Введение

Терапия иммунобиологическими средствами, такими как бактериофаги, становится многообещающей стратегией, на которую врачи возлагают большие надежды при лечении больных с гнойными ранами и бактериальной хирургической инфекцией кожи и мягких тканей различной этиологии и локализации, особенно при наличии в очаге микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью.

Бактериальные инфекции кожи и мягких тканей сохраняют лидирующие позиции в структуре обращаемости за хирургической помощью во всем мире, достигая 30—40%, и могут всерьез влиять на прогноз заживления ран [1]. Инфицироваться могут любые раны, что обусловлено рядом факторов, включая воздействие окружающей среды, состояние кожи и наличие внутренних источников инфекции в организме пациента.

За последние несколько лет выявлено несколько профилей устойчивости к антибактериальным препаратам, включая фенотипы с множественной лекарственной устойчивостью, широкой лекарственной устойчивостью и панлекарственной устойчивостью [2]. Наиболее распространенными микроорганизмами, которые способны вызывать раневую инфекцию и часто обладают резистентностью к традиционным антибактериальным препаратам, являются Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae и Acinetobacter baumannii [2, 3].

Бактериофаги — вирусы, поражающе бактериальные клетки, были открыты более века назад французским ученым д’Эреллем [4]. Они имеют узкий спектр активности, что позволяет избежать такой проблемы, как влияние на всю микробиоту с элиминацией потенциально полезных бактерий, чрезмерным ростом вторичных патогенов и появлением резистентных форм микроорганизмов [5, 6].

В работе A. Pinto и соавт. (2020) [7] показано, что фаговая терапия может с успехом использоваться при лечении хронических ран различной этиологии и локализации, имеет широкий спектр эффективности в отношении метициллинрезистентного золотистого стафилококка (MRSA) и высокий профиль безопасности для пациентов. Фаговая терапия нашла свое применение в различных областях хирургии. Так, в клиническом наблюдении описанном J. Mulzer и соавт. (2020) [8] сообщается об использовании бактериофагов у пациента с ишемической кардиомиопатией после установки искусственного левого желудочка (LVAD), осложнившейся инфицированием послеоперационной раны S. aureus. В.А. Митиш и соавт. (2023) продемонстрировали успешное общее и местное применение бактериофагов в комбинации с терапией отрицательным давлением (ЛОД) в составе комплексного хирургического лечения гнойного процесса в мягких тканях на фоне системного аутоиммунного заболевания [9]. Ряд работ показывает высокую эффективность применения бактериофагов для профилактики инфекций после свободной кожной пластики [10].

Терапия фагами находит свое место и в лечении пациентов с травмами спинного мозга, у которых зачастую имеется инфекция мочевыводящих путей, спровоцированная E. coli [11]. Способность фагов разрушать биопленки и уничтожать бактерии, заключенные в них, открывает новые горизонты в лечении инфекций мягких тканей и костей у больных, перенесших спинномозговую травму [12].

Изучение влияния бактериофагов на микробиоту, а также на процессы очищения и заживления ран и их продолжительность, представляет собой перспективное направление. Особенно актуальным оно становится для коморбидных пациентов с гнойными ранами различной этиологии и локализации или при наличии трудностей с подбором рациональной системной антибактериальной терапии (например, при выраженной хронической почечной недостаточности или после трансплантации почки, аутоиммунных заболеваниях, серьезных проблемах с обменом веществ и метаболизмом), что и легло в основу настоящей работы.

Цель исследования: анализ эффективности применения фаговой терапии в сравнении с традиционными методами местного медикаментозного и системного лечения у коморбидных пациентов с хирургической инфекцией различной этиологии и локализации посредством изучения микробиологического спектра, цитологии раневых отпечатков, морфологического и электронно-микроскопического исследования биоптатов тканей.

Материал и методы

В проспективное рандомизированное сравнительное клиническое исследование последовательно включены 70 больных, лечившихся в отделе ран и раневых инфекций ФГБУ «НМИЦ хирургии им. А.В. Вишневского» Минздрава России в 2022—2024 гг. в рамках протокола постмаркетинговой НИР «Исследование эффективности и безопасности препарата «Пиобактериофаг комплексный» жидкий в лечении гнойных ран различной этиологии и локализации у взрослых с 18 до 60 лет» (одобрение ЛЭК №7/2НИР-22 от 31.05.2022). При поступлении в стационар у всех больных диагностировано наличие гнойно-некротического очага или раны различной этиологии и локализации. В день госпитализации у всех больных брали образцы раневого отделяемого для микробиологических исследований, раневых отпечатков для цитологических исследований и биоптатов ран для электронно-микроскопического анализа, что служило отправной точкой для проведения дальнейшей работы. На каждом этапе лечения проводили фотодокументирование раны с последующей планиметрией («АналиРан», Россия). Всем пациентам выполнили хирургическую обработку гнойно-некротического очага или раны. После оперативного вмешательства, получения результатов лабораторных исследований и определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам и бактериофагам пациентов рандомизировали в одну из 3 групп (рандомизация пациента в группу с применением фаговой терапии была возможна при получении положительного ответа о чувствительности выделенных микроорганизмов к «Пиобактериофаг комплексный» жидкий, далее, Пиофаг (АО «НПО Микроген», Россия). В последующем каждые 2±1 сут в течение 8±1 сут брали биоптаты тканей и раневые отпечатки для качественного и количественного микробиологического исследования, цитологического и гистологического анализа с целью контроля за динамикой раневого процесса и эффективностью лечения.

В ходе исследования у всех пациентов анализировали клинические (отек, боль, характер раневого отделяемого, появление грануляционной ткани), лабораторные (наличие и регресс признаков системного ответа на наличие очага хирургической инфекции), микробиологические (качественные и количественные), цитологические и электронно-микроскопические показатели. Параметрические данные оценивали на основании средних (M) и стандартного отклонения (SD) по 4 точкам исследования: точка 1 (2±1 сут), точка 2 (4±1 сут), точка 3 (6±1 сут) и точка 4 (8±1 сут). Для определения статистической значимости результатов при межгрупповом сравнении (p) использовали критерий для несвязанных выборок Манна—Уитни (U-критерий). Конечной точкой исследования являлся переход течения раневого процесса в фазу регенерации, характеризующийся низким уровнем микробной обсемененности, регенераторным или регенераторно-воспалительным типом цитограмм, наличием грануляционной ткани (степень ее зрелости могла быть различной).

Результаты

Первая группа (n=20) — после хирургической обработки гнойного очага назначали Пиофаг как местно в рану, так и внутрь (per os) по 20 мл 3 раза в сутки согласно инструкции к применению (системная и местная антибактериальная терапия не проводилась, антисептики не использовали). В группу вошли 11 (55,0%) мужчин и 9 (45,0%) женщин. Средний возраст пациентов составил 47,2±18,6 года у мужчин и 59,0±11,5 года — у женщин. С гнойно-некротическими ранами (синдром диабетической стопы) при сахарном диабете 2-го типа было 10 (50,0%) пациентов, с ранами передней стенки грудной клетки вследствие хронического послеоперационного остеомиелита грудины и ребер при сахарном диабете 2-го типа — 2 (10,0%), с инфицированными свищевыми ходами после имплантации левожелудочковой системы вспомогательного кровообращения HeartMate 3 («Abbott», США) — 2 (10,0%), с гнойно-некротическими ранами (синдром диабетической стопы) при сахарном диабете 1-го типа после аллотрансплантации почки — 2 (10,0%), с атипичными инфицированными ранами мягких тканей на фоне аутоиммунных (ревматоидный артрит, васкулиты), онкологических (лейкозы) заболеваний — 2 (10,0%), с глубоким пролежнем левой седалищной области у пациента с врожденной спинномозговой грыжей, дилатационной кардиомиопатией, нижней параплегией, с нарушением функции тазовых органов и выраженным сколиозом — 1 (5,0%), с нагноившейся кистой эпителиального копчикового хода при синдроме множественной фолликуллярной окклюзии — 1 (5,0%).

Вторая группа (n=20) — после хирургической обработки гнойного очага, при достижении стабильного гемостаза (1—3 сут послеоперационного периода) начинали терапию ЛОД VitMobil («VitMedical», Россия) с инстилляцией Пиофага по 20 мл 3 раза в сутки согласно инструкции к препарату (системная и местная антибактериальная терапия не проводилась, антисептики не использовали). Режим инстилляции Пиофага продолжительностью 90 мин 3 раза в сутки сменялся режимом постоянного ЛОД на уровне –120 мм рт.ст.; замену флакона с бактериофагом осуществляли ежедневно, а смену вакуумной повязки — 1 раз в 3—5 сут в зависимости от степени экссудации и переносимости терапии, всего требовалось 2—3 смены повязок. В группу вошли 15 (75,0%) мужчин и 5 (25,0%) женщин. Средний возраст пациентов составил 56,4±8,3 года у мужчин и 51,8±12,3 года — у женщин. С гнойно-некротическими ранами (синдром диабетической стопы) при сахарном диабете 2-го типа было 6 (30,0%) пациентов, с атипичными инфицированными ранами мягких тканей на фоне системных, аутоиммунных, онкологических заболеваний — 6 (30,0%), с инфицированными свищевыми ходами в пределах мягких тканей и костей (седалищная, большеберцовая кость) — 3 (15,0%), с гнойно-некротическими ранами крестцово-копчиковой области (глубокий пролежень) — 3 (15,0%), с ранами передней стенки грудной клетки вследствие хронического послеоперационного остеомиелита грудины и ребер при сахарном диабете 2-го типа — 2 (10,0%).

Третья группа (n=30) — группа сравнения, в которой после хирургической обработки гнойного очага назначали системную антибактериальную терапию препаратом широкого спектра действия из группы фторхинолонов (левофлоксацин по 500 мг 2 раза в сутки внутрь или внутривенно капельно) и местное медикаментозное лечение ран (водные растворы антисептиков, многокомпонентные мази на полиэтиленгликолевой основе с фторхинолонами — мазь Офломелид). В группу вошли 22 (73,3%) мужчин и 8 (26,7%) женщин. Средний возраст больных составил 60,8±12,8 года у женщин и 53,3±13,0 года у мужчин. С гнойно-некротическими ранами (синдром диабетической стопы) при сахарном диабете 2-го типа было 14 (46,7%) пациентов, с инфицированными ранами мягких тканей на фоне аутоиммунных (ревматоидный артрит, васкулиты), онкологических (лейкозы), сосудистых (хроническая венозная, артериальная недостаточность) заболеваний — 7 (23,3%), с гнойно-некротическими ранами (синдром диабетической стопы) при сахарном диабете 1-го типа — 4 (13,3%), с инфицированными ранами или свищевыми ходами и вовлечением костей (глубокие пролежни) — 3 (10,0%), с ранами передней стенки грудной клетки вследствие хронического послеоперационного остеомиелита грудины и ребер при сахарном диабете 2-го типа — 2 (6,7%).

Наилучшие клинические результаты получены во 2-й группе исследования (использование инстилляционной фаговой терапии с ЛОД), в которой уже к 4-м суткам после хирургической обработки раны или гнойно-некротического очага наблюдали купирование отека, гиперемии, отсутствие гнойного отделяемого, начальные признаки появления грануляционной ткани даже несмотря на наличие сахарного диабета, аутоиммунных или онкологических заболеваний (табл. 1; рис. 1, 2). В целом во всех группах удалось достичь ключевой конечной точки при хорошем профиле переносимости и безопасности терапии, летальных исходов не было. Статистически значимых различий в сроках перехода течения раневого процесса при лечении пациентов монофаговой терапией (местно и внутрь) или системной и местной антибактериальной терапией не получено (p>0,5), однако при монотерапии раствором Пиофага мы заметили более низкую приверженность лечению как у пациентов, так и медицинского персонала, связанную с большей кратностью процедур (3 перевязки в сутки, влажная прохладная повязка, 3 приема раствора Пиофага внутрь, который должен храниться в холодильнике и транспортироваться с соблюдением холодового режима). На этом фоне 1 перевязка в сутки с мазью на полиэтиленгликолевой основе и двухкратное введение антибактериальных препаратов выглядят комфортнее и экономичнее, но помня о высоком профиле безопасности фаговой терапии и возрастающей проблеме полирезистентности, важно предусмотреть способы доставки бактериофагов в рану (очаг хирургической инфекции) с целью снижения процента выявления указанных выше особенностей. В частности, инстилляционная терапия растворами бактериофагов в отсутствие противопоказаний к применению ЛОД выглядит наиболее перспективной для местной доставки, а производство и регистрация готовых растворов бактериофагов для внутривенного введения должно стать важной вехой в системной терапии тяжелой хирургической инфекции.

Таблица 1. Характеристика результатов лечения

Примечание. * 1 балл — плохое купирование болевого синдрома, низкая приверженность; наличие слабо выраженных нежелательных явлений и побочных реакций (головная боль, головокружение, тошнота), не ограничивающих повседневную активность; 2 балла — средняя скорость купирования болевого синдрома, умеренная приверженность терапии, наличие нескольких слабо или умеренно выраженных нежелательных явлений и побочных реакция, не ограничивающих повседневную активность; 3 балла — быстрое купирование интенсивности боли и высокая приверженность терапии, наличие выраженных нежелательных явлений и побочных реакций.

Рис. 1. Обширная гнойно-некротическая рана левых стопы и голени после хирургического лечения флегмоны (St. aureus 10⁷ КОЕ/г, Ps. aeruginosa 10⁵ КОЕ/г, воспалительный тип цитограмм).

Рис. 2. Обширная гранулирующая рана левых стопы и голени на 7-е сутки после повторной хирургической обработки, 2 сеансов локального отрицательного давления с инстилляцией раствора Пиофага (St. epidermidis 10¹ КОЕ/г, регенераторный тип цитограмм).

Микробиологическое исследование

Из тканевых биоптатов и раневого отделяемого 70 включенных в исследование больных выделено 772 штамма, их структура отражена в диаграмме (рис. 3). Наиболее часто в очагах хирургической инфекции наблюдали смешанную аэробную (60,9%) и смешанную аэробно-анаэробную флору (21,7%) наблюдений, монокультуру выделили в 17,4% случаев.

Рис. 3. Структура и абсолютные значения выделенных из ран и очагов хирургической инфекции штаммов микроорганизмов.

1— P. aeruginosa; 2— K. pneumonia; 3 — E. coli; 4 — E. faecalis; 5 — E. faecum; 6 — S. epidermidis; 7 — S. aureus.

Выделенные штаммы обладали хорошей чувствительностью к раствору Пиофага, особенно к наиболее частым возбудителям раневой хирургической инфекции St. aureus и St. epidermidis (табл. 2). В группе MRSA штаммов не обнаружено ни одного резистентного к Пиофагу, в то время как среди штаммов MRSE встречались резистентные и слабочувствительные к бактериофагам клетки бактерий, но в целом Пиофаг продемонстрировал высокую литическую активность против MRSE. Все выделенные гипермукоидные вирулентные штаммы K. pneumonia, обладающие множественной резистентностью к антибиотикам (MBL штаммы), характеризовались 100,0 перекрестной чувствительностью к Пиофагу.

Таблица 2. Чувствительность выделенных штаммов к Пиофагу

Для сравнительного анализа микробиологической эффективности выбраны микроорганизмы, которые наиболее часто высевались во всех исследуемых группах — S. aureus и S. epidermidis.

При сравнении 1-й группы (Пиофаг местно и внутрь) с 3-й группой (системная и местная антибактериальная терапия) отмечали общую тенденцию к снижению количества микроорганизмов в 1 г тканевых биоптатов на всех точках исследования в обеих группах (табл. 3). Если при сравнении скорости снижения обсемененности ран S. aureus в точке 1 не выявили статистически значимого различия между двумя группами, то в точках 2—4 наблюдалась отчетливая статистически значимая (p<0,05) тенденция к снижению количественной микробной обсемененности, более выраженная для группы сравнения (3-я группа). Для S. epidermidis на всех точках исследования статистических различий между двумя группами обнаружено не было, однако средние количественные показатели прогрессивно снижались и свидетельствовали о переходе течения раневого процесса в фазу регенерации (менее 10³ КОЕ/г) к 8-м суткам наблюдения (4-я точка).

Таблица 3. Анализ количественной микробной обсемененности ран в группе применения Пиофага внутрь и местно с группой сравнения

При сравнении результатов, полученных во 2-й группе (Пиофаг инстилляция+ЛОД) и 3-й группе мы видим общую тенденцию к снижению количества микроорганизмов в ране на всех точках исследования в обеих группах (табл. 4). Обсемененность S. aureus статистически значимо быстрее снижалась во 2-й группе на всех точках исследования (p<0,05). Для S. epidermidis межгрупповые различия были статистически незначимы, но количественные показатели прогрессивно снижались в обеих группах и свидетельствовали о переходе течения раневого процесса в фазу регенерации к концу наблюдения.

Таблица 4. Сравнительный анализ количественной микробной обсемененности ран во 2-й группе — применения Пиофага (инстилляция) и локального отрицательного давления и в 3-й группе

Межгрупповой анализ количественных показателей микробной обсемененности ран и гнойно-некротических очагов больных всех групп показал, что локальное и системное использование Пиофага любыми путями доставки сопоставимо (нет статистически значимых различий) с применением системной и местной антибактериальной терапии в отношении основных возбудителей хирургических инфекций кожи и мягких тканей. Сочетанное использование местной фаготерапии (инстилляционная доставка в очаг) и ЛОД достоверно быстрее снижает микробную обсемененность до критического уровня 10⁵ КОЕ/г и менее, что свидетельствует о потенцирующем действии обоих методов лечения.

Цитологическое исследование

В настоящей работе нас интересовала не столько динамика изменения цитологии раневых отпечатков, сколько количественные изменения и типы клеток, присутствующие в ранах больных 3 групп в разные временны`е интервалы после хирургической обработки гнойного очага. Проанализированы количественные изменения содержания нейтрофилов, макрофагов, и лимфоцитов.

Нейтрофилы

Нейтрофилы играют важную роль в течении раневого процесса. Они участвуют в борьбе с инфекционными агентами и способствуют регенерации тканей [13—15].

Сравнительный анализ среднего содержания нейтрофилов в раневых отпечатках больных 1-й и 3-й групп показал, что хирургическая обработка раны приводит к снижению нейтрофилеза (точка 1) в обеих группах, с постепенным возрастанием их количества (точка 2). Далее до точки 3 исследования (6±1 сут) процент нейтрофилов в поле зрения оставался высоким, независимо от того проводили ли местное и системное лечение фагами или антибактериальными средствами (табл. 5). Выраженное снижение количества нейтрофилов в 1-й и 3-й группах происходило к точке 4 исследования (8±1 сут) и свидетельствовало о начале перехода течения раневого процесса в фазу регенерации. Межгрупповые различия были статистически незначимы (p>0,05), что демонстрирует сопоставимую эффективность монофаговой и антибактериальной терапии для данных больных.

Таблица 5. Сравнительный анализ среднего содержания нейтрофилов в раневых отпечатках, полученных из ран и гнойно-некротических очагов на фоне терапии бактериофагами и при антибактериальной терапии

При сравнении цитологических данных больных 2-й и 3-й групп также отмечали снижение количества нейтрофилов сразу после хирургической обработки и нарастание в послеоперационном периоде, более выраженное во 2-й группе (табл. 6). Кроме того, во 2-й группе наблюдали максимальную реакцию нейтрофилов к точке 2 исследования (4±1 сут), после чего происходило уменьшение их количества, свидетельствующее о стихании воспалительного процесса. Общая тенденция уменьшения количества нейтрофилов к точке 4 исследования отмечена во всех 3 группах больных. Пиковые значения средних уровней нейтрофилов на 4—6-е сутки исследования у больных 2-й группы связываем с действием ЛОД, усиливающим микроциркуляцию в ране и околораневой зоне, создающим рабочую гиперемию и привлечение и активацию клеток воспалительного ряда. Это на фоне снижения микробной обсемененности (бактерицидное действие фагов и эвакуация раневого отделяемого в контейнер вакуумной системы) способствует переходу течения раневого процесса в фазу регенерации в максимально физиологические сроки.

Таблица 6. Сравнительный анализ среднего содержания нейтрофилов в раневых отпечатках, полученных из ран и гнойно-некротических очагов на фоне инстилляции бактериофагов с локальным отрицательным давлением и при антибактериальной терапии

Макрофаги

Макрофаги играют ключевую роль в процессе заживления ран, регулируя все его фазы: воспаление, регенерацию и эпителизацию. Они имеют два фенотипа — провоспалительный (M1) и противовоспалительный (M2), могут переходить из одного в другой и при активации продуцировать интерлейкины различных типов (инициирующих воспалительный ответ или наоборот, способствующих заживлению ран) [16, 17]. В хронических ранах этот процесс замедлен, в связи с дисфункцией макрофагов в них наблюдается персистирующая воспалительная реакция, что задерживает рану в первой или переходной фазе течения раневого процесса и останавливает заживление [18].

Макрофагальная реакция в 1-й и 2-й группах (с применением бактериофагов) была достоверно значительно более выраженной, чем в группе сравнения, и сохранялась такой до точки 4 исследования (табл. 7, 8).

Таблица 7. Сравнительный анализ среднего содержания макрофагов в раневых отпечатках, полученных из ран и гнойно-некротических очагов на фоне терапии бактериофагами и при антибактериальной терапии

Таблица 8. Сравнительный анализ среднего содержания макрофагов в раневых отпечатках, полученных из ран и гнойно-некротических очагов на фоне инстилляции бактериофагов с локальным отрицательным давлением и при антибактериальной терапии

В силу того что клинически и микробиологически мы наблюдали постепенный переход от первой фазы течения раневого процесса ко второй во всех 3 группах больных, сохраняющаяся макрофагальная реакция косвенно может свидетельствовать о персистировании в раневых отпечатках макрофагов с противовоспалительным фенотипом.

Лимфоциты

Лимфоциты принимают непосредственное участие в процессе заживления ран, выполняя как регуляторные, так и модулирующие функции, способствуют неоваскуляризации и ремоделированию тканей, что важно для заживления [19, 20]. Отсутствие лимфоцитов в ране может привести к снижению ангиогенеза и ухудшению заживления, особенно при сахарном диабете [19].

В раневых отпечатках пациентов всех групп отмечали постепенное увеличение количества лимфоцитов в поле зрения, достоверно более выраженное в 1-й и 2-й группах по сравнению с 3-й группой (табл. 9, 10). Клинически мы отмечали снижение воспалительных реакций, в связи с чем привлечение в раневое ложе лимфоцитов, особенно значимое для пациентов с инстилляцией фагов и ЛОД, может свидетельствовать об активизации локального иммунного ответа на фоне происходящего в ране ремоделирования тканей при лечении биологическими лекарственными средствами.

Таблица 9. Сравнительный анализ среднего содержания лимфоцитов в раневых отпечатках, полученных из ран и гнойно-некротических очагов на фоне терапии бактериофагами и при антибактериальной терапии

Таблица 10. Сравнительный анализ среднего содержания лимфоцитов в раневых отпечатках, полученных из ран и гнойно-некротических очагов на фоне инстилляции бактериофагов с локальным отрицательным давлением и при антибактериальной терапии

Таким образом, сравнительный анализ клеточного состава раневых отпечатков демонстрирует классическую картину воспалительного ответа и ее постепенное угасание на фоне системной и местной антибактериальной терапии, в привычные хирургам сроки происходит переход течения раневого процесса в фазу регенерации, и это четко коррелирует с процессами, которые мы отмечаем клинически (купирование боли, отека, гиперемии, экссудации). Системное и местное использование бактериофагов в виде монотерапии или одновременно с вакуумированием усиливает местный воспалительный и иммунный ответы даже в хронических ранах пациентов с системными и аутоиммунными заболеваниями. Безусловно, необходимы молекулярно-генетические исследования раневого отделяемого для уточнения фенотипов содержащихся клеток и их роли в процессах регенерации при хронической хирургической инфекции у коморбидных больных.

Морфологическое и электронно-микроскопическое исследование

При морфологическом исследовании биоптатов ран в 3 группах пациентов в точке 1 исследования (2±1 сут) отмечали острое воспаление с обилием гнойно-некротических масс на поверхности раны, плотным лейкоцитарным инфильтратом с преобладанием нейтрофилов, в строме наблюдали выраженный отек с признаками лизиса.

Во точке 2 исследования (4±1 сут) во 2-й группе (инстилляция Пиофага и ЛОД) на фоне острого воспалительного процесса отмечали появление молодых фибробластов в виде пучков, что указывало на начало формирование грануляционной ткани. В 1-й и 3-й группах превалировали проявления гнойно-некротических процессов, признаки формирования грануляционной ткани полностью отсутствовали (рис. 4, а—в).

Рис. 4. Морфологические изменения в гнойно-некротических ранах в процессе лечения.

а—в — точка 2 исследования: а — 1-я группа: клеточный детрит, нейтрофильные лейкоциты, отек и лизис стромы; б — 2-я группа: в воспалительном вале пучки активированных фибробластов наблюдается формирование молодой грануляционной ткани; в — 3-я группа: клеточный детрит, нейтрофильные лейкоциты, отек и лизис стромы; г—е — точка 3 исследования: г — 1-я группа: формирующаяся грануляционная ткань, отсутствие четкой ориентации фибробластов; д — 2-я группа: равномерно созревающая грануляционная ткань с большим количеством сосудов капиллярного типа с тонкими стенками; е — 3-я группа: смешанная воспалительная инфильтрация грануляционной ткани с толстостенными капиллярами и узким просветом; ж—и — точка 4 исследования: ж — 1-я группа: клеточный детрит с нейтрофильными лейкоцитами, грануляции не формируются; з — 2-я группа: грануляционная ткань с вертикально ориентированными сосудами, небольшим количеством фибробластов; и — 3-я группа: смешанная воспалительная инфильтрация грануляционной ткани с толстостенными капиллярами и узким просветом.

К точке 3 исследования (6±1 сут) в 1-й группе пациентов, получающих Пиофаг местно и внутрь под слоем клеточного детрита отмечали формирующуюся грануляционную ткань с капиллярами, инфильтрацию нейтрофильными лейкоцитами. Во 2-й группе в равномерно созревающей грануляционной ткани отмечали большое количество сосудов капиллярного типа с тонкими стенками, что имеет огромное значение в физиологической регенерации ткани. Воспалительная инфильтрация носила смешанный характер, встречались единичные нейтрофилы. В 3-й группе (системная и местная антибактериальная терапия) у пациентов сохранялась выраженная нейтрофильная инфильтрация в виде струпа. Грануляции формировались неравномерно, в виде разрозненных толстостенных капилляров с узким просветом (рис. 4, г—е).

К точке 4 исследования (8±1 сут) в 1-й группе больных в формирующейся грануляционной ткани определяли увеличение клеточной плотности по сравнению с предыдущим сроком, при этом фибробласты не имели четкую ориентацию, что указывало на низкую зрелость грануляционной ткани и нарушения ее формирования. Воспалительная инфильтрация сохранялась и носила смешанный характер с примесью нейтрофилов. Во 2-й группе пациентов раневые дефекты были заполнены грануляционной тканью с вертикально ориентированными сосудами, небольшим количеством фибробластов, что характерно для зрелой грануляционной ткани. Воспалительная инфильтрация носила очаговый характер. В 3-й группе больных раны были заполнены грануляциями со смешанной воспалительной инфильтрацией, в пучках фиброцитов содержались сегментоядерные лейкоциты. Оставалось значительное количество сосудов с утолщенной стенкой (рис. 4, ж—и).

Как показало проведенное микробиологическое исследование, во всех группах больных наблюдали рост условно-патогенных возбудителей хирургических инфекций кожи и мягких тканей (главным образом стафилококков). Известно, что практически все бактериальные возбудители синтезируют большое количество внеклеточного полисахарида, образуя защитную биопленку вокруг колонии. Бактерии внутри биопленки более устойчивы к воздействию защитных сил организма и антимикробным препаратам. Поскольку S. aureus принадлежит ведущая роль в формировании микробных биопленок, было проведено электронно-микроскопическое исследование состояния биопленок в 3 анализируемых группах пациентов.

В точке 1 исследования во всех группах больных биопленку находили в гнойно-некротических ранах с неизмененными микроорганизмами, заключенными в однородный полисахаридный матрикс (рис. 5, а).

Рис. 5. Состояние биопленки в гнойно-некротических ранах в процессе лечения. Трансмиссионная электронная микроскопия.

а — точка 1 исследования в 1-й группе: фрагмент биопленки с неизмененными микробными клетками; б — точка 4 исследования в 1-й группе: фрагмент биопленки, микробная клетка (стрелка) заключенная в набухшую, расслоенную биопленку (звездочка); в — точка 4 исследования во 2-й группе: расслоение биопленки (звездочка) и потеря ее целостности (белая стрелка), микробные клетки (стрелка) с участками лизиса цитоплазмы; г — точка 4 исследования в 3-й группе: расслоение биопленки (стрелка); д — точка 4 исследования в 3-й группе: деструктивные изменения микробных клеток (стрелки). Длина масштабной линии соответствует 1 мкм.

В точках исследования 2 и последующих в 1-й и 2-й группах пациентов отмечали набухание, расслоение и фрагментацию биопленки (рис. 5, б). Микробные клетки претерпевали деструктивные ультраструктурные изменения, прогрессирующие к точке 4 исследования (рис. 5, в). Отмечали лизис цитоплазмы бактериальных клеток и фрагментарное отсутствие клеточной стенки. Деструкции подвергался матрикс биопленок — он терял однородность, просветлялся, появлялись тонкие электронно-плотные нити, идущие в разных направлениях (см. рис. 5, б, в).

В срезах, полученных из ран больных 3-й группы, мы также отмечали деструкцию биопленки и заключенных в нее микроорганизмов (рис. 5, г, д), однако эти изменения были не столь выраженными и наблюдались не во всех препаратах (хотя в целом подтверждались данные литературы об эффективности фторхинолонов в отношении биопленочных форм чувствительных микроорганизмов).

Таким образом, у пациентов 3 групп при сохранении фазности течения раневого процесса, характерных для всех ран, отмечали различия по скорости отдельных процессов. Так, во 2-й группе комплексное применение ЛОД и фаготерапии привело к более быстрому завершению фазы воспаления и переходу раневого процесса в репаративную фазу по сравнению с таковым у больных 1-й и 3-й групп, приблизившись к срокам перехода при раневом процессе, не осложненном хирургической инфекцией. Уже в точке 2 исследования (4±1 сут) во 2-й группе отмечали начало формирования грануляционной ткани, в 1-й и 3-й группах этот процесс происходил позже — в точках 3 и 4 исследования. Сокращение по времени первой фазы является необходимым условием для скорейшего развития и созревания грануляционной ткани, а в итоге, успешного завершения заживления гнойно-некротических ран любой этиологии и локализации.

Обсуждение

После открытия бактериофагов интерес к ним экспоненциально нарастал, а опыт успешного клинического использования накапливался. Мы обнаружили много работ отечественных ученых, вышедших в военное и послевоенное время, посвященных успешному применению монофаговой и комбинированной (вместе с хирургическим лечением) терапии в лечении тяжелой хирургической инфекции [21—23]. После 60-х годов XX века и вплоть до последних лет в доступной литературе сравнительных клинических и экспериментальных исследований эффективности фаговой терапии не найдено. Вероятнее всего, это связано с реформой фармакопеи. Впервые отдельная статья, посвященная бактериофагам, появилась в VIII фармакопее СССР, вышедшей в 1946 г. Однако вплоть до 1961 г. никаких требований к данным иммунобиологическим средствам не предъявляли, в связи с чем у клиницистов и микробиологов была возможность индивидуального подбора бактериофагов и приготовление коктейлей из них непосредственно «у постели больного». Начиная с IX фармакопеи, требования ужесточились, к показателям качества стали относить не только мутность, цветность и прозрачность, но и стерильность, микробиологическую чистоту, безвредность, стабильность, наличие примесей, пирогенность и др. [24]. Готовить и использовать коктейли из фагов, являющихся биологическими лекарственными препаратами, ex tempore стало невозможно, и это затормозило их применение вплоть до появления официнальных растворов.

В настоящее время коллекция фагов продолжает пополняться, микробиологические лаборатории многих лечебных учреждений передают образцы резистентных и полирезестентных штаммов, а готовые растворы, реализуемые через аптечную сеть, приближаются по своей эффективности к антибактериальным средствам широкого спектра действия (в частности, в нашей стране такую работу проводит крупнейший производитель иммунобиологических препаратов АО «НПО Микроген», Россия).

Заключение

Принципы лечения коморбидных больных с тяжелой хирургической инфекцией мягких тканей и костей в нашей стране по-прежнему строятся на методе активного хирургического лечения ран, разработанного в отделе ран и раневых инфекций Института хирургии им. А.В. Вишневского (ныне ФГБУ «НМИЦ хирургии им. А.В. Вишневского» Минздрава РФ) [25]. Применительно к первой фазе течения раневого процесса результаты лечения во многом будут зависеть от радикальности и тщательности первичной хирургической обработки гнойного очага, общего и местного лечения в периоперационном периоде. Возрастающая проблема резистентности, формирование в хронических ранах биопленочночных форм возбудителей, коморбидность, ограничивающая применение ряда антибиотиков резерва в виду их токсичности — определяют важность поиска альтернативных протоколов лечения таких сложных клинических ситуаций.

Результаты проведенного исследования продемонстрировали высокую эффективность бактериофагов как в монотерапии путем местного и системного использования, так и в сочетании с ЛОД, для лечения ран и гнойно-некротических очагов у коморбидных пациентов. Это подтверждено не только клинически, но и данными микробиологических, цитологических, морфологических и электронно-микроскопических исследований. Мы не заметили клинически значимых побочных реакций или плохой переносимости препарата Пиофаг. По нашему мнению, актуальность всех обсужденных в статье вопросов будет увеличиваться, и привычные способы (антибактерильные мази, растворы антибиотиков) не во всех случаях будут эффективны. Считаем крайне востребованным для практического здравоохранения продолжать исследовать и внедрять в комплексное лечение хирургической инфекции препараты бактериофагов, разрабатывать новые пути их доставки в очаг для поддержания необходимой концентрации и активности. В связи с этим для лечения раневой инфекции (в отсутствие противопоказаний и при наличии оборудования и расходных материалов) очень хорошо себя показывает инстилляционная вакуумная терапия, хотя возможно появление новых лекарственных форм (губок, гидрогелей) или имплантируемых устройств (протезы, шовный материал, импланты), покрытых бактериофагами.

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Митиш В.А.

Сбор и обработка материала — Митиш В.А., Хамидулин Г.В., Пасхалова Ю.С., Демидова В.С., Терехова Р.П., Паклина О.В.

Написание текста — Хамидулин Г.В., Пасхалова Ю.С., Чекмарева И.А.

Редактирование — Пасхалова Ю.С., Митиш В.А.

Работа выполнена в рамках постмаркетингового исследования «Исследование эффективности и безопасности препарата «Пиобактериофаг комплексный» жидкий в лечении гнойных ран различной этиологии и локализации у взрослых с 18 до 60 лет», финансированного АО «НПО Микроген» по договору №220920000301-220920000301-1-9200-196 от «02» августа 2022 года.