Введение

Фактор некроза опухоли (Tumor necrosis factor, TNF) — это провоспалительный цитокин, который играет значительную роль в патогенезе большого ряда заболеваний, в том числе онкологических и аутоиммунных [1, 2]. Ген TNF расположен на 6 хромосоме (6p21.3) в высоко полиморфной области комплекса гистосовместимости HLA III класса, на расстоянии 250 kb от HLA-B локуса I класса и 850 kb от HLA-DR локуса II класса. Ген TNF имеет ряд функциональных полиморфизмов, из которых наиболее изучены однонуклеотидные замены в промоторной области -308(g/a)TNF (rs1800629) и -238(G/A)TNF (rs361525) [3] (для удобства аллели -308(g/a)TNF и -238(G/A)TNF обозначены cтрочными и заглавными буквами соответственно). Известно, что эти полиморфизмы входят в расширенные наследственные гаплотипы (ancestral haplotype), охватывающие весь комплекс генов HLA. Один из наиболее распространенных гаплотипов — AH8.1 (обнаруживается в 9% случаев в европейской популяции), в состав которого входят аллели HLA-A*1, HLA-B*8, HLA-DRB1*3 и -308(a)TNF, ассоциирован с повышенным уровнем синтеза TNF и предрасположенностью к аутоиммунным заболеваниям [4, 5]. В свою очередь аллель -238(A)TNF ассоциирован с низкой продукцией цитокина и образует уникальный гаплотип B57 с аллелем HLA-B*5701, известным как протективный аллель в патогенезе инфекции HIV-1 [6]. Предполагается, что эффект гаплотипов комплекса HLA может быть связан с уровнем экспрессии гена TNF, однако, напротив, эффект TNF может быть обусловлен сцепленностью с генами комплекса HLA.

В патогенезе онкологических заболеваний TNF может выполнять разнонаправленные функции: вызывать как апоптоз, так и пролиферацию опухолевых клеток; стимулировать инфильтрацию опухоли клетками иммунной системы и способствовать инвазии и метастазированию опухолевых клеток [1].

Рак молочной железы (РМЖ) — это наиболее распространенное онкологическое заболевание у женщин. Противоопухолевая активность TNF при РМЖ активно изучается в доклинических и клинических исследованиях. Хотя клиническое применение TNF ограничивается системной токсичностью, перспективным считается его использование как адъюванта в сочетании с химио- и лучевой терапией [7]. Необходимо, однако, учитывать влияние микроокружения, клеточного и геномного контекста на конечные эффекты TNF. Полиморфизм гена TNF изучается как фактор риска и прогноза РМЖ. Ранее нами была показана зависимость общей выживаемости (ОВ) больных РМЖ от полиморфизмов -308(g/a)TNF и -238(G/A)TNF [8, 9]. В настоящем исследовании мы попытались ответить на вопрос, не является ли влияние полиморфизмов гена TNF на ОВ следствием кооперации с генным окружением, а именно — с наследственными гаплотипами комплекса HLA, вовлеченными в аутоиммунные процессы.

Материал и методы

В работе использована архивная коллекция ДНК от 442 первичных больных РМЖ с подтвержденным гистологическим диагнозом и 327 женщин без онкологических и аутоиммунных заболеваний (группа клинического контроля) с известными генотипами -238(G/A)TNF и -308(g/a)TNF, частично описанные ранее [8—10]. Средний возраст больных РМЖ составил 54,2 года (от 23 до 80 лет), в контрольной группе — 53,7 года (от 19 до 89 лет). Для 420 больных РМЖ имелись данные о стадии заболевания. Поскольку только 2,9% больных имели IV стадию РМЖ, этих больных включили в группу с III стадией РМЖ, и в целом распределение по стадиям заболевания было следующим: I — 25,0%; II — 46,4%; III — 28,6%. Сведения о состоянии больных РМЖ за время наблюдения с момента первичной госпитализации были получены в 278 случаях.

Аллели HLA-A*1, HLA-B*8 и HLA-DRB1*03 определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) у 412 больных РМЖ; HLA-B*57 — у 169 больных РМЖ. В реакции использовали аллель-специфические праймеры: A1_F: 5′-ggACCAggAgACACggAATA-3′ A1_R: 5′-AggTATCTgCggAgCCCg-3′; B8_F: 5′-gACCggAACACACAgATCTT-3′ B8_R: 5′-CCgCgCgCTCCAgCgTg-3′ [11]; B57_F: 5′-gCTCACATCATCCAggT-3′ B57_R: 5′-CgTCTCCTTCCCgTTCTC-3′; B57_R0101: 5′-ATCCTTgCCgTCgTAggCgg-3′ B57_R0102: 5′-ATCCTTgCCgTCgTAGGCAG-3′ [12]; DR3_F: 5′-TACTTCCATAAC CaggAggAgA-3′ DR3_R: 5′-TgCAgTAgTTgTCCACCCg-3′ [13]. Аллели -238(G/A)TNF определяли методом ПЦР-ПДРФ, как описано ранее [9].

Для определения гаплотипа -308/-238 гена TNF в образцах, гетерозиготных по обоим исследуемым сайтам (генотип -308ag/-238AG), проводили ПЦР с использованием аллель-специфических праймеров для определения полиморфизма -308(g/a)TNF: TNF-308aF 5’-AATAggTTTTgAggggCATgA-3’ TNF-308gF 5’-ATAggTTTTgAggggCATgg-3’ TNF-308R 5’-TCTCggTTTCTTCTCCATCg-3’ [14], т.к. эта область продукта ПЦР включает положение полиморфизма -238(G/A)TNF (рис. 1, а). Нуклеотидную последовательность продукта ПЦР каждого гаплотипа определяли обратным секвенированием по Сенгеру.

а — последовательность продукта ПЦР с использованием аллель-специфических праймеров TNF-308a/gF и TNF-308R [14] (подчеркнуты) включает сайты однонуклеотидных замен -308(g/a)TNF и -238(G/A)TNF (выделены жирным шрифтом); б — фрагмент сиквенса ПЦР-продуктов: вверху — гаплотип -308a/-238G, внизу — гаплотип -308g/-238A гена TNF.

При анализе полученных данных группы сравнивали двусторонним критерием Фишера. Для проверки согласия распределения генотипов с распределением, равновесным по Харди-Вайнбергу, использовали критерий Пирсона. Распределение гаплотипов -238/-308 гена TNF определяли прямым подсчетом. Для оценки риска заболевания рассчитывали отношение шансов и представляли как OR [95% доверительный интервал — CI]. Критерием оценки прогностической значимости признака являлось отношение рисков HR [95% CI]; показатели 10-летней ОВ представляли как Mean±SE%; сравнение кривых ОВ проводили методом Каплана-Майера с применением Logrank Test в программе GraphPad Prism (Version 4.00). Для всех критериев различия считали достоверными при достижении p<0,05.

Результаты

Данные о полиморфизме гена TNF были проанализированы для 442 больных РМЖ и 327 женщин контрольной группы. Распределение генотипов -308(g/a)TNF и -238(G/A)TNF соответствовали теоретическому распределению по Харди-Вайнбергу (p>0,05). Распределение генотипов и гаплотипов по этим сайтам у больных РМЖ и в контрольной группе статистически значимых отличий не имело, а полученные значения OR не позволяют говорить о влиянии этих полиморфизмов на предрасположенность к заболеванию РМЖ (табл. 1).

Необходимо отметить, что все 7 образцов (3 из контрольной группы и 4 от больных РМЖ), гетерозиготных как по сайту -238(G/A)TNF, так и по сайту -308(g/a)TNF, в каждом из гаплотипов своего диплоидного набора имели только одну из полиморфных замен (см. рис. 1, б). Соответственно, двойной гетерозиготный генотип -308ag/-238AG учитывался в анализе как содержащий 2 гаплотипа: -308a/-238G и -308g/-238A (см. табл. 1). Таким образом, за исключением этих образцов, носители трех гаплотипов -308/-238 гена TNF — a/G, g/G и g/A — фактически соответствуют носителям генотипов ag/GG, gg/GG и gg/AG. Носители генотипа aa/GG (в нашей выборке 1,4% среди больных РМЖ) для дальнейшего анализа были включены в группу ag/GG.

412 больных РМЖ были протестированы на маркеры расширенного гаплотипа AH8.1 — аллели HLA-A*1, HLA-B*8 и HLA-DRB1*03 (табл. 2). В 8,5% случаев встречались 3 маркера одновременно, что соответствует данным литературы [15]. HLA-B*57 был выявлен только у носителей аллеля -238A, но не у носителей гомозиготы -238GG гена TNF (74,4% и 0% соответственно; p=7,1D-22). Кроме того, дополнительно в гнездовой ПЦР были протестированы образцы, положительные по HLA-B*57, из которых 96% (24 из 25) имели аллельный субтип HLA-B*5701.

Распределение маркерных аллелей AH8.1 у носителей генотипов -308/-238 гена TNF — gg/GG, ag/GG и gg/AG — представлено в табл. 2. Группа носителей ag/GG достоверно отличалась по частотам аллелей HLA-A*1, HLA-B*8 и HLA-DRB1*03 от носителей как gg/GG, так и gg/AG генотипов, за исключением HLA-A*1 у носителей gg/AG (см. табл. 2). Для генотипа -238AG была отмечена высокая частота аллелей HLA-A*1 (30,3%), что соответствует данным литературы, поскольку наследственный гаплотип B57 наряду с минорным аллелем A полиморфизма -238(A/G)TNF и аллелем HLA-B*57 включает также HLA-A*1 [15, 16]. Следует отметить, что из 4 носителей двойного гетерозиготного генотипа -308ag/-238AG гена TNF все были положительными по HLA-B*57, а 2 из них имели все 3 маркера AH8.1. Таким образом, как и ожидалось, с маркерами AH8.1 ассоциируется генотип -308ag, тогда как с маркерами гаплотипа B57 ассоциируется -238AG гена TNF.

Примечание. ¹ — генотип содержит 1 или более маркерных аллелей гаплотипа AH.8.1 (A*1, В*8, DRB1*3); ² — генотип содержит 3 маркерных аллеля гаплотипа AH.8.1 (A*1, В*8, DRB1*3).

В качестве характеристики конечного эффекта полиморфных аллелей мы рассматривали ОВ больных РМЖ. Мы не обнаружили статистически значимых отличий для всей выборки, и 10-летняя ОВ составила 65,0±10,6% для gg/AG генотипа, 73,6±3,3% для gg/GG и 75,0±5,3% для ag/G (рис. 2, а). Для носителей генотипа -308gg/-238AG снижение 10-летней ОВ до 50,0±17,7% было связано с HLA-B*57, хотя эта зависимость не была статистически значимой (см. рис. 2, б). Не обнаружено статистически значимого влияния на ОВ больных РМЖ гаплотипа AH8.1 (см. рис. 2, в). Поскольку число носителей одновременно трех маркерных аллелей гаплотипа AH8.1 было мало (8,5% в нашей выборке), в дальнейшем группы сравнения формировали в зависимости от наличия хотя бы одного из маркерных аллелей HLA-A*1, HLA-B*8 и HLA-DRB1*03 или при отсутствии этих аллелей (обозначали как М+ и M– соответственно) (см. рис. 2, г).

Кривые общей выживаемости по Каплану-Майеру. Ось абсцисс — время наблюдения, мес. Ось ординат — общая выживаемость, %. а — ag/GG, gg/GG, gg/AG генотипы -308/-238 гена TNF; б — кривые общей выживаемости для носителей генотипа gg/AG гена TNF при наличии или отсутствии аллелей HLA- A*1 и HLA-B*57; в — AH8.1+ содержит одновременно 3 маркерных аллеля HLA-A*1, HLA-В*8, HLA-DRB1*3; г — М+ содержит 1 или более маркерных аллелей гаплотипа AH.8.1.

Далее мы попытались выявить влияние маркерных аллелей AH8.1 (М+) на ОВ носителей генотипов gg/AG, gg/GG и ag/GG гена TNF (рис. 3, а). Значимое различие было выявлено только для генотипа ag/GG (10-летняя ОВ составила 87,2±5,4% при наличии хотя бы одного маркера AH8.1 и 56,0±9,9% в отсутствии аллелей AH8.1; Logrank test p=0,0052; HR=3,8 [1,4; 11,1]) (см. рис. 3, а). Для носителей gg/AG 10-летняя ОВ имела даже большее, однако статистически недостоверное различие при наличии маркерных аллелей AH8.1 и в их отсутствие (88,9±10,5% и 44,4±16,6% соответственно; Logrank test p=0,064; HR=5,9 [0,9; 22,9]) (см. рис. 3, а).

а, в, г — кривые общей выживаемости по Каплану-Майеру. По оси абсцисс — время наблюдения, мес; по оси ординат — общая выживаемость, %; б — зависимость встречаемости генотипов от стадии РМЖ. По оси абсцисс — стадия РМЖ, по оси ординат — встречаемость, %. а, б, в — вся выборка больных РМЖ; г — больные II стадии РМЖ. I, II, III — стадии РМЖ; ag/GG, gg/GG, gg/AG — генотипы -308/-238 гена TNF; генотип М+ содержит 1 или более маркерных аллелей гаплотипа AH.8.1.

Встречаемость как маркерных аллелей гаплотипа AH8.1, так и минорных аллелей полиморфизмов -238(G/A)TNF и -308(g/a)TNF, от стадии РМЖ не зависела (см. рис. 3, б). При включении стадийности РМЖ в анализ зависимости ОВ от генотипов TNF были отмечены 3 группы кривых выживаемости (см. рис. 3, в). Носители распространенного gg/GG генотипа при II стадии заболевания имели высокую 10-летнюю ОВ (более 80%), сравнимую с ОВ больных I стадией РМЖ. Напротив, носители генотипа gg/AG при II стадии РМЖ имели низкую 10-летнюю ОВ (менее 60%), сравнимую с III стадией РМЖ. Промежуточную группу составили носители генотипа ag/GG больные II и III стадией РМЖ. При этом максимальное различие было отмечено между группами носителей трех генотипов TNF при II стадии заболевания (Logrank test p=0,05; Logrank test for trend p=0,016) (см. рис. 3, в).

При анализе II стадии РМЖ оказалось, что 10-летняя ОВ носителей -308ag/-238GG гена TNF при наличии хотя бы одного аллеля AH8.1 (М+) была достоверно выше, чем в их отсутствии (90,0±6,7% и 46,2±13,8% соответственно; Logrank test p=0,0063; HR=6,6 [1,7; 26,9]). При этом кривые ОВ составили 2 группы: 10-летнюю ОВ выше 80% имели носители генотипа ag/GG при наличии маркеров AH8.1 и gg/GG независимо от маркеров AH8.1; 10-летняя ОВ была ниже 50% у носителей ag/GG в отсутствии маркеров AH8.1 и у носителей gg/AG (т.к. частота носителей gg/AG мала, объем этой группы в данном случае не позволил провести анализ зависимости ОВ от маркеров AH8.1) (см. рис. 3, г).

Обсуждение

Влияние полиморфизмов гена TNF на предрасположенность к онкологическим заболеваниям изучается довольно широко. В метаанализе данных литературы о влиянии -238(G/A)TNF на предрасположенность к РМЖ, основанном на 8 исследованиях, не было выявлено ассоциации этого полиморфизма с РМЖ, в том числе при стратификации по этнической принадлежности [16]. Для полиморфизма -308(g/a)TNF в метаанализе 20 публикаций также не обнаружено влияния на предрасположенность к РМЖ для всей выборки, однако авторы делают заключение, что аллель -308a может быть протективным фактором в постменопаузе, а генотип -308aa — фактором риска в пременопаузе [17]. В нашем исследовании мы не обнаружили ассоциации с РМЖ как генотипов -238(G/A)TNF и -308(g/a)TNF, так и гаплотипов -308/-238 гена TNF (см. табл. 1).

Гораздо менее изучено влияние полиморфизмов гена TNF на прогноз РМЖ, а опубликованные данные имеют противоречивый характер. Была выявлена ассоциация гомозиготы -308aa гена TNF с общей и с опухоль-специфической выживаемостью [18], тогда как другие авторы не обнаружили такой ассоциации для полиморфизмов -238(G/A)TNF и -308(g/a)TNF [19]. В других работах минорный аллель полиморфизма -308(G/A)TNF ассоциировался как с общей, так и безрецидивной выживаемостью [20, 21]. Ранее нами было показано статистически значимое снижение 5-летней ОВ у носителей распространенного генотипа -308gg больных РМЖ III стадии [8] и у носителей минорного аллеля -238A при II стадии заболевания [9]. Эти ранее полученные данные можно интерпретировать как снижение ОВ для носителей генотипов -308gg/-238GG и -308gg/-238AG больных РМЖ III стадии и для носителей генотипа -308gg/-238AG с II стадией заболевания, представленное в этом исследовании (см. рис. 3, в).

При анализе зависимости кривых ОВ от генотипа TNF и стадии заболевания нами были выделены три группы больных РМЖ с высоким, низким и промежуточным уровнем ОВ (см. рис. 3, в), суммарные показатели 10-летней ОВ для которых составили: 86,7±2,9, 70,6±6,4 и 46,3±6,1% соответственно (p<0,0001). Хотя основной вклад в такое различие вносит стадийность РМЖ — прогностический признак, применяемый в клинике, однако нельзя не отметить модулирующее влияние полиморфизмов гена TNF на ОВ, максимально выраженное во II стадии заболевания. Возможно, именно при II стадии РМЖ создаются условия для проявления функциональных отличий минорных аллелей гена TNF. К таким условиям может относиться дисбаланс работы иммунной системы при онкологическом заболевании. Известно, что по мере прогрессии РМЖ снижается экспрессия молекул HLA I класса, в то же время в опухолевой ткани появляется экспрессия HLA II класса. Молекулы HLA I класса играют центральную роль в клеточном иммунном ответе как антиген-презентирующие молекулы для цитотоксических Т-лимфоцитов. Снижение экспрессии HLA I класса вплоть до их полной элиминации с поверхности опухолевых клеток является механизмом ускользания неопластических клеток из-под противоопухолевого иммунного надзора, что приводит к диссеминации и метастазированию и ухудшает прогноз заболевания [22]. В свою очередь, молекулы HLA II класса необходимы для презентации пептидов Т-хелперам, и их экспрессия отвечает за инициацию иммунного ответа. Присутствие таких молекул делает опухоль более иммуногенной, что дает хороший прогноз [23]. Так как гаплотип AH8.1 имеет отношение к аутоиммунным процессам [6], мы предположили, что он может оказывать влияние на интенсивность противоопухолевого иммунного ответа и прогноз РМЖ.

Максимальный эффект взаимодействия генотипа ag/GG гена TNF с маркерными аллелями AH8.1 был отмечен для II стадии РМЖ (см. рис. 3, г), хотя выявлялся и для всей выборки в целом. Относительно генотипа gg/GG (на который не оказывают влияние аллели AH8.1) наличие маркерных аллелей AH8.1 повышает, а их отсутствие снижает ОВ носителей минорных аллелей -308a и -238A гена TNF в общей выборке (см. рис. 3, а). Однако для II стадии РМЖ можно наблюдать только снижение ОВ для генотипа ag/GG в отсутствии маркерных аллелей AH8.1. Таким образом, если принять за точку отсчета эффект генотипа gg/GG (представленного в 67,9% нашей выборки больных РМЖ), то приближенным к нему будет эффект суррогатного гаплотипа AH8.1, включающего аллель -308а гена TNF и хотя бы один из аллелей HLA-A*1, HLA-B*8 и HLA-DRB1*3. Можно предположить, что в условиях стандартной терапии РМЖ наследственный гаплотип AH8.1 поддерживает регуляцию и иммунный баланс на оптимальном (благоприятном) уровне, при этом сочетание аллелей -308a и -238A гена TNF с другими гаплотипами HLA, по-видимому, неблагоприятно для прогноза РМЖ.

Для носителей генотипа gg/AG также была выявлена тенденция к повышению ОВ при наличии хотя бы одного маркера AH8.1, возможно, благодаря ассоциации этого генотипа с аллелем HLA-A*1. Тем не менее в целом носители генотипа gg/AG имеют плохой прогноз при II стадии РМЖ, по-видимому, из-за ассоциации с аллелем HLA-B*57 (см. рис. 2, б). Уникальный гаплотип B57 известен и исследуется в связи с инфекцией HIV-1. Предполагается, что низкая экспрессия цитокина TNF у носителей -238A может способствовать протективному действию аллеля HLA-B*5701 [24]. У здоровых неинфицированных носителей HLA-B*57 был обнаружен повышенный уровень ряда факторов, обладающих противовирусной активностью, в том числе относящихся к семейству цитидиновых деаминаз APOBEC3 [25]. APOBEC3-ассоциированный мутагенез зафиксирован во многих опухолях, при этом только экспрессия APOBEC3B коррелирует с пролиферацией опухолевых клеток, тогда как функции других членов этого семейства относятся к процессам в клетках иммунной системы [26]. Было показано, что при РМЖ повышенный уровень мРНК APOBEC3B коррелирует с плохим прогнозом заболевания [27, 28]. Амплификация HER2 и потеря гена-супрессора PTEN активирует APOBEC3B in vitro и коррелирует с APOBEC3-ассоциированным мутагенезом in vivo [29]. Ранее в своих исследованиях мы обнаружили, что полиморфизм -238(G/A)TNF ассоциирован с активирующим аллелем Ile655Val HER2 и может быть фактором риска РМЖ для носителей генотипа -238AG [10]. Таким образом, можно предположить, что повышенный риск РМЖ и снижение ОВ у носителей минорного аллеля -238(G/A)TNF могут быть опосредованы ассоциацией HLA-B*57 с APOBEC3B.

Ограничением данного исследования является низкая частота носителей минорного аллеля -238A гена TNF и, соответственно, небольшие группы сравнения. Однако хотя мы не получили статистически значимых доказательств влияния полиморфизма -238(G/A)TNF на прогноз заболевания, результаты кажутся нам биологически обоснованными и требующими дальнейшего детального изучения. По-видимому, эта группа больных РМЖ, как и носители аллеля -308a в отсутствии маркерных аллелей AH8.1, нуждаются в дополнительном лечении, и применение иммунотерапевтических подходов может оказаться эффективным для этих случаев.

Заключение

Результаты нашего исследования показывают, что полиморфизмы -308(g/a)TNF и -238(G/A)TNF не влияют на предрасположенность к заболеванию РМЖ, но оба существенно снижают ОВ больных РМЖ, особенно во II стадии заболевания. По-видимому, конечный эффект полиморфизмов гена TNF на прогноз заболевания зависит от геномного контекста. Исходя из полученных данных и анализа источников литературы, можно предположить, что механизмы действия -308(g/a)TNF и -238(G/A)TNF отличаются. Так, снижение ОВ у носителей минорного аллеля -238A может быть опосредовано его ассоциацией с HLA-B*57. Напротив, снижение ОВ у носителей -308a не связано с аутоиммунным гаплотипом AH8.1. Таким образом, выявлены две генетически детерминированные группы больных РМЖ, имеющие неблагоприятный прогноз в условиях стандартной противоопухолевой терапии РМЖ, что требует дополнительного исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.