Стандартизация в контексте обсуждения этой статьи — это процесс, при котором результаты клинических лабораторных исследований согласовываются с точки зрения точности или соответствия референтной процедуре измерения (RMP) [1]. Основная цель стандартизации заключается в том, чтобы сообщаемые результаты различных тест-систем и лабораторий были согласованы между собой в течение длительного периода времени. Для липопротеинов и их липидных и белковых составляющих стандартизация особенно важна, поскольку для них группой экспертов в рамках Национальной образовательной программы по холестерину (NCEP) были определены пороги принятия клинических решений [2]. Эти пороги принятия решений основаны на распределении и соотношении рисков внутри популяции. Наблюдение производилось в эпидемиологических исследованиях, во многих из которых тест-системы были стандартизированы. Стандартизация лабораторных измерений относительно одной референтной системы обеспечивает схожие результаты пациентов, соответствующие рекомендациям NCEP [3—6]. Даже небольшие отклонения могут привести к неправильной классификации пациентов, что делает точность измерений особенно важной.

Условия для стандартизации

Успешная стандартизация имеет свои предварительные условия. Во-первых, представляющий интерес аналит должен иметь однозначное определение. Например, холестерин — это молекула, существующая либо в свободной форме, либо этерифицированная до различных жирных кислот. При анализе общего холестерина (ХС) различные этерифицированные формы гидролизуются; следовательно, ХС, измеренный как свободные молекулы ХС, может быть определен однозначно. Основные классы липопротеинов, напротив, представляют собой гетерогенные и полидисперсные частицы с целым рядом свойств, в некоторых случаях перекрывающихся. Таким образом, липопротеины исторически определяются с точки зрения процедур разделения на основе их физических свойств, которые могут не соответствовать функциональным свойствам или иметь связь с заболеваниями. Например, липопротеин низкой плотности (ЛПНП) был определен как фракция липопротеинов с плотностью от 1,019 до 1,063 г/мл [7]; однако на практике ЛПНП обычно отделяют при плотности сыворотки (1,006 кг/л). Фракция плотности d>1,006 кг/л включает некоторые (но не все) остаточные липопротеины, например липопротеин промежуточной плотности (ЛППП). Кроме того, некоторые частицы липопротеина(a) (Lp(a)) имеют плотность <1,063 кг/л и аналогичны, но функционально не эквивалентны основной массе частиц ЛПНП. Также в эту фракцию могут быть включены более крупные частицы липопротеина высокой плотности (ЛПВП), содержащие аполипопротеин E (АпоE), которые сильно отличаются по составу и функциям от более распространенных частиц ЛПНП, содержащих АпоB [8]. Поэтому однозначное определение частиц ЛПНП, представляющих как физические характеристики, так и функциональные свойства, может оказаться недостижимым. Как результат, должны быть четко определены критерии, используемые для определения референтных методик измерения (RMP) для основных липопротеинов, а фракция, определенная в терминах метода разделения, который считается «золотым стандартом», может не быть определяема другими методами.

Во-вторых, для достижения стандартизации должна быть создана референтная система измерений, имеющая иерархическую структуру валидированных и надежных аналитических методов и референтных материалов [9]. «Золотым стандартом» для большинства анализируемых веществ является первичная RMP, которая обладает прослеживаемостью до единиц СИ, высокой точностью и четко определенными характеристиками. Вторичные RMP часто связаны с первичными и должны быть достаточно удобными, стабильными, надежными. Чтобы их можно было передать в другие лаборатории. Вторичные RMP откалиброваны по первичному стандарту. Первичные или вторичные RMP могут использоваться для присвоения значений вторичным референтным материалам, значения которых можно проследить до первичного референтного материала. Первичные эталоны обычно используются для валидирования более доступных вторичных стандартов, не имеющих таких высоких требований и более экономичных. В отсутствие первичной RMP целесообразным представляется работа со вторичным стандартом.

Третье условие для стандартизации — надежный перенос точности от RMP на «полевые» методы. Как правило, это предполагает использование коммутативных референтных материалов (т.е. тех, которые представляют собой реальные образцы пациентов). Многие коммерческие контрольные материалы или калибраторы некоммутативны и, следовательно, могут привести к ошибкам в точности.

Ключевые понятия, касающиеся стандартизации

Прежде чем продолжить рассмотрение элементов референтной системы применительно к липопротеинам и их липидным и белковым компонентам, рассмотрим некоторые принципы и терминологию, связанные с аналитическими измерениями.

Аналитическая точность

Аналитическая точность указывает на соответствие между измеренной величиной и ее истинным значением. Систематическое отклонение от истинного значения называют смещением, которое может быть пропорциональным (относительно концентрации) или постоянным по всем значениям измерений.

Воспроизводимость

Воспроизводимость, или согласованность, измерений — необходимое условие для достижения точности. Определяется как согласованность между несколькими измерениями одного и того же содержания аналита в образце. Метод может иметь минимальную общую систематическую ошибку или смещение, но если он плохо воспроизводится, то будет неточным для некоторых измерений.

Преаналитическая вариабельность

В дополнение к аналитической вариабельности важный вклад в изменение анализируемого вещества вносят преаналитические источники вариации, включая биологическую, поведенческую, клиническую (вызванную болезнями и лекарственными препаратами), а также изменения, связанные со сбором и обработкой образцов. Некоторые из этих источников вариации могут быть неконтролируемыми, например возраст, циркадный ритм или беременность. Или они могут быть связаны с наблюдаемой у пациента картиной и их следует учитывать при интерпретации результатов. Контролируемые источники вариации, например состояние натощак, употребление алкоголя, физические упражнения, а также процедуры сбора и обработки проб, должны быть стандартизированы в соответствии с руководством NCEP [3—6].

Предпочтительным типом образца для измерения липопротеинов в обычной клинической лаборатории обычно была сыворотка, собираемая в вакуумные пробирки с активаторами свертывания крови. В лабораториях по исследованию липидов, особенно для разделения липопротеинов, в качестве биоматериала традиционно использовалась плазма этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), поскольку антикоагулянт повышал стабильность анализируемого вещества за счет хелации ионов металлов, необходимых для активности протеаз. ЭДТА также позволяет быстро обрабатывать образцы, не дожидаясь свертывания; однако ЭДТА-плазма имеет и недостатки, которые препятствуют ее обычному использованию. Недостаточное перемешивание может привести к образованию микросгустков, которые могут засорить пробоотборники анализаторов. Кроме того, ЭДТА осмотически извлекает воду из эритроцитов, разбавляя компоненты плазмы, которые могут варьироваться в зависимости от объема заполнения образца. Поскольку пороги принятия клинических решений NCEP основаны на значениях в сыворотке крови, измерения холестерина, выполненные в плазме ЭДТА, требуют коррекции в 1,03 раза. Для переноса точности, например в рамках сертификации сети референс-лабораторий по холестерину (CRMLN), необходима строгая обработка образцов. Свежие сыворотки крови, собранные в строго определенных условиях, анализируются в течение определенного периода времени для обеспечения их коммутативности.

Учитывая значительное улучшение доступных сегодня аналитических систем, для некоторых аналитов преаналитическая вариация может составлять значительную или большую часть общей вариации. Биологическая вариация уровня общего холестерина составляет в среднем 6,1% и может достигать 11% даже при тщательной подготовке пациента [10]. Такие неконтролируемые источники преаналитической вариации должны быть обязательно учтены при интерпретации результатов. Рекомендуется, чтобы врачи основывали решения о проведении лечения на результатах двух образцов, собранных с интервалом в две нед, чтобы свести к минимуму влияние биологической вариации [11].

Матричные эффекты и коммутативность референтных материалов

Коммерчески доступные референтные материалы, которые обычно представляют собой пулы лиофилизированной сыворотки или стабилизированную жидкость на основе сыворотки, удобны для использования; однако производственные процессы, особенно лиофилизация и добавление материалов, не являющихся «родными» для сыворотки, могут изменять для тест-систем измеряемые свойства анализируемых веществ. Эти материалы не являются репрезентативными для оценки образцов пациентов (т.е. являются некоммутативными). Другими словами, эти материалы обладают матрикс-эффектом. Матрикс-эффект был определен как влияние свойства образца, независимое от присутствия анализируемого вещества, на процесс измерения и, следовательно, на измеряемую величину. В этой концепции матрица образца включает в себя все компоненты материала системы, кроме самого анализируемого вещества [9]. Потеря коммутабельности при попытке стандартизации — результат ошибочных выводов о надежности аналитической системы. Вторичные референтные материалы, материалы для использования в специальных программах, калибраторы и контрольные материалы для липидов, липопротеинов и аполипопротеинов часто демонстрируют различную степень потери коммутативности, что объясняется матрикс-эффектом, а также включением других форм измеряемых аналитов. Подходы для оценки матричных эффектов и коммутативности были разработаны [12—15], и в настоящее время CLSI разрабатывает руководство по характеристике и соответствию коммутативным референсным материалам [16].

Аналитические цели

Экспертные лабораторные группы, созданные NCEP, установили цели аналитического качества для измерений липидов и основных липопротеинов, исходя из клинической необходимости классификации пациентов (табл. 1) [3—6]. Например, при анализе ХС цель для общей ошибки составляет 8,9%. Следовательно, общая погрешность должна быть такой, чтобы 95% измерений ХС одного человека находились в пределах ±8,9% от значения RMP. Целевые показатели смещения и CV, представленные в табл. 1, отражают аналитические цели NCEP по общей ошибке.

Таблица 1. Критерии NCEP и CLIA для тестирования липидов и липопротеинов

Примечание. ^a — РЗ = референтное значение — присвоенное значение процедурой референтных измерений CDC; ^b — коэффициент вариации; ^c — стандартное отклонение.

*Примечание редакции. Согласно новым критериям CLIA от 2019г, требования к аналитическому качеству представленных аналитов следующее: Общий холестерин: ±10%; ЛПВП-ХС: ±20%; ЛПНП-ХС: ±20%; ТГ: ±15%

Вопросы при достижении необходимой точности

При создании RMP, цель которых — стандартизация лабораторий, практическая задача заключается в обеспечении целевого уровня точности вместе с лабораторным сообществом. Использование коммутативных и широко доступных вторичных референтных материалов — наиболее эффективный и экономичный способ передачи точности. Когда коммутативные референтные материалы недоступны, как в случае анализа липидов и липопротеинов, для разработки эффективной стратегии стандартизации наибольшее значение имеет понимание чувствительности матрицы к характеристикам конкретного метода. Даже если материал содержит чувствительные к матрице компоненты, если RMP явно стабильна и воспроизводима, можно достичь точности сравнения со стандартом путем одновременного анализа разделенных нативных и стандартных образцов. Этот тип сравнения для первоначальной установки точности и последующего мониторинга сопоставимости обычно применим только для вторичных RMP, но это все еще дорогостоящий и трудоемкий подход. Тем не менее это лучшее средство проверки прослеживаемости для производителей диагностических систем и клинических лабораторий, стремящихся провести верификацию выполняемых в лаборатории методов.

Процедуры и материалы референтных измерений

Статус компонентов, составляющих референтные системы для различных липидов и липопротеинов, представлены в табл. 2. В качестве модели для стандартизации холестерина липопротеинов, аполипопротеинов и триглицеридов (ТГ) был использован опыт работы с ХС. Однако, хотя ЛПВП-ХС, ЛПНП-ХС, аполипопротеины и ТГ имеют схожие проблемы с коммутативностью, по сравнению с общим холестерином они демонстрируют более комплексные и разнообразные проблемы с матрицей. При попытке применить эту модель возникают проблемы, связанные с определением аналита, модификацией анализируемого вещества из-за обработки, и не-нативными формами анализируемого вещества.

Таблица 2. Референтные системы липидов и липопротеинов

Примечание. CDC = центр по контролю и профилактике заболеваний; NCEP = Национальная образовательная программа по холестерину; ВОЗ = Всемирная организация здравоохранения; NWLMDRL = Лаборатории исследований липидного обмена и диабета Северо-Западного университета Вашингтона.

Холестерин

Стандарт измерения ХС в крови представляет собой иерархию методов, состоящую из первичной RMP Национального института стандартов и технологий (NIST), вторичной RMP Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) и первичного референтного материала холестерина с сертифицированной чистотой — NIST SRM 911c (табл. 2). Первичная RMP NIST — это процедура масс-спектрометрии с разбавлением изотопов (IDMS) [17]. Вторичная RMP CDC для ХС представляет собой модификацию процедуры экстракции Абелла, Леви, Броди и Кендалла [18]. ХС в сложноэфирной форме высвобождается путем омыления образца сыворотки спиртовым гидроксидом калия. Затем следует экстракция гексаном, выпаривание аликвоты экстракта и детекция хромофора при 620 нм с помощью реагента Либермана—Бурчарда (уксусный ангидрид, ледяная уксусная кислота и концентрированная серная кислота). Метод калибруется с использованием основного эталонного стандарта NIST SRM 911c. Стандартная воспроизводимость метода (CV) наблюдаемая в течение 1 года, составляет от 0,4 до 0,5%. Вторичная RMP CDC также используется для измерения уровня ХС в ЛПВП-ХС и ЛПНП-ХС.

RMP NIST и CDC были определены Объединенным комитетом по прослеживаемости в лабораторной медицине (JCTLM) как международно признанные RMP более высокого порядка [19].

В сравнении стандартов NIST и CDC показано небольшое, но стойкое положительное смещение во вторичной RMP на +1,6% [20]. Более ¹/₂ смещения связано со стероидами и фитостеролами-предшественниками холестерина, которые извлекаются из сыворотки во вторичной RMP [21]. Поскольку наблюдаемое смещение является постоянным, но небольшим, RMP CDC обеспечивает практическую основу для стандартизации рутинных методов, используемых в клинической практике. Использование стандарта NIST, таким образом, нецелесообразно.

Холестерин ЛПВП

Источников установления точности для ЛПВП-ХС меньше, чем для ХС (см. табл. 2). Липопротеины представляют собой гетерогенную смесь липидов и белков, которые не определены до конца; поэтому в физических свойствах основных классов липопротеинов могут существовать пересечения. Частицы ЛПВП с различным содержанием ХС имеют целый ряд свойств, основанных на плотности, размере или электрофоретической подвижности. Разработка полной референтной системы для ЛПВП-ХС потребует ее более точного определения. До тех пор, пока не будет сформулировано четкое обоснование или консенсус в отношении определения первичных эталонных материалов для ЛПВП-ХС, измерение, соответствующее первичной RMP, не может быть разработано.

В настоящее время Рабочей группой по измерению липопротеинов NCEP рекомендована RMP CDC ЛПВП-ХС, многоступенчатая процедура, включающая ультрацентрифугирование, осаждение и анализ ХС [1, 6]. Этот метод включает разделение и удаление липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и хиломикронов, если таковые имеются, в течение 18,5 ч ультрацентрифугирования и разделения ЛПВП путем селективного осаждения не-ЛПВП (включая Lp(а), ЛППП и ЛПНП) из донной фракции бета-квантификации d≥1,006 кг/л с использованием 46 ммоль/л гепарина-марганца (Mn+2). ЛПВП-ХС в прозрачном супернатанте количественно определяется с помощью стандарта ХС CDC. Он тесно связан со стандартом CDC ЛПНП-ХС (см. ЛПНП-ХС ниже). Факторами, ограничивающими более широкое использование стандарта CDC ЛПВП-ХС для рутинной стандартизации измерений ЛПВП-ХС, являются требования к ультрацентрифугированию, технические сложности и требуемый большой объем образца (5 мл). Тем не менее этот метод служил основой для эпидемиологических и клинических исследований, спонсируемых CDC и NHLBI, и, таким образом, обеспечивал точность, на основе которой были получены точки принятия решений по оценке риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) NCEP. Аналитическая воспроизводимость метода, наблюдаемая в течение 1 года, составляет 1,4% CV. Этот метод также был признан JCTLM в качестве международного RMP более высокого порядка.

Чтобы обеспечить более широкую стандартизацию, CRMLN разработал специальный метод сравнения (DCM) для ЛПВП-ХС. Для этого метода нужен меньший объем образца (1 мл) и не требуется этап ультрацентрифугирования. Метод тесно связан с RMP CDC ЛПВП-ХС, и требование к меньшему объему образца упрощает взаимодействие с нужетелями [22]. В методике используется реагент для осаждения (сульфат магния — декстрана) и разделения не-ЛПВП, соответствующий эффективности разделения реагента гепарин-марганец, который используется в RMP CDC. Холестерин в супернатанте измеряется с помощью RMP CDC для холестерина. Ограничение концентрации триглицеридов в образцах сравнения до ≤200 мг/дл, или 5,18 ммоль/л, устранило необходимость в ультрацентрифугировании.

Холестерин ЛПНП

RMP CDC для ЛПНП-ХС является референтной для ЛПНП-ХС и рекомендована Рабочей группой по измерению липопротеинов NCEP [4]. Контрольная процедура CDC для ЛПНП-ХС выполняется точно так же, как описанная выше RMP CDC для ЛПВП-ХС, но она расширена и включает анализ нижней фракции после ультрацентрифугирования (d>1,006 Кг/л) с помощью RMP для холестерина. Расчет бета-квантификации таков: ЛПНП-ХС = холестерин нижней фракции — ЛПВП-ХС. Эталонная процедура CDC ЛПВП-ХС/ЛПНП-ХС основана на процедуре ультрацентрифугирования и бета-квантификации, используемой клиниками по исследованию липидов [23], но отличается температурой при центрифугировании (18 °C вместо 10 °C) и плотностью наложения физиологического раствора (0,195 М вместо 0,15 М). Поскольку применяется сыворотка вместо ЭДТА-плазмы, для ее осаждения используется более низкая концентрация гепарин-марганцевого реагента. Аналитические характеристики, наблюдаемые для вторичного стандарта CDC ЛПНП-ХС за период 1 год, составляют CV=0,6—1,1% для ХС нижней фракции и от 1,0 до 1,3% для ЛПНП-ХС. Этот метод также был признан JCTLM в качестве международной RMP более высокого порядка. Имеются вторичные референтные материалы по ЛПНП-ХС (см. табл. 2).

Создание системы для целевых значений ЛПНП-ХС, аналогичной таковой для общего ХС, осложняется несколькими проблемами. Подобно ЛПВП-ХС, основу для определения первичного эталонного материала для ЛПНП-ХС чрезвычайно трудно определить, поскольку и у отдельных лиц, и во всей популяции пациентов существует гетерогенная коллекция частиц ЛПНП с различным содержанием холестерина и разнообразными физическими свойствами: плотность, размер электрофоретическая подвижность. Таким образом, согласованных первичных референтных материалов для ХС-ЛПНП не существует, и, следовательно, не разработана и первичная RMP для измерения. Текущее рабочее определение ЛПНП-ХС на основе физического разделения (ультрацентрифугирования и химического осаждения) содержит смесь ХС липопротеинов, которая была определена как «ЛПНП-ХС» по данным NCEP и включает в себя некоторые Lp(a), ХС, ЛППП-ХС и основной уровень ЛПНП-ХС [4]. Рабочее определение ЛПНП-ХС также включает и рабочее определение ЛПВП-ХС, с учетом предположения о том, что специфичность на этапе осаждения достаточна для верного и последовательного отделения частиц ЛПНП от частиц ЛПВП.

Производители различных клинически применяемых прямых гомогенных методов определения ЛПНП-ХС, используя различные принципы измерения, которые не включают этап физического разделения, приняли вызов, связанный с различным содержанием ХС в гетерогенной смеси липопротеинов, называемых «ЛПНП-ХС». Обычно используемый расчет Фридевальда [24] для оценки ЛПНП-ХС на основе измерений липидного профиля представляет смесь ХС липопротеинов, аналогичную той, которую можно измерить при помощи вторичной RMP CDC.

Триглицериды

Вторичная RMP для триглицеридов была создана CDC в 1963 г. и служила основным источником точности в Программе стандартизации липидов (LSP) CDC-NHLBI. Она основана на методах Карлсона [25, 26], Ван Генделя и Зилверсмит [27] и Лофланда [28]. В 1993 г. RMP CDC была модифицирована с заменой хлороформа хлористым метиленом. Начальная стадия метода сочетает экстракцию хлористого метилена с обработкой кремниевой кислотой. Аликвоту экстракта триглицеридов гидролизуют до глицерина с использованием этанольного гидроксида калия с последующим окислением метапериодатом и проявлением цвета хромотропной кислотой. Обработка кремниевой кислотой эффективно удаляет фосфолипиды и свободный глицерин, а также большую часть моноглицеридов и часть диглицеридов.

Впоследствии NIST разработал первичную RMP для триглицеридов на основе IDMS [29]. Метод измеряет общее количество глицеридов, которое определяется как сумма три-, ди- и моноглицеридов плюс любой свободный глицерин. Общие глицериды измеряются большинством клинических лабораторий с использованием энзиматических методов определения триглицеридов.

Поскольку первичные и вторичные RMP для триглицеридов измеряют несходные аналитические виды, простое прямое сравнение двух методов невозможно. Наилучшим приближением является сравнение измеренного NIST результата для общего количества глицеридов с оцененным по CDC результатом для общего количества глицеридов. Оценка CDC для общего количества глицеридов получается добавлением результата CDC RMP по триглицеридам, большей части диглицеридов и небольшому количеству моноглицеридов к результату CDC для свободного глицерина. Для измерения концентрации глицерина в стандартных образцах липидов сыворотки CDC разработал метод изотопного разбавления-газовой хроматографии-масс-спектрометрии [30]. В предварительной оценке общее количество глицеридов для вторичной RMP CDC сравнивалось с общим количеством глицеридов, измеренным первичной RMP NIST, с использованием как замороженных, так и лиофилизированных пулов сыворотки. Среднее отклонение между 2 методами составило +1,1%.

Референтные материалы для ХС, ЛПВП-ХС, ЛПНП-ХС и ТГ

CLSI разработала процедуру (C37-A) для подготовки коммутативных стандартных образцов для ХС [31]. Также она может быть использована для ЛПВП-ХС, ЛПНП-ХС и ТГ [32, 33]. Она использовалась для подготовки NIST SRM 1951b. Это значение SRM было присвоено для первичных RMP NIST для ХС и общих глицеридов, и вторичных RMP CDC для ХС, ЛПВП-ХС, ЛПНП-ХС и ТГ. SRM 1951b — единственный доступный коммерческий референтный материал ХС-ЛПВП и ХС-ЛПНП. CDC также использует C37-A CLSI для приготовления вторичных референтных материалов для использования в Программе стандартизации липидов (LSP) и CRMLN, более подробно описанной ниже. Эти материалы оцениваются с использованием вторичных RMP.

Липопротеин(a)

Отсутствие стандартизации измерений Lp(a) затрудняет интерпретацию результатов различных клинических исследований для определения роли Lp(a) как фактора риска ишемической болезни сердца [34—37]. Для определения массы Lp(a) основная проблема сопоставимости связана с разницей размера Апо(a), которая приводит к завышению или занижению значений Lp(a). Неоднородность размеров Lp(a) обусловлена генетическим кодированием петлевых структур, стабилизированных внутрицепочечными дисульфидными связями, называемыми доменами крингла (K) K4 и K5. Это означает, что белки Апо(a), продуцируемые генами разных индивидуумов, могут демонстрировать изоформы размера, содержащие от 12 до приблизительно 50 петлевых структур K4 [38]. Сотрудничество между проектом стандартизации Lp(a), поддерживаемым NHLBI, в Лабораториях исследований липидного обмена и диабета Северо-Западного университета Вашингтона (NWLMDRL) и Рабочей группой Международной федерации клинической химии (IFCC) по Lp(a) привело к значительному прогрессу в разработке референтной системы Lp(a).

В качестве консенсусной RMP для стандартизации измерений Lp(a) с использованием моноклональных антител KIV9, рабочей группой IFCC был выбран метод ИФА [39]. Он использовался для присвоения целевого значения вторичному референтному материалу IFCC [36, 37] SRM 2B. Препарат пула лиофилизированной сыворотки был назначен Первым Международным референтным реагентом ВОЗ/IFCC для Lp(a) для иммуноанализа [40], он позволяет проводить калибровку на основе определенной молярной концентрации, а не неопределенной массы. Другие исследования показали, что лиофилизированный очищенный препарат Lp(a), по-видимому, соответствует всем критериям для первичного референтного материала [41].

Основной целью производителей наборов диагностических тестов Lp(a) должно быть производство тест-систем Lp(a), на которые не влияет разнообразие размера Апо(a).

Аполипопротеины A-I и B

Очищенный материал аполипопротеина A-I (АпоA-I), разработанный Европейским бюро референсов для использования в качестве основного стандарта [42], подходит для некоторых иммунохимических методов. Однако физические и химические свойства АпоB не позволяют очистить материал, для измерения иммунохимическим методом. Стабильная фракция ЛПНП, полученная ультрацентрифугированием (d=1,030—1,050 кг/л), которая исключает липопротеин средней плотности или Lp(a), в настоящее время служит основным стандартом для АпоB.

Идеальным подходом к установке необходимой точности было бы использование общепринятых первичных или вторичных RMP для присвоения значений в единицах массы аполипопротеина на вторичных референтных материалах (SRM) с соответствующей матрицей. Эти SRM затем могли бы быть использованы в качестве калибраторов для переноса единиц массы аполипопротеина на калибровочные материалы, используемые производителями наборов для измерения аполипопротеина. В настоящее время этот процесс невозможен, поскольку не существует общепринятых RMP для АпоA-I или АпоB² [43].

Первичные и вторичные RMP для белков зависят от высокоточных определений белка с помощью первичных стандартов. CDC исследовал и установил метод ферментативного расщепления, жидкостной хроматографии, IDMS для присвоения значений массы первичному стандарту АпоA-I для использования в качестве модели первичных референтных материалов аполипопротеинов [44].

Комитет IFCC по аполипопротеинам совместно с производителями диагностических наборов аполипопротеинов в 1988 г. начал совместную программу по созданию и оценке SRM для стандартизации измерений аполипопротеинов. В начале 1989 г. >20 производителей и несколько референтных лабораторий оценили 26 потенциальных стандартов и измерили 10 замороженных сывороток с присвоенными значениями для АпоA-I и АпоB. В качестве эталонных материалов были выбраны лиофилизированная сыворотка для АпоA-I и жидкая стабилизированная сыворотка для АпоB на основе однородности, стабильности, воспроизводимости и линейности при разведении. ВОЗ приняла эти 2 материала на основе сывороточной матрицы в качестве эталонных реагентов: SP1-01, лиофилизированный материал для АпоA-I, и SP3-08, замороженная стабилизированная жидкая заготовка для АпоB. Единицы массы были назначены с использованием стандартизированных методов иммуноанализа и очищенных АпоA-I и ЛПНП (d=1,030—1,050 кг/л) в качестве первичных калибраторов [45, 46].

Ресурсы, доступные для стандартизации

Программы стандартизации

Программой NCEP рекомендована прослеживаемость измерений липидов и липопротеинов до национальной возможно достижимой точности [3—6]. Эти рекомендации включают критерии качества для клинических лабораторных измерений (см. табл. 1). Достижение прослеживаемости точности для ХС, ТГ, липопротеинов и аполипопротеинов требует совместных усилий производителей реагентов и приборов, государственных учреждений и клинических специалистов. Чтобы выполнить свое обязательство по улучшению измерения факторов риска, связанных с ССЗ, CDC сосредоточился на: 1) оснащении референтных лабораторий высококачественными RMP по липидам и 2) предоставлении услуг по стандартизации американским и международным учреждениям общественного здравоохранения, эпидемиологическим, исследовательским лабораториям и производителям реагентов. Основными программами, доступными для оказания помощи лабораториям в стандартизации измерений липидов и липопротеинов, являются CDC-NHLBI LSP и CRMLN. Программы CDC отличаются от обычных программ внешней оценки качества (ВОК, РТ), в которых большинство клинических лабораторий участвует, чтобы соответствовать федеральным и государственным нормативным требованиям; они обеспечивают точность с помощью стандартов и коммутативных образцов для исследования. В отличие от них обычные программы ВОК оценивают средние значения участников на основе групп участников за определенное время. Таким образом, они оценивают, насколько хорошо лаборатория сравнима с другими лабораториями, использующими те же аналитические системы, но не предоставляют механизма для оценки или повышения точности. Кроме того, материалы, используемые в обычной ВОК, могут быть несовместимы с образцами пациентов; поэтому они не могут обеспечить прослеживаемость до принятого источника точности.

Программа стандартизации липидов CDC-NHLBI

Программа стандартизации липидов (LSP) началась в 1958 г., когда ученые, исследующие связь между концентрацией липидов в сыворотке крови и ССЗ, обеспокоились надежностью анализа липидов в лабораториях и сопоставимостью результатов между ними. В ответ на эту потребность CDC разработал RMP и материалы для стандартизации этих лабораторий и инициировал LSP в сотрудничестве с NHLBI.

LSP обеспечивает проверенный механизм для установления, оценки и повышения точности аналитических измерений через прослеживаемость до RMP CDC и стандартизации измеренных значений липидов и липопротеинов независимо от используемых аналитических систем [47]. Лаборатории стандартизированы с помощью поэтапного процесса, включающего квалификационную оценку и последующий ежеквартальный мониторинг. Успешное участие в ежеквартальных аналитических оценках дает лаборатории право на получение сертификата стандартизации. Протокол LSP разработан таким образом, чтобы лаборатория с максимально допустимым смещением и воспроизводимостью NCEP имела 95% вероятность прохождения оценки смещения. Лаборатории с меньшим смещением и воспроизводимостью имеют больше шансов на прохождение, в то время как лаборатории с большим смещением или воспроизводимостью будут иметь меньше шансов на прохождение. Оценки смещения и воспризводимости основаны на критериях NCEP, приведенных в табл. 1.

Сегодня LSP продолжает предоставлять референтные материалы на основе точности для измерения ХС, ТГ и ЛПВП-ХС в американских и международных лабораториях. LSP доступен для лабораторий, которые проводят эпидемиологические исследования и клинические испытания, лабораторий по исследованию липидов, лабораторий общественного здравоохранения и референтных лабораторий. Участники LSP поддерживают >100 исследований по изучению ССЗ и других связанных с ними факторов, включая диабет, питание, генетику и проблемы со здоровьем женщин и меньшинств. Стандартизация обеспечивает достоверные результаты и сопоставимость эпидемиологических исследований и клинических испытаний.

Стандартизация измерений с использованием обработанных референтных материалов, в том числе используемых в LSP, может быть затруднена из-за матрикс-эффекта в некоторых аналитических системах, поэтому для успешной работы в LSP требуется, чтобы аналитическая система участника демонстрировала незначительные матрикс-эффекты с использованием стандартных образцов CDC.

Для получения информации об участии в LSP CDC-NHLBI см. www.cdc.gov/labstandards/lsp.htm.

Сеть референтных лабораторий определения холестерина (CRMLN)

Когда NCEP опубликовал руководства по факторам риска атеросклероза [2] и дал рекомендации по оценке риска, CDC столкнулся с разработкой подхода к стандартизации клинических лабораторий, проводящих тестирование для ведения пациентов; однако количество лабораторий в Соединенных Штатах (>100 000) делает стандартизацию с использованием сравнения биоматериала пациентов практически невыполнимой задачей. Число же производителей, предоставляющих диагностические тесты для измерения липидов и липопротеинов, относительно невелико. Поэтому CDC сосредоточил свои усилия на производителях и учредил CRMLN для помощи в правильной калибровке своих измерительных систем и проверке прослеживаемости до необходимой точности с помощью программы сертификации.

В отсутствие коммутативных материалов для обеспечения точности рекомендуемый подход к оценке корреляции лабораторного метода заключается в прямом сравнении методов диагностики с RMP с использованием свежих образцов пациентов [48]. CRMLN была первой сетью, которая брала за основу сравнение свежих образцов для проверки точности, и поэтому теперь служит моделью для других аналитических систем [49]. Лаборатории CRMLN используют RMP CDC или установленные методы сравнения (DCMs), которые с ним тесно связаны. В CRMLN входят 3 лаборатории США и 6 международных лабораторий (перечислены в табл. 3).

Таблица 3. Программы сети референтных лабораторий холестерина

Эффективность всех методов, используемых в CRMLN для сертификации, контролируется 1 раз в 2 мес, включая анализ стандартных образцов сыворотки CDC. Лаборатории CRMLN, не отвечающие определенным критериям (табл. 4), должны улучшать и поддерживать качество в течение 2 последовательных контрольных измерений программы, прежде чем возобновить деятельность референтной лаборатории. Репрезентативные показатели эффективности лабораторий CRMLN за период с мая 2002 г. по июль 2007 г. показаны в табл. 4. В CRMLN для ЛПВП-ХС используются и RMP, и DCM. Все 10 лабораторий CRMLN выполняют DCM; 4 — выполняют RMP.

Таблица 4. Критерии и эффективность лабораторной сети эталонных методов определения холестерина

Примечание. ^a — доля = процент лабораторий CRMLN, соответствующих заявленному критерию; ^b — средние абсолютные значения смещения.

1. Сертификация систем приборов, реагентов и стандартных образцов

CRMLN использует протокол CLSI EP9-A в качестве основы для оценки прослеживаемости до необходимой точности [50]. Протокол сравнения требует анализа 40 свежих образцов сыворотки человека, охватывающих ожидаемый диапазон анализа. Результаты оцениваются на основе критериев эффективности NCEP. Для каждой аналитической системы (включая прибор, реагенты и калибратор), которая соответствует критериям, выдается сертификат прослеживаемости, действительный в течение 2 лет.

2. Сертификация клинических лабораторий

Для сертификации клинических лабораторий доступен сокращенный протокол определения общего ХС. Протокол требует, чтобы лаборатория анализировала 6 свежих образцов сыворотки в 2 экземплярах в каждом из 3 повторов. Значения ХС должны охватывать диапазон, включающий рекомендуемые NCEP точки принятия клинических решений для ХС 200 и 240 мг/дл (5,18 и 6,22 ммоль/л). Приемлемое аналитическое качество подтверждается Сертификатом прослеживаемости, который действителен в течение 6 мес. В настоящее время CRMLN не имеет специальной программы сертификации ЛПВП-ХС и ЛПНП-ХС для клинических лабораторий.

Список измерительных систем и клинических лабораторий с актуальной информацией о сертификации находится на сайте www.cdc.gov/lab-standards/crmln.htm. Также размещена информация о программах сертификации и контактная информация лабораторий CRMLN.

В дополнение к программам сертификации некоторые лаборатории CRMLN предлагают различные типы программ ВОК. Эти программы являются основными для многих международных членов CRMLN (табл. 3).

Стандартизация липопротеинов(а)

NWLMDRL — хранилище, а также распространитель SRM 2B для Lp(a). Он доступен по запросу производителям и клиническим лабораториям, но имеет определенные ограничения из-за разницы размера Lp(a). Исходное значение для SRM 2B указано в нмоль/л, и нет поправочного коэффициента для преобразования значений из нмоль/л в мг/дл, поскольку размер Lp(a) варьирует от <300 до >800 Кда. NWLMDRL также присваивает значения 5 отдельным образцам с низкими и высокими значениями Lp(a) и от малых до больших изоформ Апо(a). Они оцениваются по размеру с помощью SRM 2B. После переноса значения из SRM 2B на калибратор оцениваются лабораторные результаты повторных тестирований 5 образцов.

Программа стандартизации аполипопротеинов A-I и B

NWLMDRL проводит программу стандартизации для производителей, использующих протокол калибровки IFCC. Этот протокол включает процедуры оценки линейности и сравнения референтных материалов и процедур валидации с использованием свежей сыворотки. Референтными материалами, используемыми в этой программе, являются международные эталонные реагенты ВОЗ/IFCC для АпоA-I (SP1-01) и АпоB (SP3-08). CDC служит хранилищем этих материалов, доступных производителям для использования при назначении целевых значений калибраторам или материалам для контроля качества, а также для оценки качества новых аналитических систем. Эти эталоны также доступны международным референтным лабораториям, отвечающим за стандартизацию АпоA-I и АпоB в своей стране или регионе. Клинические лаборатории могут откалибровать или подтвердить точность своих анализов с использованием 3 пулов замороженной сыворотки с присвоенными значениями АпоA-I и B (прослеживаемыми до эталонных реагентов ВОЗ/IFCC), доступных в NWLMDRL. За дополнительной информацией можно обратиться в NWLMDRL, Вашингтонский университет, 401 Куин-Энн-авеню N, Сиэтл, Вашингтон, 98109; тел.: (206)685-3331.

Национальные программы квалификации

В США в 1988 г. Конгресс принял Поправки по улучшению клинических лабораторий (CLIA), устанавливающие стандарты качества для всех тестов, чтобы обеспечить точность, надежность и своевременность результатов тестирования пациентов независимо от того, где проводилось тестирование [51]. Этот закон установил стандарты для повышения качества тестирования в лабораториях США, выполняющих измерения биоматериала человека для диагностики, профилактики или лечения заболеваний. Список программ ВОК, одобренных Центрами медицинской помощи и услуг Medicaid (CMS), находится на сайте www.cms.hhs.gov/CLIA/downloads/ptlist.pdf. Некоторые из этих программ используют коммутативные материалы с переносом точности, другие — работают с лиофилизированным или стабилизированным биоматериалом. Оценка точности для большинства систем невозможна при использовании некоммутативных материалов, по этой причине аналитические характеристики участников должны оцениваться по группам. Важно подчеркнуть, что даже ВОК, основанный на точности, не предоставляет той же информации, что при проведении стандартизации. Сличительные испытания разово обеспечивают представление о том, как работает лаборатория, в то время как стандартизация предоставляет информацию во времени, что позволяет лаборатории вовремя проводить калибровку и чтобы измерения можно было проследить до стандартов более высокого порядка.

Проблемы программ стандартизации липидов и липопротеинов

Программы стандартизации, такие как программы сертификации LSP и CRMLN, предназначены для оценки точности, улучшения калибровки и обеспечения прослеживаемости методов более высокого порядка; однако процессы стандартизации не оценивают надежность методов. Так, оценке не подлежат, например, образцы пациентов с повышенным уровнем триглицеридов, определенными фенотипами липидов, некоторыми состояниями болезни или прием препаратов. Доступ к всеобъемлющим, репрезентативным выборкам для полной оценки эффективности метода — сложная задача в большинстве мероприятий по оценке методов. Поэтому необходимо проявлять осторожность при интерпретации сравнительных исследований в литературе. Первостепенное значение имеет: 1) является ли метод сравнения, используемый в этих исследованиях, стандартизированным и прослеживаемым до рекомендуемой точности, 2) коммутативны ли образцы, используемые для сравнения и 3) являются ли образцы, используемые для сравнения, подходящими для оценки устойчивости тест-системы.

Эти проблемы имеют особое значение при рассмотрении прямого тестирования ЛПВП-ХС и ЛПНП-ХС без автономной предварительной стадии фракционирования липопротеинов, такой как осаждение или ультрацентрифугирование. Эти методы получили быстрое признание благодаря простоте использования и хорошей воспроизвоимости. Однако достижение стандартизации гомогенных методов — более сложная задача, поскольку разделение требует, чтобы калибраторы включали нативные цельные липопротеины. Кроме того, гомогенные виды тестирования могут проявлять недостаточную специфичность в нетипичных образцах [52—54]. Производители этих реагентов продолжают изменять состав, стремясь его улучшить. Однако опыт показывает, что изменения, направленные на устранение помех, могут создать другие проблемы тестирования, например смещение. Кроме того, модификации реагентов делают ранее опубликованные аналитические характеристики неактуальными. Поэтому пользователи должны быть осведомлены о потенциальной неспецифичности и связанных с ней характеристиках реагентов и тщательно проверять перед использованием их приемлемость в интересующей популяции пациентов. Отдел липопротеинов и сосудистых заболеваний Американской ассоциации клинической химии решает эти проблемы, проводя оценку нескольких систем реагентов для ЛПВП-ХС и ЛПНП-ХС, используя различные типы образцов и сравнивая результаты с RMP CDC.

Общий холестерин

Среди липидов и липопротеинов общий холестерин был первым, прошедшим стандартизацию, этот аналит наиболее прост и наименее проблематичен. Из-за того, что некоторые аналитические системы демонстрируют влияние матрицы на изготовляемые материалы, использование сравнений нативных образцов в программах сертификации CRMLN доказало свою эффективность [55].

Холестерин ЛПВП

Был проведен обзор современного состояния измерения уровня ЛПВП-ХС [56]. Все автоматизированные тест-системы, использующие прямой гомогенный метод, доступный в настоящее время, были разработаны японскими производителями, которые сертифицировали эти продукты через CRMLN. Большинство из этих систем первичных реагентов продается другим производителям приборов и реагентов для распространения среди конечных пользователей. Хотя все системы первичных реагентов имеют сертификацию CRMLN, они специфичны для конкретных комбинаций приборов и калибраторов (см. www.cdc. gov/labstandards/crmln.htm) и не являются универсальными для всех версий, приборов и лотов реагентов. Точность может варьироваться в зависимости от изменений лота калибратора. В дополнение к запросу доказательств прослеживаемости от своих поставщиков пользователям рекомендуется подтверждать точность каждого нового лота калибраторов путем проведения исследований сравнения с ранее использованными лотами или прямым сравнением с лабораторией CRMLN.

При использовании формулы Фридевальда для оценки ЛПНП-ХС неточное измерение ЛПВП-ХС приводит к неверной классификации, поскольку существует обратная зависимость риска ЛПВП-ХС и ЛПНП- ХС, ошибочно сниженный ЛПВП-ХС приводит к ложно повышенному ЛПНП-ХС.

Особую осторожность следует проявлять лабораториям, занимающимся долгосрочными исследованиями (эпидемиологическими или клиническими испытаниями). Особую озабоченность вызывает отсутствие специфичности для нетипичных образцов и информации об эффекте заморозки. Кроме того, изменения, вносимые производителями во вкладыш реагентов, могут повлиять на результаты, особенно это касается долгосрочных исследований.

Клинические лаборатории должны взвесить преимущества (снижение трудозатрат, повышение точности, уменьшение объема образцов) и недостатки (отсутствие специфичности), чтобы решить, будут ли они применять однородные методы. При использовании однородных методов следует провести валидацию точности и прослеживаемости.

Холестерин ЛПНП

Большинство лабораторий (по крайней мере, 60% из тех, кто сообщает о ХС ЛПНП в 2007 г. в Колледж американских патологов [CAP]), использует уравнение Фридевальда [24] для подачи результатов по ЛПНП-ХС. Примерно 1% респондентов используют уравнение Делонга (где триглицериды делятся на 6); однако этот подход не имеет прослеживаемой точности и не рекомендуется NCEP. Использование уравнения Делонга может привести к ошибочным клиническим решениям. Поскольку общий ХС, ЛПВП-ХС и ТГ являются измеряемыми значениями, рассчитанный уровень ЛПНП-ХС подвержен независимым ошибкам в каждом из этих измерений. Таким образом, стандартизация общего ХС, ЛПВП-ХС и ТГ важна для расчета ЛПНП-ХС.

Количество лабораторий, использующих гомогенные методы определения ЛПНП-ХС, неуклонно растет (о чем свидетельствует доля лабораторий, участвующих в программах CAP). Однако в обзоре M.Nauck и соавт. сделан вывод о том, что необходима более тщательная оценка гомогенных методов, прежде чем их можно будет уверенно рекомендовать для замены расчета по Фридевальду [7]. В промежуточный период гомогенные методы могут быть полезны для определения ЛПНП-ХС у пациентов с ТГ выше порога Фридевальда 400 мг/дл (4,5 ммоль/л).

Производители, разработавшие эти принципы метода, сертифицировали свою продукцию через CRMLN (см. www.cdc. gov/labstandards/crmln.htm) и продемонстрировали, что тест-системы могут соответствовать рекомендациям NCEP по характеристикам правильности и воспроизводимости с использованием определенных образцов, собранных натощак, в которых нет нетипичных липопротеинов. Как и в случае гомогенных методов ЛПВП-ХС, те же проблемы касаются калибровки и назначения целевых значений производителями. Кроме того, условия хранения образцов не были оценены.

Триглицериды

Рутинные измерения ТГ создают особенную проблему матричного эффекта, возникающую в результате вклада свободного глицерина. Более 95% лабораторий в Соединенных Штатах используют ферментативные методы определения ТГ, которые неспецифически измеряют ТГ, диглицериды, моноглицериды и свободный глицерин (т.е. общее количество глицеридов). Необходимость вычитания свободного глицерина при тестировании на ТГ обсуждалась [57—59]. В крупном исследовании госпитализированных пациентов не было выявлено существенных клинических последствий для лиц, когда вычитание не использовалось, за исключением случаев, когда ожидалось аномально повышенное содержание глицерина [58]; однако при попытке стандартизировать измерения ТГ вычитание глицерина в сыворотке становится чрезвычайно важным. Содержание глицерина в коммерческих материалах, таких как образцы для специальных программ, контрольные образцы и калибраторы, может меняться в зависимости от матрицы исходного материала и обогащения для увеличения измеряемых концентраций липидов [60, 61]. Это может затруднить и стандартизацию измерений ТГ в клинических лабораториях, и оценку точности результатов. Однако при приготовлении из человеческой сыворотки образцов для специальных программ, стандартов и референтных материалов уровни свободного глицерина могут быть снижены до диапазона, обнаруженного в образцах пациентов. Поэтому очень важно, чтобы лаборатории оценивали каждый лот материала на наличие свободного глицерина, прежде чем использовать их для калибровки или оценки точности. Ошибки в измерении ТГ вносят вклад в результат измерения ЛПНП-ХС, полученный из уравнения Фридевальда, в котором предполагается, что (ЛПОНП-ХС) составляет ¹/₅ от ТГ.

Липопротеин(a)

Стандартизация Lp(a) остается сложной из-за разнообразия его размеров. Хотя некоторые современные методы Lp(a) менее чувствительны к различным размерам изоформ, чем другие, ни один из них не является по-настоящему независимым от них [36]. Трудности, связанные со стандартизацией Lp(a), дополнительно усугубляются представлением результатов в молярности (нмоль/л).

Программа стандартизации аполипопротеинов A-I и B

Стандартизация AпоA-I и AпоB в рутинных лабораториях затруднена из-за отсутствия вторичной RMP и комплексной программы стандартизации. Программа, доступная через NWLMDRL, служит промежуточным решением.

Выводы

Усилия Соединенных Штатов и международного сообщества по реализации программ, направленных на стандартизацию, в значительной степени способствовали улучшению измерений липопротеинов и их составляющих. Это достижение в свою очередь сделало научные и эпидемиологические исследования более надежными и в конечном счете улучшило ведение пациентов с риском развития ССЗ. Наличие RMP, более коммутативных материалов и различных программ стандартизации сыграло важную роль в повышении надежности факторов рисков измерений. Хорошо выполненная стандартизация может существенно повысить качество лабораторных измерений. С другой стороны, опыт показывает, что неадекватные или плохо продуманные программы стандартизации могут сделать результаты менее надежными. Двигаясь в будущее, аналитические системы, безусловно, станут еще более сложными благодаря новым технологиям, чипам, панелям с несколькими анализируемыми веществами и все более сложным анализируемым веществам, таким как подклассы липопротеинов и липидные и белковые компоненты. Поэтому методы и программы стандартизации должны развиваться, совершенствоваться, чтобы соответствовать этим вызовам. Эффект стандартизации заключается в том, чтобы сделать аналиты универсальными в том смысле, что они могут быть определены на различных платформах с эквивалентными результатами и едиными точками принятия клинических решений. Следует признать, что, несмотря на все усилия, некоторые из более сложных аналитов и систем могут не иметь возможности стандартизации с помощью доступных в настоящее время программ. Это особенно верно в отношении новых аналитов и систем, для которых производители, возможно, в сотрудничестве со специализированными лабораториями, должны взять на себя ответственность за поддержание надежности результатов в отсутствие стандартизации или стандартизации таких измерений.

¹ Перевод: О.С. Плеханова

Редактор перевода: А.В. Мошкин

² Примечание редакции. В статье от 2019 года Langlois MR. et.al, Quantifying atherogenic lipoproteins for lipid-lowering strategies: consensus-based recommendations from EAS and EFLM, https://doi.org/10.17116/labs20211001145) представлена следующая информация: Количественное определение аполипопротеинов на основе тандемной масс-спектрометрии (ЖХ/МС/ МС) дает надежду на дальнейшую стандартизацию измерения апоB100 и улучшение сопоставимости между методами. Поэтому IFCC инициировала разработку ЖХ/МС/МС в качестве окончательного референтного метода для определения апоB (V. Delatour et al, Comparability of Lipoprotein Particle Number Concentrations Across ES-DMA, NMR, LC-MS/MS, Immunonephelometry, and VAP: In Search of a Candidate Reference Measurement Procedure for apoB and non-HDL-P Standardization; https://doi.org/10.1373/clinchem.2018.288746). Еще одним преимуществом ЖХ/МС/МС является то, что он проводит одновременное (мультиплексное) измерение нескольких аполипопротеинов в дополнение к апоB100 за один цикл анализа, и это позволяет оценить полный профиль аполипопротеинов у пациента, включая ЛПВП- и ЛПОНП-ассоциированные аполипопротеины, для всесторонней характеристики дислипидемий (I.Broek et al, Automated Multiplex LC-MS/MS Assay for Quantifying Serum Apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with Qualitative Apolipoprotein E Phenotyping; https://doi.org/10.1373/clinchem.2015.246702)