, в частности, к смещению протеза. Для укрепления бельм используют различные аутологичные ткани, однако их применение связано с рядом трудностей, в частности, с быстрой биодеградацией (лизисом) тканей в послеоперационном периоде. В работе В.Д. Захарова и соавт. [36] показана возможность существенного повышения прочностных характеристик бельм роговицы через 2—3 нед после имплантации коллагеновой мембраны с белком s-tag-BMP-2, полученным синтезом в клетках E. coli за счет замещения имплантата прочной новообразованной соединительной тканью.

Другим примером возможного применения BMP-2, экспрессируемого в клетках E. coli, не связанного с хирургией, является его использование для лечения рака кишечника. На культуре клеток рака кишечника показано проапоптотическое действие BMP-2 при добавлении к клеткам бактерий E. coli, экспрессирующих фактор [37]. Апоптоз концентрационно-зависимо снижается при добавлении ноггина — ингибитора BMP-2, что доказывает специфичность наблюдаемого эффекта. Идея терапии пациентов с начальными стадиями рака кишечника основана на пероральном приеме препарата, содержащего живые бактерии E. coli, экспрессирующие фактор BMP-2.

Заключение

Таким образом, показана возможность совместного действия BMP-2 с другими белковыми факторами, повышающими остеоиндуктивность материалов.

Чрезвычайное разнообразие возможных комбинаций белковых факторов и носителей обуславливает актуальность дальнейшего поиска оптимального состава, соотношения и кинетики выхода различных биологически активных факторов для эффективного восстановления костной ткани. В России и Корее получены препараты на основе BMP-2 прокариотического происхождения для медицинского применения. Имеются примеры практического использования рекомбинантного BMP-2, синтезированного в клетках E. coli, в сочетании с новыми носителями в ортопедии, травматологии, спинальной хирургии и дентальной имплантологии.

Наряду с использованием синтезированного в E. coli BMP-2 для лечения костных патологий, представляется перспективным расширение областей применения материалов на основе BMP-2 для лечения других заболеваний, например остеоартроза. Коллагеновые имплантаты с рекомбинантным BMP-2 могут быть полезны для укрепления бельм при кератопротезировании. Препараты на основе клеток E. coli, синтезирующих BMP-2, исследуются с точки зрения возможности их применения для лечения рака кишечника.

Благодарности. Авторы выражают благодарность Бокше И.С. за обсуждение обзора.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (Грант №16-15-00133).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.