Введение

Лечение хронических ран различной этиологии составляет заметную долю рутинной медицинской практики. Скорость заживления раны зависит от ее этиологии и патогенеза, площади и глубины, активности иммунной системы, а также от общего состояния организма. Процессы, происходящие в заживающей ране, условно подразделяют на разграниченные и перекрывающиеся по времени фазы гемостаза, воспаления, пролиферации фибробластов, контракции клеток, ангиогенеза и реэпителизации [1, 2]. Молекулярные и клеточные механизмы ранозаживления, опосредующие пролиферацию разных типов клеток, перестройку и формирование нового клеточного матрикса и неоваскулогенез на разных этапах заживления ран, относительно хорошо изучены [2—5]. Особую роль в процессе заживления ран отводят макрофагам, переход которых от про- к противовоспалительному фенотипу в значительной степени определяет успех ранозаживления [6, 7]. С нарушением перехода макрофагов к противовоспалительному, регуляторному М2-фенотипу связывают развитие труднозаживающих ран [6—8], которые «консервируются» на воспалительной стадии ранозаживления. Лечение труднозаживающих ран и язв представляет значительную сложность. Причинами нарушения нормального течения репарационных процессов могут выступать: сахарный диабет, хроническая венозная или артериальная недостаточность, механическое сдавливание мягких тканей на опорных поверхностях (пролежни — декубитальные трофические язвы) и др. [9]. Распространенность декубитальных трофических язв составляет около 16% в ряду осложнений различных заболеваний, а у взрослых пациентов с тяжелой патологией спинного и головного мозга частота развития пролежней достигает 72% и более [10]. Хронические венозные трофические язвы нижних конечностей встречаются у 1—2% населения и являются причиной развития 50—70% хронических ран голени. В ¹/₄ случаев причиной развития язв голени является атеросклеротическое поражение артерий нижних конечностей с гемодинамически значимым снижением перфузии и оксигенации мягких тканей [11]. Особого внимания заслуживают язвенные дефекты при сахарном диабете (синдром диабетической стопы — СДС), которые развиваются вследствие диабетической нейропатии и поражения периферических сосудов. Ежегодно СДС диагностируется у 2—10% больных диабетом [12]. Следует также отметить, что процессы восстановления поврежденных тканей существенно замедляются с возрастом [13, 14]. Одно из перспективных направлений в лечении труднозаживающих ран и язв — использование медицинских изделий на основе коллагена [10, 15, 16—22].

Коллаген I типа является одним из наиболее распространенных структурных элементов в большинстве тканей, внеклеточным матриксным белком, в контакте с которым происходят рост и развитие клеток. Перестройка этого матрикса — один из ключевых элементов ранозаживления, в значительной степени определяющий течение этого процесса [23]. В связи с этим уже длительное время широкий спектр медицинских изделий на основе коллагена в виде повязок, покрытий, имплантатов, гелей успешно используется в медицинской практике [24]. Коллагеновые материалы активно применяются и при различных процедурах восстановления ткани. К их существенным достоинствам следует отнести крайне низкую токсичность и иммуногенность, а также их высокую эластичность, сходную с неповрежденной тканью. По степени сохранности структуры коллагена выделяют нативный и фракционированный коллаген. В процессе изготовления биоматериалов из нативного коллагена полностью сохраняется его естественная волокнистая структура, а клеточные элементы, участки кровеносных сосудов и волосяные фолликулы, напротив, удаляются, благодаря чему достигается низкая антигенность изделий. В отличие от фракционированного, нативный коллаген устойчив к воздействию раневой среды и дольше остается в раневом ложе [25]. Рассасываясь в процессе заживления, он замещается собственной тканью организма. Препараты нативного коллагена стимулируют регенерацию тканей. Нативный коллаген служит матрицей для направленной миграции макрофагов и фибробластов в раневое ложе, активирует хемотаксис, пролиферацию и секреторную активность клеточных элементов [25—29]. В экспериментах in vitro нативный коллаген способствовал ускорению образования межклеточного матрикса дермальными фибробластами. В экспериментах in vitro на матрице из нативного коллагена фибробласты демонстрируют экспоненциальный рост, тогда как на препарате фракционированного коллагена скорость пролиферации клеток значительно ниже [29]. При исследовании эндотелиальных клеток микрососудов дермы он вызывал активацию ангиогенеза [26]. Одним из возможных механизмов стимулирующего действия коллагена является его способность связывать и тем самым защищать от разрушения ферменты и физиологически активные вещества, вовлеченные в процесс ранозаживления: эластазу нейтрофилов, матриксную металлопротеазу-2, интерлейкины-6, 8 и 1, супероксиданион, пероксинитрат [27, 28, 30]. Примером медицинского изделия на основе нативного коллагена I типа является Коллост. При использованиим модели неосложненных полнослойных ран кожи у крыс показано усиление процессов регенерации при заживлении под различными формами этого изделия; наиболее выраженную стимуляцию эпителизации раневых дефектов наблюдали при применении гелевой формы биоматериала [31]. Интерес работы был обоснован изучением на клеточном уровне ранозаживляющего действия нативного коллагена I типа на примере медицинского изделия Коллост (7% гель) в модели труднозаживающих ран кожи у крыс.

Поскольку одним из основных факторов патогенеза хронических ран является ишемизация тканей, для решения этой задачи была использована современная валидированная модель ишемизированных полнослойных ран кожи у крыс [32, 33]. В этой модели характерное для лабораторных грызунов «стремительное» протекание репарационных процессов, обусловленное высокой скоростью метаболизма и особенностями строения кожи, было осложнено ишемизацией участка кожи, на котором формируют раны, — таким образом были созданы характерные для хронических труднозаживающих ран кожи человека условия.

Цель работы — оценка клеточных и молекулярных механизмов процесса ранозаживления в тканях ран крыс на фоне применения, нативного коллагена I типа.

Материал и методы

Исследование было выполнено на 72 самцах крыс популяции SD, свободных от видоспецифичных патогенов, производства ФИБХ РАН. На момент начала исследования возраст животных составлял 12 нед, масса тела — 300—350 г. Крыс содержали в барьерной зоне вивария в клетках открытого типа, до операции — группами по 4—5 особей, а после операции — изолированно. Температура в помещении для содержания составляла 20—24 °C, относительная влажность — 30—70%, длительность светового дня — 12 ч (включение света в 09:00). На протяжении всего исследования крысы имели неограниченный доступ к корму (Чара, «Ассортимент-Агро», Россия) и очищенной обратным осмосом воде. Длительность адаптации к новым условиям содержания после получения из питомника превышала 14 сут. Протокол исследования прошел биоэтическую экспертизу в комиссии по биоэтике ООО «НИИ Митоинженерии МГУ» (Протокол №131 от 31.05.18). Обращение с животными в исследовании соответствовало нормам Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях.

Путем рандомизации крыс разделили на 2 экспериментальные группы (по 36 особей). Ишемизированные полнослойные раны кожи создавали на спине животных, как описано в работах W. Conover и R. Iman [34] и A. Trujillo и соавт. [33]. Крыс наркотизировали сочетанным внутрибрюшинным введением золазепама, тилетамина (по 15 мг/кг каждого) и 5 мг/кг ксилазина. На подготовленной коже спины вдоль позвоночника делали 2 продольных разреза кожи на полную толщину и отсекали кожу от подлежащей ткани, формируя тем самым лоскут шириной 3 см и длиной 10 см. Под лоскут подкладывали силиконовую пластину (0,5×30×100 мм) и сшивали края ран полиглактиновой нитью (Vicryl, Ethicon, США). По середине длины и в 6 мм от краев сформированного ишемизированного лоскута биопсийным ножом формировали 2 полнослойные раны диаметром 6 мм. Сразу после операции животным опытной группы в края ран (4 точки примерно по 0,05 мл) и в ее просвет наносили гель Коллост 7% (ЗАО «БиоФАРМАХОЛДИНГ», Россия). На раны животных контрольной группы помещали гидроколлоидную повязку Comfeel Plus (Colopast, Дания). После нанесения изделий раны покрывали повязкой Hydrofilm (Hartmann, США), края которой дополнительно фиксировали к здоровой коже сандарочным клеем (Kryolan, Германия). Поверх повязки Hydrofilm наносили фиксирующую повязку Бинтли (ООО «ГК Пальма», Россия), препятствовавшую повреждению пленки и расчесыванию ран.

У части животных (предназначенных для эвтаназии через 14 сут после операции) каждые 2-е сутки проводили фотосъемку ран для фотопланиметрического определения площади ран с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH, США). Через 3, 7 и 14 сут после операции из эксперимента выводили по 12 особей из каждой группы; одну из двух ран иссекали для гистологического исследования, а вторую — для оценки экспрессии маркеров репарационного процесса молекулярно-биологическими методами. Для гистологического исследования ткани раны иссекали с окружающей здоровой кожей (3—5 мм) и фиксировали в забуференном фосфатом 4% формалине. В рамках гистологического исследования тканей ран оценивали степень эпителизации, выраженность других элементов репарации и воспаления, иммуногистохимическими методами — число миофибробластов, М2-макрофагов, васкуляризацию. Для молекулярно-биологического исследования ткани раны иссекали, по возможности не захватывая здоровую кожу, замораживали в жидком азоте и сохраняли при температуре не выше 70 °C. РНК выделяли из измельченных при помощи ударной ступки (в замороженном виде) тканей при помощи набора RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit (Qiagen, США). Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени оценивали экспрессию генов TNF, IL-1β, PDGFα, TGFβ1, COL1α2, VEGF, ACTA1, MMP-1.

Статистический анализ данных проводили при помощи программного обеспечения Prism, версия 8.1 (GraphPad», США) методом двухфакторного (факторы «группа» и «срок») дисперсионного анализа, при необходимости — после преобразования данных в логарифмы для соблюдения гетероскедастичности и нормальности. Для попарных сравнений использовали критерии Сидака или Тьюки. Различия считали значимыми при p<0,05. Данные представлены в виде среднего±стандартная ошибка среднего.

Результаты

По данным фотопланиметрического измерения площади ран (рис. 1, на цв. вклейке), за 14 сут наблюдения у животных, получавших нативный коллаген I типа (Коллост-гель 7%), площадь ран статистически значимо снижалась на 64±2% — с 29,6±1,4 до 10,4±0,7 мм². У крыс на фоне применения медицинского изделия сравнения площадь ран изменялась незначительно и к 14-м суткам после создания дефекта была только на 2±15% ниже, чем в день создания дефекта. В вариабельность данных о площади ран значимый вклад вносили факторы «Группа» (F_{1, 22}=26,36; p<0,0001), срок (F_{7, 154}=10,13; p<0,0001) и их взаимодействие (F_{7, 154}=18,39; p<0,0001).

Рис. 1. Данные фотопланиметрического измерения площади ран на 14-е сутки после создания дефекта кожи.

а — фотографии ран крыс опытной и контрольной групп; б — динамика площади ишемизированных полнослойных ран кожи у крыс, получавших коллаген (КОЛЛ) или «стандартное» медицинское изделие (СИ). Статистика: ^$ — p<0,05 по отношению к «СИ», ^# — p<0,05 по сравнению с величинами в день формирования дефекта, тест Сидака.

Fig. 1. Data of photopolarimetric measurement area of the wounds on the 14th day after the creation of skin defect.

a — picture of rats wounds from the experimental and control groups; b — dynamics of the area of ischemic full-thickness skin wounds of rats treated with collagen (CALL) or «standard» medical device (SI). Statistics: $ — p<0.05 in relation to «SI», ^# — p<0.05 in comparison with the values on the day of the defect formation, Sidak’s test.

Данные об эпителизации ран крыс на 3, 7 и 14-е сут после создания дефекта, полученные при гистологическом иследовании, полностью соответствовали данным фотопланиметрического исследования (рис. 2, а, в, на цв. вклейке). Эпителизация ран крыс, получавших коллагеновый биоматериал, прогрессивно увеличивалась со временем и к 14-м суткам составляла 97±3%, в то время как раны животных, получавших «стандартное» лечение, начинали покрываться новообразованным эпителием значительно позже и к 14-м суткам наблюдения эпителизация составляла только 28±8%. В целом вариабельность данных об эпителизации определялась факторами «Группа» (F_{1, 66}=35,05; p<0,0001) и «Срок» (F_{2, 66}=33,08; p<0,0001), а также их взаимодействием (F_{2, 66}=11,33; p<0,0001), что отражает различную динамику процесса эпителизации ран у животных разных групп: репарация раны крыс на фоне «стандартного» лечения была значительно замедлена. Площадь грануляционной/рубцовой ткани (см. рис. 2, г, на цв. вклейке), была значимо выше у животных опытной группы (F_{1, 66}=8,44; p=0,0050), прогрессивно возрастала во времени (F_{2, 66}=16,96; p<0,0001) со сходной для обеих групп динамикой (взаимодействие «Группа´Срок»: F_{2, 66}=0,68; p=0,5110). Однако выраженные различия в площади грануляционной ткани в ранах у крыс опытной и контрольной групп на 3-и сутки после операции не достигали уровня статистической значимости (p=0,0792).

Рис. 2. Данные гистологического исследования тканей ран у животных обеих групп.

а — типичные микрофотографии срезов ран крыс контрольной и опытной группы на 3, 7 и 14-е сутки после создания дефекта кожи. Гематоксилин и эозин; б — типичные микрофотографии препаратов, окрашенных на CD31, гладкомышечный актин, CD163.

Fig. 2. Data of histological examination of animals wound tissues in animals — both groups.

a — typical microphotomicrographs of section rats wounds of the control and experimental groups on the 3rd, 7th and 14th days after the creation of the skin defect. Hematoxylin and eosin; b — typical microphotographs of preparations stained for CD31, smooth muscle actin, CD163.

Рис. 2. Данные гистологического исследования тканей ран у животных обеих групп.

в — эпителизация поверхности; г — площадь грануляционной ткани; д — степень нейтрофильной инфильтрации; е — васкуляризация; ж — число М2-макрофагов; 3 — миофибробластов ран крыс, получавших Коллост гель (заштрихованные красные столбики) или медицинское изделие сравнения (пустые черные столбики). Число наблюдений на в—д — 12, е—з — 6 для каждой временной точки в группе. Статистика: ^$ — p<0,05 по отношению к «СИ», тест Сидака.

Fig. 2. Data of histological examination of animals wound tissues in animals — both groups.

c — epithelialization of the surface; g — the area of granulation; d — the degree of neutrophilic infiltration; e — vascularization; g — the number of M2-macrophages; 3 — myofibroblasts from the rats wounds treated with Collost gel (shaded red bars) or a reference medical device (empty black bars). The number of observations on b—d — 12, e—z — 6 for each time point in the group. Statistics: $ — p<0.05 in relation to «SI», Sidak’s test.

При этом выраженность нейтрофильной инфильтрации тканей ран (рис. 2, д, на цв. вклейке) также статистически значимо отличалась между группами (F_{1, 64}=9,77; p=0,0027) на разных сроках после операции (F_{2, 64}=6,88; p=0,0020). Характер изменения степени нейтрофильной инфильтрации во времени существенно различался у крыс разных групп (взаимодействие «Группа´Срок»: F_{2, 64}=4,90; p=0,0105). Значимые межгрупповые отличия были установлены на 3-и сутки заживления, когда нейтрофильная инфильтрация у крыс группы, в которой использовался Коллост была существенно ниже, чем у животных на фоне применения «стандартного» лечения. Следует отметить, что в этот период у крыс группы «стандартной» терапии ткани в просвете раны практически отсутствовали, таким образом, снижение нейтрофильной инфильтрации указывает не на снижение выраженности воспаления у этих животных, а на замедление репарационных процессов, что согласуется с данными фотопланиметрического исследования.

Среди различных возможных характеристик степени васкуляризации тканей раны, на рис. 2, е, на цв. вклейке, показана доля площади грануляционной ткани, занимаемая срезами сосудов. На ранних сроках заживления у крыс, получавших Коллост, отмечали характерную для ранних этапов ранозаживления крайне высокую васкуляризацию грануляционной ткани, которая резко снижалась по мере созревания сосудов и деградации их «избыточного» количества. У животных, получавших медицинское изделие сравнения, васкуляризация на 3-и сутки после операции практически отсутствовала (как и сама грануляционная ткань), а на более поздних — не отличалась от показателей крыс опытной группы. Эти данные также подтверждают более быструю динамику репарационного процесса ран у животных на фоне применения Коллост и свидетельствуют о более длительном репарационном процессе на фоне «стандартной» терапии. Значимое влияние на вариабельность этого показателя оказывало только взаимодействие факторов «Группа´Срок» (F_{2, 30}=7,05; p=0,0031), а влияние факторов «Группа» (F_{1, 30}=3,15; p=0,0859) и «Срок» (F_{2, 30}=2,10; p=0,1398) не достигало уровня статистической значимости.

Число М2-макрофагов (CD163-положительные клетки) в тканях ран крыс (см. рис. 2, б, ж, на цв. вклейке) на фоне применения коллагена было статистически значимо большим, чем в группе со «стандартным» лечением на ранних сроках ранозаживления (3-и сутки), а через 7 и 14 сут после создания дефекта кожи их количество было сходным. В целом вариабельность этого показателя значимо зависела от фактора «Группа» (F_{1, 30}=10,91; p=0,0025) и взаимодействия «Группа´Срок» (F_{2, 30}=8,50; p=0,0012), а влияние фактора «Срок» приближалось, но не достигало уровня статистической значимости (F_{2, 30}=3,15; p=0,0574). Число миофибробластов в тканях ран (см. рис. 2, б, з, на цв. вклейке) у крыс двух групп не различалось (F_{1, 30}=0,76; p=0,3895) и увеличивалось со временем (F_{2, 30}=10,88; p=0,0003) со сходной динамикой (F_{2, 30}=0,04; p=0,9576).

Через 3, 7 и 14 сут после операции методом ПЦР в реальном времени в тканях ран оценивали экспрессию генов провоспалительных цитокинов — фактора некроза опухолей альфа (рис. 3, а) и интерлейкина-1β (см. рис. 3, б); основного структурного белка кожи — коллагена I типа (см. рис. 3, в), матриксной металлопротеиназы-1, принимающей участие в перестройках внеклеточного матрикса в ходе заживления ран (см. рис. 3, г), гладкомышечного актина (см. рис. 3, д), эндотелиального (см. рис. 3, е), трансформирующего (см. рис. 3, ж) и тромбоцитарного факторов роста (см. рис. 3, з). Среди исследованных маркеров процесса ранозаживления существенные различия уровня экспрессии между животными, получавшими Коллост гель и «стандартное» медицинское изделие, были обнаружены для интерлейкина-1β (F_{1, 30}=4,20; p=0,0492) и фактора роста эндотелия сосудов (F_{1, 30}=4,80; p=0,0364), экспрессия которых была понижена у крыс опытной группы. Также обращают на себя внимание сниженные уровни экспрессии коллагена I типа, трансформирующего и тромбоцитарного факторов роста, различия в экспрессии которых не достигали уровня статистической значимости (COL1α2: F_{1, 30}=2,19; p=0,1490; TGFβ: F_{1, 30}=2,21; p=0,1476; PDGFα: F_{1, 30}=2,08; p=0,1593). Выраженные изменения уровня экспрессии во времени были обнаружены для генов коллагена I типа (F_{2, 30}=7,64; p=0,0021) и фактора роста эндотелия сосудов (F_{2, 30}=12,47; p=0,0001).

Рис. 3. Исследование тканей ран у животных обеих групп методом ПЦР.

а — экспрессия генов фактора некроза опухолей; б — интерлейкина-1β; в — коллагена первого типа; г — матриксной металлопротеиназы-1; д —гладкомышечного актина; е — фактора роста эндотелия сосудов; ж — трансформирующего фактора роста; з — тромбоцитарного фактора роста в тканях ран крыс, получавших Коллост гель (заштрихованные красные столбики) или «стандартное» медицинское изделие (пустые черные столбики). Число наблюдений — по 6 на каждую временную точку для каждой из групп. Статистика: * — p<0,05 по сравнению с 3-ми сутками после операции в той же группе, тест Сидака.

Fig. 3. Study of animals wound tissues of both groups by PCR method

a — expression of genes tumor necrosis factor; b — interleukin-1β; c — collagen type I; d — matrix metalloproteinase-1; d — smooth muscle actin; e — vascular endothelial growth factor; g — transforming growth factor; z — plateled-derived growth factor in the tissues of the wounds of rats treated with Collost gel (shaded red bars) or a «standard» medical device (empty black bars). The number of observations is 6 for each time point for each group. Statistics: * — p<0.05 compared to 3 days after surgery in the same group, Sidak’s test.

Обсуждение

Обобщая полученные данные, можно отметить, что однократное применение препарата Коллост гель в модели ишемизированных полнослойных ран у крыс, по сравнению со «стандартным» медицинским изделием, существенно стимулирует репарацию дефекта кожи, о чем свидетельствуют ускоренная эпителизация и васкуляризация тканей раны, увеличение числа М2-макрофагов в тканях раны, а также изменения профиля экспрессии генов ряда маркеров процесса репарации кожи. Оценки большинства показателей, полученные в настоящем исследовании с использованием разных методов, в целом хорошо согласуются друг с другом и соответствуют описанным в литературе данным о ходе репарации кожи [29, 32].

При использовании модели ишемизированной полнослойной раны кожи и применении макроскопических, гистологических, иммуногистохимических методов достоверно показано, что механизм действия нативного коллагена I типа связан с ускорением появления в тканях раны «прорегенеторных» М2-макрофагов, снижением выраженности воспаления или сокращением длительности воспалительной стадии репарационного процесса. Полученные в исследовании данные позволяют заключить, что механизмы ранозаживляющего эффекта препарата Коллост гель опосредованы изменением экспрессии генов ключевых для ранозаживления ростовых факторов. Контринтуитивно экспрессия факторов роста в тканях ран крыс, получавших Коллост гель, заживление у которых происходило существенно быстрее, чем у животных контрольной группы, была снижена. Причины такого, на первый взгляд, «негативного» эффекта препарата могут быть различны для разных факторов роста. Так, сниженная, по сравнению с контрольной группой, экспрессия фактора роста эндотелия сосудов не сопровождалась снижением васкуляризации тканей ран. Напротив, васкуляризация грануляционной ткани у получавших Коллост гель крыс на ранних этапах существенно опережала неоваскулогенез в тканях ран крыс контрольной группы, а ее последующее снижение отражает созревание сосудов и деградацию образующегося на ранних этапах репарации избыточного их количества. Это дает основания полагать, что фактический максимум экспрессии VEGF в тканях ран крыс контрольной группы наблюдался до первой временной точки сбора биоматериала в эксперименте.

Важным свидетельством стимуляции процесса репарации кожи при применении Коллост геля является увеличение числа «прорегенеративных» М2-макрофагов на ранних сроках ранозаживления. Одновременно с этим в тканях крыс опытной группы была снижена экспрессия провоспалительного интерлейкина-1β, что может являться как следствием, так и одновременно причиной увеличения числа М2-макрофагов в тканях ран этих животных [35, 36]. Источником М2-макрофагов в тканях раны являются, преимущественно, привлеченные в пораженную ткань моноциты [35]. М2-макрофаги в ткани являются важным источником факторов роста эндотелия сосудов, тромбоцитарного и трансформирующего факторов роста, принимая, тем самым, активное участие в стимуляции пролиферации клеток, образования грануляционной ткани и роста сосудов [37]. По мере развития репарационного процесса и изменения характера внеклеточного матрикса и спектра воздействующих на макрофаги цитокинов происходят существенные изменения их секреторного фенотипа [36, 38], в том числе снижение продукции ростовых факторов и металлопротеаз (см. рис. 3, д). Учитывая очевидное ускорение заживления ран у крыс опытной группы, можно предположить, что сниженная экспрессия ряда ростовых факторов в ранах крыс этой группы отражает его более эффективное протекание и «отсутствие необходимости» в продукции макрофагами и другими клетками больших количеств ростовых факторов.

Применительно к обнаруженным различиям в уровне экспрессии генов факторов роста и других белков, участвующих в репарации ран, следует отметить негативные эффекты их высокого содержания. Так, показана роль TGFβ в переходе от репаративной регенерации к рубцеванию, в образовании гипертрофических и келлоидных рубцов [39, 40], что послужило основой для разработки препятствующих рубцеванию средств, основанных на модуляции сигналлинга TGFβ [41, 42]. Ген коллагена I типа — одна из основных мишеней TGFβ (см. рис. 3, в), непосредственно участвующего в формировании рубца [43]. Повышенные, по сравнению со здоровыми добровольцами, уровни PDGF и VEGF были обнаружены в исследовании у пожилых пациентов с хроническими ранами [44]. Таким образом, «сниженную» экспрессию ряда ростовых факторов и белков в ранах крыс контрольной группы следует рассматривать как «нормализованную», по сравнению с их повышенной продукцией, характерной для хронических, труднозаживающих ран.

Коллаген и другие белки внеклеточного матрикса могут с умеренной аффинностью связывать и, тем самым, защищать от расщепления стимулирующие репарационный процесс ростовые факторы [45]. Экзогенный коллаген при нанесении на рану также способен защищать эндогенные ростовые факторы, в частности тромбоцитарный фактор роста, от расщепления [29]. Еще один механизм действия связан со способностью образующихся при расщеплении коллагена пептидов стимулировать репарационные процессы [46, 47, 48].

Таким образом, применение нативного коллагена I типа позволяет привести хронический процесс к нормальному физиологическому процессу ранозаживления, который является важнейшей комплексной реакцией организма на повреждения. На последней стадии ранозаживления происходит ремоделирование рубца за счет частичного лизиса незрелых неправильно ориентированных и избыточных коллагеновых волокон под действием матриксных металлопротеаз, выделяемых макрофагами, фибробластами и эндотелиальными клетками, и постепенное их замещение более толстыми фибриллами.

Заключение

Эффекты препарата предположительно реализуются за счет создания оптимальной для заживления раны среды, защиты эндогенных регуляторов репарационного процесса, опосредованы фрагментами расщепления коллагена или как сочетание этих механизмов. Применение нативного коллагена I типа позволяет привести хронический процесс к нормальному физиологическому процессу ранозаживления, который является важнейшей комплексной реакцией организма на повреждения.

Полученные в эксперименте данные подтверждаются и результатами проведенного ранее многоцентрового сравнительного исследования при СДС, показывающими, что дополнительное использование биоматериала Коллост у пациентов с СДС приводит через 4 нед лечения к более значимому сокращению размеров трофической язвы, а также увеличению частоты случаев полной эпителизации раны в 2,6 раза. Также было отмечено, что процесс закрытия раны происходит в основном за счет краевой эпителизации, с зон инъекций геля Коллост, где длительно создавалась максимальная концентрация коллагена. Использование биоматериала Коллост способствует уменьшению площади хронических ран, обеспечивая быстрый переход раневого процесса в стадию активной регенерации [22].

Настоящее исследование клинически подтверждает ускорение процессов ранозаживления при использовании биоматериала Коллост и формирование впоследствии более аккуратной рубцовой ткани в сравнении с группами, где Коллост не применялся.

Таким образом, эффекты нативного коллагена I типа — медицинского изделия Коллост — реализуются за счет создания оптимальной для заживления раны среды, ускорения появления в тканях раны «прорегенераторных» М2-макрофагов, снижения выраженности воспаления, изменения профиля экспрессии вовлеченных в процесс ранозаживления факторов.

Авторы выражают благодарность сотрудникам Научно- исследовательского института Митинженерии МГУ: руководителю отдела лабораторных исследований Фроловой Ольге Юрьевне, младшему научному сотруднику Карповой Елене Викторовне, научному сотруднику отдела исследования на животных Поповой Анфисе Сергеевне.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.