Наиболее часто встречающейся патологией слизистой оболочки полости рта (СОПР) является красный плоский лишай (КПЛ) — хроническое воспалительное заболевание, в патогенезе которого определяются иммунные, нейроэндокринные, интоксикационные и метаболические отклонения [1, 2]. КПЛ характеризуется полиморфизмом симптомов клинического проявления, возможностью злокачественной трансформации очагов поражения и частой резистентностью к проводимой терапии [1—4].

Согласно результатам эпидемиологических исследований [5—7], КПЛ встречается у 0,1—2% населения, чаще у женщин в возрасте от 40 до 65 лет. Несмотря на совершенствование современных методов диагностики, отмечают тенденции роста числа больных данным дерматозом и развития заболевания в более молодом возрасте, особенно при локализации КПЛ на СОПР [8]. Возможно, это объясняется существенными изменениями реактивности организма на наличие недиагностированной папилломавирусной инфекции (ПВИ) [9, 10].

Вирус папилломы человека (ВПЧ) — это ДНК-содержащий вирус, репликация которого осуществляется в пролиферирующих эпителиальных клетках. В настоящее время идентифицировано более 120 типов ВПЧ. Определенные виды данного вируса относят к высокому риску малигнизации, именно они являются причиной около 40% случаев заболевания раком СОПР [11].

Сочетанное хроническое течение эрозивно-язвенной формы КПЛ и ПВИ обусловливает значительное повышение онкогенного потенциала. По современным представлениям, в основе злокачественной трансформации клеток лежит активация единичных или множественных клеточных онкогенов или генов-супрессоров. Высокоинформативным диагностическим значением при прогнозировании течения злокачественных опухолей обладают маркеры пролиферации [3].

Пролиферативная активность является ведущим фактором как в механизме злокачественной трансформации клеток, так и в биологическом поведении уже возникших опухолей. Перспективным маркером данной группы является антиген Ki-67, экспрессирующийся практически во всех фазах клеточного цикла и соответственно отражающий величину пролиферативного пула. Ген, кодирующий данный маркер, расположен на длинном плече 10-й хромосомы. Ki-67 относится к регуляторным белкам, его появление совпадает с вступлением клетки в митоз, что позволяет использовать его в качестве универсального маркера при оценке роста злокачественных опухолей [12—14].

Цель исследования — изучить пролиферативную активность эпителиоцитов по экспрессии антигена Ki-67 у больных КПЛ эрозивно-язвенной формы при выявленной и невыявленной ПВИ на СОПР.

Под наблюдением находились 48 пациентов (36 (75%) женщин и 12 (25%) мужчин в возрасте от 43 до 68 лет (средний 57,43±2,53 года)) с эрозивно-язвенной формой КПЛ СОПР. Длительность заболевания составила от 6 мес до 9 лет (5,58±1,26 года). Пациентам было проведено комплексное обследование по общепринятой методике, включающее определение и систематизацию основных жалоб, анамнез жизни и заболевания, внешний и локальный осмотр. Анализировали системное здоровье по результатам обследования участковым терапевтом, эндокринологом, гастроэнтерологом, стоматологом и другими специалистами.

Границы патологического процесса (площадь поражения СОПР) определяли с помощью контактного неинвазивного метода — эпилюминесцентной диаскопии. По площади пораженной поверхности устанавливали тяжесть заболевания: тяжелая (площадь 3 см²), средняя (площадь от 1 до 3 см²), легкая (площадь менее 1 см²).

Выявление ДНК ВПЧ проводили методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени на термоциклере Rotor Gene 6000 («QIAGEN», Германия). Для определения генотипа ВПЧ использовали наборы реагентов производства ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Пролиферативную активность клеточных популяций на СОПР оценивали с помощью иммуногистохимического метода с определением антигена Ki-67. Для данного исследования образцы фиксировали в течение суток в 10% растворе нейтрального формалина на фосфатном буфере (pH 7,5), обрабатывали по общепринятым методикам с заливкой в гистовакс. Серийные срезы изготавливали на микротоме Leiсa, окрашивали с помощью набора NovoLink (PolimerDetectionSystem). В качестве первичных антител использовали RTU-Ki-67-MM1 (NovocastraTM).

Полученные результаты обработаны статистическими методами вариационного и корреляционного анализа с использованием ПК IBM/PC Pentium 4 и пакета прикладных программ для статистической обработки Excel 7 и SPSS 17.0. В малых выборках клинические и лабораторные данные обрабатывали с использованием среднеарифметических значений и их ошибки по таблице t-Стьюдента. Для нахождения различий между качественными показателями использовали метод χ² с поправкой Йейтса на непрерывность.

По результатам ПЦР-диагностики персистенция ВПЧ на СОПР была выявлена у 29 (60,41%) больных КПЛ СОПР (1-я группа). Распределение по типам вируса ВПЧ представлено на рис. 1.

У 19 (39,58%) больных КПЛ СОПР (2-я группа) было констатировано отсутствие персистенции ВПЧ.

При иммуногистохимическом исследовании выявлены следующие закономерности. При изучении материала маркер Ki-67 был определен у 21 (72,41%) пациента 1-й группы. Минимальный уровень экспрессии составил 18%, максимальный — 47% (средний показатель 42,9%). У больных 2-й группы Ki-67-позитивные клетки были выявлены у 2 (10,52%) пациентов, экспрессия варьировала в пределах от 12 до 31% (средний показатель составил 27,05%). Сравнительные данные групп представлены на рис. 2.

При КПЛ СОПР в 1-й группе отмечали более выраженные нарушения процессов ороговения, пролиферации и дифференцировки эпителиоцитов, что клинически выражалось более глубоким и обширным язвенным дефектом на СОПР.

Анализ тяжести заболевания по группам в зависимости от выявленной ПВИ представлен в табл. 1.

Показательно, что в 1-й группе у 20 (68,96%) больных определялось тяжелое непрерывнорецидивирующее течение заболевания с наличием выраженного отечно-болевого, особенно при приеме раздражающей и горячей пищи; сенсорно-парестетического с преобладанием жгучих и покалывающих ощущений и дисгевзического симптомов. Средняя степень течения отмечалась чаще во 2-й группе — у 13 (76,47%) больных: легкие формы дерматоза не были зарегистрированы ни у одного больного в обеих группах.

По результатам регистрации данных анамнеза и эффективности предшествующей терапии установлено, что во 2-й группе течение КПЛ СОПР было более благоприятным, что выражалось в достоверно продолжительной ремиссии по сравнению с 1-й группой, а проводимая терапия способствовала более выраженному и быстрому клиническому эффекту.

По результатам иммуногистохимического исследования было установлено, что на непораженной ВПЧ слизистой оболочке положительно окрашенные Ki-67 ядра выявлялись только в базальных эпителиоцитах генеративного слоя с частотой 15,48±0,41%. У больных КПЛ СОПР и персистенцией ПВИ индекс меченых клеток был в 2,9 раза выше и составлял 45,0±1% (р<0,05). Было зафиксировано также, что у больных 1-й группы меченые клетки встречались в более высоких слоях, в частности в шиповатом.

Наибольшая пролиферативная активность (43,75±1,34%) эпителиоцитов в очагах поражения была зарегистрирована у 7 (24,13%) больных1-й группы. Анамнестические данные свидетельствовали о том, что у этих больных манифестация КПЛ на СОПР была одной из наиболее ранних и отмечалась в возрасте от 35 до 40 лет (табл. 2).

Примечательно, что именно у этих пациентов продолжительность заболевания составляла более 6,5 года. Сведения представлены в табл. 3.

При иммуногистохимическом исследовании пролиферативной активности эпителиоцитов выявлено достоверное повышение процентного содержания Ki-67 положительно окрашенных ядер у больных 1-й группы. Следует отметить значительное «размывание» и расширение границ пролиферативного пула эпителиоцитов у больных КПЛ СОПР c выявленной ПВИ: меченые клетки встречались в более высоких слоях (в частности, в шиповатом), что, по данным литературы [15], может указывать на раннюю неопластическую трансформацию клеток многослойного плоского эпителия СОПР. Обнаружен ряд закономерностей: высокий процент экспрессии белка Ki-67 коррелирует с продолжительностью течения КПЛ на СОПР, возрастом начала заболевания и тяжестью его течения. Выявлено, что у пациентов 1-й группы эффект от проводимой терапии оценивали как отрицательный или кратковременный.

Частота выявления Ki-67 положительно окрашенных ядер в эпителии слизистой оболочки щеки тесно связана с вовлечением в процесс ВПЧ. Пролиферативный потенциал эпителиоцитов СОПР соответствовал экспрессии антигена Ki-67, качественно и количественно был выше у пациентов с КПЛ СОПР и выявленной ПВИ. Достоверно установлено более тяжелое течение КПЛ при сочетанном течении дерматоза на слизистой оболочке на фоне ПВИ, что сопровождалось резистентностью к традиционным методам лечения.

Сведения об авторах

Ю.Н. Перламутров — д.м.н., проф., заведующий кафедрой кожных и венерических болезней МГМСУ им. А.И. Евдокимова. https://orcid.org/0000-0002-4837-8489

В.А. Старшинина — асп. кафедры кожных и венерических болезней МГМСУ им. А.И. Евдокимова. https://orcid.org/0000-0001-5171-268X

К.Б. Ольховская — к.м.н., доцент кафедры кожных и венерических болезней МГМСУ им. А.И. Евдокимова. https://orcid.org/0000-0003-4920-5288

Автор, ответственный за переписку: Старшинина Виктория Александровна — ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, Москва, Россия.
e-mail: starshinina_v@rambler.ru