Изучение противомикробной активности топических препаратов, применяемых при лечении папулопустулезных дерматозов лица

В настоящее время микробиологические аспекты папулопустулезных дерматозов лица подвергаются пересмотру из-за меняющихся взаимоотношений между микроорганизмами, колонизирующими кожу, и человеком. Как правило, микробиоценоз кожи при акне характеризуется выраженными качественно-количественными нарушениями [1]. Известно, что в норме с участков кожи, характеризуемых повышенной жирностью, выделяются Propionibacterium spp., а также Staphylococcus hominis, Staphylococcus epidermidis, Malassezia spp. [2]. Традиционно считается, что микробный фактор патогенеза акне связан прежде всего с факультативным анаэробом Cutibacterium (Propionibacterium) acne. Этот липофильный условно-патогенный микроорганизм в норме поддерживает кислое значение pH кожного сала, предотвращая рост грамположительных патогенных бактерий (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes). При акне антигены C. acne выступают в роли триггера, инициирующего активацию экспрессии толл-подобных рецепторов, стимулирующего продукцию провоспалительных цитокинов (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα), что обусловливает хронический воспалительный процесс [3]. Часто у пациентов с акне выявляется не только высокая интенсивность микробного обсеменения кожи Cutibacterium (Propionibacterium) acnes (до 10⁵ КОЕ/см), но и увеличение числа таксономических групп, видовое разнообразие, многочисленность штаммов с преобладанием симбиотически ассоциированных форм микроорганизмов. Например, в исследовании М.Б. Дрождиной и соавт. [4] показано, что микробиом кожи пациентов с акне значительно чаще представлен анаэробными бактериями (Cutibacterium acnes, Cutibacterium granulosum, Prevotella melaninogenica, Peptostreptococcus anaerobius) и факультативно-анаэробными кокками (бактериями рода Enterococcus) по сравнению с кожей интактных пациентов. Отмечен высокий уровень обсемененности кожи лица Staphylococcus spp. при акне. Так, в микробиологических и клинических исследованиях, проведенных Е.С. Снарской и соавт. [1], установлено, что преобладающим (36,5%) видом стафилококков являлся Staphylococcus aureus, что позволило отнести его к причинно-значимому виду при развитии воспалительных элементов акне. Помимо этого, у всех пациентов на коже встречались Cutibacterium (Propionibacterium) acnes. В исследовании А.Ю. Сергеева и соавт. [5] изучена стафилококковая фракция микробиома кожи у взрослых пациентов, установлено доминирование S. aureus, его существенная роль в патогенезе акне, выраженная устойчивость к ряду антибактериальных средств, применяемых в терапии дерматоза. В связи с вышеизложенным некоторые авторы считают, что микробными триггерами при акне помимо Cutibacterium (Propionibacterium) acnes могут быть другие представители микробиоты кожи лица (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum) [4—6].

Часто участниками микробных ассоциаций становятся бактерии и микроскопические грибы. Дрожжеподобные липофильные грибы Malassezia spp. являются типичными представителями нормофлоры на участках кожи, богатых сальными железами. Malassezia spp. под влиянием факторов экспосома могут являться триггерами для Toll-подобных рецепторов в коже, активирующими каскад воспалительных реакций, например при себорейном дерматите [3, 7].

Исследователи отмечают активный синергизм между Malassezia furfur, Candida albicans, Cutibacterium acnes, Staphylococcus spp. и энтеробактериями [8]. Изменение микробного пейзажа кожи больных разной степени тяжести имеет последовательный характер, проявляющийся на уровне микробиоценозов. Для M. furfur и C. acnes характерна высокая флористическая значимость на стадии возникновения заболевания. Значимость Staphylococcus spp. и Candida spp. увеличивается по мере усиления воспалительного процесса [7]. Изменение микробиоты кожи при акне является причиной тяжелых клинических ситуаций, обусловливающих возрастающие трудности в терапии данных пациентов. Так, в исследовании Е.В. Файзуллиной и соавт. [9] установлено, что микробиом кожи больных акне представлен смешанной микробиотой. Выявлено более тяжелое клиническое течение дерматоза, худший ответ на топическую терапию при наличии у 67,6% пациентов сопутствующей микотической флоры (преимущественно Malassezia furfur и Candida albicans). В работе О.А. Сидоренко и соавт. [10] выявлены особенности микробиоты кожи у пациенток с acne tarda в отношении трех микроорганизмов: Actinomyces viscosus, Clostridium difficile и Clostridium perfringens. Данные изменения не были характерны для пациентов с вульгарными акне с преобладанием C. acne, что свидетельствует о более глубоких нарушениях микробиоценоза при поздних акне.

Большое значение имеет и усиливающаяся антибиотикорезистентность C. acnes и других представителей микробиоты кожи лица к топическим противоугревым препаратам, содержащим антибиотики [11]. Это приводит к необходимости комбинированной противоугревой терапии с применением противомикробных препаратов с широким спектром действия [9, 12].

Одним из примеров сочетания наружного ретиноида и противомикробного препарата является зарегистрированный в России для лечения акне в 2020 г. гель Метрогил А. Комбинированный препарат для наружного применения содержит адапален, обладающий комедонолитическим, себостатическим и противовоспалительным действием, подавляющий метаболизм арахидоновой кислоты, АР-1-факторы и экспрессию Toll-подобных рецепторов 2-го типа, а также метронидазол — противомикробный препарат, активный в отношении простейших и анаэробов [13].

Цель исследования — тестирование гелей для наружного применения на эталонных и клинических штаммах бактерий и микроскопических грибов, часто выявляемых в микробиологических посевах от пациентов с акне.

Оценку частоты встречаемости и видового разнообразия грибов у больных акне проводили путем ретроспективного анализа журналов учета микробиологических анализов в лаборатории микробиологии и микологии КНИИЭМ Роспотребнадзора за 2017—2022 гг. Так, наиболее распространенными микроорганизмами были Cutibacterium acnes, Staphylococcus aureus, энтеробактерии, а также Malassezia furfur и Candida albicans [9]. В качестве примера грамотрицательной микрофлоры взят штамм Klebsiella oxytoca; в связи со сложностью культивирования Malassezia furfur в исследование включены два вида дрожжевых грибов (Candida albicans и Rhodotorula mucilaginosa), которые относятся к различным таксономическим группам.

Тестируемые гели для наружного применения: адапален 0,1% + метронидазол 1% (1), адапален 0,1% (2), бензоил пероксид 2,5% + адапален 0,1% (3), адапален 0,1% + клиндамицин 1% (4).

Противомикробную активность промышленных гелей измеряли на тест-культурах: бактерии — Staphylococcus aureus, Cutibacterium acnes, Klebsiella oxytoca, микроскопические грибы — Candida albicans, Rhodotorula mucilaginosa.

Противомикробную активность веществ in vitro изучали методом диффузии в агар в соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета [14]. Для проведения испытания использовали по 50 мг гелей. Для приготовления бактериальной суспензии культуры микроорганизмов, выращенные на плотной питательной среде в течение 18—24 ч, смывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Бактериальную суспензию каждого микроорганизма доводили до мутности, соответствующей концентрации 1∙10⁹ клеток/мл, что соответствует 3 единицам Макфарланда. Для приготовления суспензии микромицетов культуры дрожжевых грибов, выращенные на плотной питательной среде в течение 24 ч, смывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Суспензию грибов каждого вида доводили до мутности, соответствующей концентрации 1∙10⁶ клеток/мл. На площадь поверхности плотной питательной среды (агар Мюллера—Хинтона, Сабуро) в чашке Петри наносили микробную/грибную взвесь в объеме 100 мкл и распределяли стерильным шпателем по всей площади. После высыхания микробной/грибной взвеси в лунки наносили исследуемые гели и отправляли на инкубацию при 30°C в течение 2 сут. По истечении указанного времени измеряли диаметры зон задержки роста.

В ходе анализа противомикробной активности взятых образцов на тест-культурах получены результаты, представленные в таблице. Гель 1, содержащий адапален 0,1% + метронидазол 1%, оказывал бактериостатическое и фунгистатическое действие на все виды тестируемых микроорганизмов. Так, в отношении Cutibacterium acnes он проявлял умеренную активность. В отношении других видов микроорганизмов активность геля 1 колебалась в широких пределах (рисунок). Гель 2, содержащий адапален 0,1%, не проявлял антимикробную активность по отношению ко всем видам микроорганизмов. Гели, содержащие фиксированные комбинации адапалена 0,1% с метронидазолом 1% (1), адапалена 0,1% с бензоила пероксидом 2,5% (3), адапалена 0,1% с клиндамицином 1% (4), проявляли активность в отношении бактериальной группы микроорганизмов. Гель 4, в состав которого входит клиндамицина фосфат 1,0%, был активен только в отношении грамположительных бактерий Staphylococcus aureus и Cutibacterium acnes. Следует отметить, что фиксированная комбинация адапалена 0,1% с клиндамицином 1% не оказывала фунгицидного действия на дрожжевые грибы (Candida albicans и Rhodotorula mucilaginosa). Гель 3, в состав которого входит бензоила пероксид 2,5%, оказывал бактерицидное действие на Staphylococcus aureus и Klebsiella oxytoca, в отношении Cutibacterium acnes оказывал бактериостатическое действие и был неактивен по отношению к микромицетам.

Диаметр зон ингибирования роста тест-культур для изученных препаратов, мм (M±m)

Примечание. M±m — среднее арифметическое ± ошибка среднего значения при статистическом уровне значимости p<0,05.

Изучение противомикробной активности веществ invitro методом диффузии в агар. Шифр образцов гелей для наружного применения.

1 — адапален 0,1% + метронидазол 1%; 2 — адапален 0,1%; 3 — бензоил пероксид 2,5% + адапален 0,1%; 4 — адапален 0,1% + клиндамицин 1%.

Метронидазол, действующее вещество геля 1, обеспечило препарату Метрогил А широкий спектр активности.

Преимущества геля 1, содержащего адапален 0,1% + метронидазол 1%, по сравнению с другими фиксированными комбинациями:

— антибактериальное действие широкого спектра по отношению как к грамположительной флоре (Cutibacterium acnes, Staphylococcus aureus), так и к грамотрицательным бактериям;

— подавление роста условно-патогенной грибковой микрофлоры;

— не содержит антибиотик, следовательно, не способствует развитию антибиотикорезистентности.

При тестировании гелей для наружного применения на эталонных и клинических штаммах бактерий и микроскопических грибов, часто выявляемых в микробиологических посевах от пациентов с акне, обнаружено, что препарат Метрогил А in vitro обладает широким спектром противомикробной активности в отношении Cutibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Klebsiella oxytoca, а также дрожжеподобных грибов Candida albicans и Rhodotorula mucilaginosa.

Благодарность: авторы выражают благодарность ООО «Юник Фармасьютикал Лабораториз» за содействие в написании статьи.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: И.М. Хисматулина, С.А. Лисовская

Сбор и обработка материала: С.А. Лисовская, И.М. Хисматулина

Статистическая обработка данных: С.А. Лисовская

Написание текста: С.А. Лисовская, И.М. Хисматулина

Редактирование: И.М. Хисматулина

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements: the authors express their gratitude to Unique Pharmaceutical Laboratories LLC for their assistance in writing the article.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study: I.M. Khismatulina, S.A. Lisovskaya

Collecting and interpreting the data: S.A. Lisovskaya, I.M. Khismatulina,

Statistical analysis: S.A. Lisovskaya

Drafting the manuscript: S.A. Lisovskaya, I.M. Khismatulina

Revising the manuscript: I.M. Khismatulina