Введение

Разработка и совершенствование подходов к успешному восстановлению и регенерации поврежденного миокарда остается актуальной проблемой современной кардиологии, требующей решения. В течение последних десятилетий внимание исследователей привлечено к изучению клеточных и молекулярных механизмов репарации, в которых существенную роль играют мезенхимальные стволовые клетки (МСК). МСК обнаруживаются практически во всех органах и тканях организма, активно участвуя в их формировании, росте и жизнедеятельности [1]. В настоящее время разработаны методы эффективного получения МСК из ряда тканей, что позволяет успешно использовать их в регенеративной медицине. МСК образуются в результате дифференцировки периваскулярных или муральных клеток — перицитов [2] — и могут быть выделены из любой васкуляризированной ткани [3].

В последние годы внимание исследователей, занимающихся проблемой эмбриогенеза сердца и его репарации, привлечено к роли в этих процессах эпикарда — мембраноподобного слоя, покрывающего миокард снаружи и представленного гетерогенной популяцией клеток. В эмбриональный период эпикард играет ключевую роль в развитии сердца, подвергаясь эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП) с образованием гладкомышечных сосудистых клеток, перицитов, фибробластов и ряда других, мигрирующих в миокард и участвующих в формировании сосудистого русла и образовании внеклеточного матрикса. Эта эмбриональная программа активируется во взрослом состоянии при повреждении сердечной ткани, давая начало клеткам, играющим роль в образовании сосудистой ткани, а также паракринно стимулирующим репаративные процессы [4]. Из выделенных эпикардиальных клеток in vitro можно получить мезенхимальные, индуцируя ЭМП с помощью трансформирующего ростового фактора β (TGFb) [5] или при низкой плотности клеточной культуры [6]. Полученные таким образом эпикардиальные мезенхимальные клетки (МК) морфологически напоминают МСК, экспрессируют в большом количестве мезенхимальные маркеры CD44, CD90, CD105 и HLA-ABC и могут дифференцироваться в остеогенном направлении [6]. В ряде исследований было показано, что эпикардиальные МК обладают способностью дифференцироваться и в адипоциты при участии рецептора, активируемого пероксисомным пролифератором-γ (PPAR-γ), рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1-R), прокинетицина-2, предсердного натрийуретического пептида (ANP) и сигнального пути Notch [7—11]. Суммируя вышеизложенные данные, можно предположить, что в результате ЭМП из эпикарда образуются МК, по многим своим характеристикам напоминающие МСК.

Накопленный к настоящему моменту экспериментальный опыт свидетельствует, что МСК, также как и иммунные клетки (лимфоциты и макрофаги) [12, 13] способны менять свой фенотип в условиях про- и противовоспалительного микроокружения [14]. В то же время данные, характеризующие аналогичные процессы в эпикардиальных МК, на текущий момент отсутствуют.

В настоящей работе проведен сравнительный анализ секреторного профиля МК, получаемых из эпикарда и МСК жировой ткани (МСК ЖТ), и выявлены специфические особенности его изменения в ответ на действие IL4, фактора некроза опухолей (TNFα) и патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (ПАМП) — липополисахарид (LPS) и полиинозиновая-полицитидиловая кислота (p(I:C).

Материал и методы

Получение клеток эпикарда

Клетки эпикарда были получены из ушка правого предсердия в ходе операции аорто-коронарного шунтирования, проводимой в Отделе сердечно-сосудистой хирургии ФГБУ «НМИЦ им. акад. Е.И. Чазова» Минздрава России с письменного согласия пациента. Исследование одобрено Этическим комитетом данного учреждения. Выделение клеток эпикарда проводили по описанной методике [6]. Клетки культивировали на культуральном пластике, покрытом желатином (Sigma), в среде М199/DMEM (Thermo Fisher Scientific, Финляндия) с низким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, антибиотиков и 10 мкМ ингибитора SB431542 (Miltenyi Biotec, Германия). Среду меняли каждые двое суток. Эпителиально-мезенхимальный переход клеток эпикарда индуцировали добавлением 10 нг/мл TGFβ (R&D Systems, США) на 3 дня.

МСК ЖТ были получены из коллекции человеческих биоматериалов Института Регенеративной медицины (Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, collection ID:MSU_MSC_AD; repository catalogue at www.human.depo.msu.ru). Клетки культивировали в среде роста ADSC Basal Medium (PT-3273) с добавками ADSC-GM Supplement Kit (PT-4503) (Lonza, Швейцария) до достижения 70—80% конфлюэнтности. Далее клетки пассировали, применяя раствор Версена и 0,05% раствор трипсина. В работе использовались клетки не старше 4 пассажа.

Подготовка кондиционированных сред

Клетки эпикарда предварительно инкубировали в присутствии 10 нг/мл TGFβ для перевода их в мезенхимальное состояние. МСК культивировали до 60—70% конфлюэнтности. Агонисты TLR-рецепторов — бактериальный LPS (10 нг/мл) и p(I:C) (1 мкг/мл) (Sigma-Aldrich-Merck) — добавляли на 1 ч, далее клетки отмывали 3 раза средой культивирования и собирали кондиционированные среды через 48 ч после индукции поляризации. Для изучения возможности влияния цитокинов на профиль секреции использовали IL4 (25 нг/мл) и TNFα (5 нг/мл). Клетки инкубировали в присутствии данных цитокинов в течение 18 ч (overnight), далее их отмывали 3 раза средой культивирования и собирали кондиционированные среды через 24 ч, которые центрифугировали при 400g 5 мин. Полученный супернатант центрифугировали при 2000g 10 мин, замораживали и хранили при 70 °C не более 1 мес.

Мультиплексный иммунноанализ

Для определения концентрации цитокинов использовали набор MILLIPLEX MAP 41 Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (HCYTMAG-60K-PX4141, Merck KGaA, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Предварительно готовили разведения смеси белковых стандартов и по 25 мкл каждого разведения стандарта; контрольные смеси (предоставлены производителем) и кондиционированные среды вносили в 96-луночный планшет в 2 повторах. Далее в лунки добавляли суспензию флуоресцентных магнитных микросфер, покрытых специфическими аналит-связывающими антителами. Планшет запечатывали фольгой и инкубировали в течение 18 ч при температуре +4 °C на орбитальном шейкере. После этого планшет промывали три раза, инкубировали с детектирующим конъюгированным с биотином антителом в течение 1 ч при комнатной температуре, затем промывали и инкубировали со стрептавидин-фикоэритрином еще 30 мин. Количественную оценку проводили с помощью флуоресцентного анализатора MAGPIX (Luminex, США). Полученные данные оценивались с помощью программного обеспечения xPONENT 4.3.229.0. Концентрацию цитокинов (пг/мл) в кондиционированных средах определяли с помощью кривой зависимости средней интенсивности флуоресценции от концентрации стандарта.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее +/– стандартная ошибка среднего. Достоверность между анализируемыми группами данных оценивали с помощью непарного t-критерия Стьюдента (* — p<0,01; ** — p<0,001). Тепловые карты средних концентраций цитокинов, нормированных к соответствующим контролям, получены с помощью программы Heatmapper [15].

Результаты и обсуждение

TGFβ является мощным стимулятором эпидермально-мезенхимального перехода (ЭМП), дающего начало формированию МК в различных типах тканей [16, 17]. В нашей работе мы оценили образование МК из клеток эпикарда в процессе их культивирования в присутствии TGFβ.

Как видно на рис. 1, а, добавка TGFβ к культуре клеток эпикарда способствует потере ими эпителиальной морфологии и приобретению веретеновидной формы, свойственной МК. Помимо индукции морфологических изменений, TGFβ способствует снижению уровня секреции эпидермального фактора роста (EGF), характерного для эпителия [18, 19], и усилению секреции маркеров МК — основного фактора роста фибробластов (FGF2) и сосудисто-эндотелиального фактора роста VEGF (рис. 1, б).

Рис. 1. Результаты исследования.

а — репрезентативные световые фотомикрографии монослоя клеток эпикарда человека (слева), МК, полученных из эпикарда путем обработки TGFβ1 (10 нг/мл, 72 ч) (в центре) и МСК ЖТ (справа) при х100 увеличении. Изображения демонстрируют изменения в морфологии клеток в результате эпителиально-мезенхимального перехода; б — гистограмма зависимости секреции EGF, FGF-2 и VEGF от времени культивирования клеток эпикарда в присутствии 10 нг/мл TGFβ1. Здесь и на рис. 2 концентрации цитокинов в кондиционированных средах оценивались с помощью мультиплексного иммунноанализа (Magpix, Luminex, США). Достоверность отличий исследуемых параметров от исходной временной точки («0»): * — p<0,01; ** — p<0,001; в — репрезентативные результаты сравнительного мультиплексного иммуноанализа (Magpix, Luminex, США) количества продуцируемых цитокинов в супернатантах МК, полученных из эпикарда человека, и МСК, полученных из жировой ткани.

Сравнение секреторных профилей МК, получаемых из эпикарда, и «классических» МСК ЖТ (см. рис. 1, б) показывает, что обе клеточные популяции секретируют широкий спектр факторов, относящихся к факторам роста (EGF, FGF2, VEGF, PDGFAA), стимуляторам дифференцировки воспалительных и гемопоэтических клеток (G-CSF, GM-CSF, Flt-3L, IL-7), факторам клеточного хемотаксиса (eotaxin, fractalkine, GRO/CXCL1, MDC/CCL22, MCP-3, MCP-1, MIP-1A, RANTES), модуляторам иммунного ответа (IFNa), факторам воспаления (IL-6, IL8) и противовоспалительным факторам (IL4, IL13).

Секреция широкого спектра биологически активных факторов является основной характеристикой МСК, определяющей их роль в естественных процессах репарации. Паракринный эффект опосредует большинство эффектов МСК и при их использовании для лечения ряда заболеваний. В то же время мезенхимальные производные эпикарда секретируют ряд факторов, регулирующих клеточную пролиферацию (FGF-2), дифференцировку (G-CSF, GM-CSF), а также хемотаксис воспалительных клеток (MCP-1, MIP-1α, RANTES) в более высоких концентрациях, чем МСК ЖТ, что, вероятно, отражает их функции в поврежденном миокарде.

В большинстве тканей МСК имеют собственную нишу, локализуясь вблизи сосудистой сети, и поэтому вступают в тесный контакт с клетками сосудистого русла, а также с клеточными компонентами сосудистого кровотока. В поврежденной области МСК подвергаются многочисленным воздействиям со стороны окружающих клеточных компонентов, их побочных продуктов и ПАМП. Эти воздействия могут вызывать значительные изменения в физиологии МСК, влияя на спектр секретируемых факторов. Следовательно, МСК вынуждены адаптироваться к среде, изменяющейся в процессе заживления тканей, и эти адаптивные изменения в физиологии клеток, способствующие жизнеспособности МСК, могут активно использоваться в медицинских целях при создании клеточных популяций, наиболее подходящих для применения в конкретных случаях.

На следующем этапе исследования мы провели сравнительный анализ изменений секреторного профиля МК, получаемых из эпикарда и МСК ЖТ в ответ на действие IL4, TNFα, LPS и p(I:C).

Результаты измерения концентраций цитокинов в кондиционированных средах методом мультиплексного иммунного анализа, представленные на рис. 2, а в виде тепловых карт, свидетельствуют о том, что МК, полученные из клеток эпикарда, и МСК ЖТ существенно изменяют свой секреторный профиль в условиях предполагаемого провоспалительного (LPS и TNFα) и противовоспалительного (IL4 и p(I:C)) микроокружения. Эти факторы выбирались на основе группы A. Betancourt и соавт. [14], которые показали, что агонист TLR4 — LPS — и агонист TLR3 —p(I:C) — «поляризуют» МСК по аналогии с макрофагами в про- и противовоспалительный фенотипы. IL4 вошел в исследование, также ориентируясь на его поляризующее действие на макрофаги, а TNFα — основываясь на наших предыдущих наблюдениях [20].

Рис. 2, а. Тепловые карты и гистограммы.

а — тепловые карты средних изменений величин секреции цитокинов и ростовых факторов в условиях стимуляции цитокинами TNFα, интерлейкином-4 или микробными факторами — LPS и p(I:C) — относительно интактного контроля в МК эпикарда и жировой ткани.

Сопоставление наблюдаемых изменений спектра секретируемых факторов в процессе поляризации выявило существенные различия между МК эпикарда и МСК ЖТ (рис. 2, б). Так, EGF секретируется на одинаковом уровне в обоих типах клеток. Секреция этого фактора усиливается в МК эпикарда после поляризации IL4, в МСК ЖТ — под влиянием TNFα и IL4. INFg также секретируется обоими типами клеток на одинаковом уровне. В МСК ЖТ секреция этого цитокина усиливается после инкубации с TNFα.

Рис. 2, б. Тепловые карты и гистограммы.

б — гистограммы, характеризующие влияние поляризующих агентов на секрецию цитокинов низкого, промежуточного и высокого уровня. МСК ЭПИ — МСК эпикарда; МСК ЖТ — МСК жировой ткани. * — p<0,01; ** — p<0,001.

Секреция противовоспалительных цитокинов также имеет свои особенности в обоих типах клеток. IL10 секретируется в высокой степени в МК эпикарда, при этом поляризация IL4 вызывает дополнительное усиление секреции этого цитокина. В МСК ЖТ его содержание близко к следовым количествам. Уровень секреции IL13 существенно выше в МСК ЖТ, чем в МК эпикарда, и не изменяется при поляризации клеток. Уровень секреции IL-1RA выше в МК эпикарда. В обоих типах клеток она усиливается при добавлении TNFα и IL4.

Провоспалительные цитокины, IL1β и IL1α, имеют более высокий уровень секреции в МК эпикарда, усиливающийся в присутствии TNFα и IL4. Секреция FGF2 выше в МК эпикарда, чем в МСК ЖТ.

Уровень секреции эотаксина, фактора привлечения эозинофилов, участвующего в развитии аллергических реакций, примерно одинаков в обоих клеточных типах, однако в МСК ЖТ наблюдается его значительное усиление в присутствии TNFα и драматичное — в присутствии IL4. Эти данные косвенно могут указывать на то, что кондиционированные среды МК эпикарда менее иммунногенны, чем среды МСК ЖТ.

МК эпикарда секретируют большие количества GM-CSF и его экспрессия усиливается при всех видах поляризации, в МСК ЖТ она менее выражена и усиливается только при действии TNFα.

IP10 секретируется на сравнимом уровне в обоих типах клеток, однако в МСК ЖТ его секреция усиливается при добавлении TNFα. Секреция MIP1a более высока в МСК эпикарда, в обоих типах клеток наблюдается ее усиление в присутствии TNFα, и в меньшей степени — в присутствии LPS. Секреция RANTES, исходно более высокая в МСК эпикарда, в обоих клеточных популяциях увеличивается в присутствии TNFα.

Цитокины, имеющие высокий уровень секреции, сохраняют его в различных условиях поляризации. При этом секреция G-CSF, IL6, MCP3 в МСК ЖТ потенцируется TNFα, однако имеет тенденцию к усилению и в присутствии противовоспалительного цитокина IL-4. В МК эпикарда секреция ангиогенного фактора VEGF усиливается на несколько порядков при всех видах воздействия, что, видимо, свидетельствует о драматичном усилении ангиогенного потенциала этих клеток.

Обобщая полученные результаты, следует отметить, что МК эпикарда и жировой ткани имеют ряд различий как в уровне секретируемых цитокинов, так и в характере их регуляции про- и противовоспалительными факторами. Среди выявляемых факторов секреции можно выделить те, секреция которых усиливается TNFα: IL1β, GM-CSF, G-CSF, IP10, MIP1A, RANTES, IL6. К цитокинам, секреция которых потенцируется воспалительным фактором (TNFα) и противовоспалительным цитокином IL4, относятся IL1α, eotaxin, MCP3, и EGF. В то же время секреция ростовых факторов FGF2 и VEGF стимулируется при всех выбранных нами условиях поляризации МСК.

МК эпикарда в целом характеризуются значительно более высоким, чем МСК ЖТ, уровнем секреции цитокинов. С другой стороны, усиление секреции цитокинов клетками жировой ткани под влиянием микроокружения носит более выраженный характер, чем в случае МСК эпикарда. Таким образом, МК эпикарда более активны в секреторном отношении, чем МСК ЖТ, в меньшей степени подвержены воздействию внеклеточного окружения и обладают выраженным ангиогенным потенциалом. Кроме того, подверженность МСК ЖТ воздействию про- и противовоспалительных факторов свидетельствует о высокой адаптивности их паракринной активности в условиях протекания репаративных процессов.

Заключение

Процессы репаративной регенерации сердца, наблюдаемые у низших позвоночных, крайне слабо представлены в сердце млекопитающих. Современная медицина не имеет в своем арсенале средств, позволяющих восстановить утраченные при повреждении клетки сердца. Решить эту проблему можно как с помощью стимуляции эндогенных регенеративных процессов, так и путем замещения утраченных клеток сердца трансплантированными клетками.

Проведенное исследование показало, что МК, образующиеся из эпикарда, обладают высокой секреторной активностью, что, вероятно, может способствовать протеканию репаративных процессов в миокарде. С другой стороны, под влиянием микроокружения МК эпикарда изменяют паракринную активность менее выраженно, чем МСК, и между этими типами клеток нельзя ставить знак равенства. В то же время МК эпикарда могут быть перспективным клеточным типом для использования в регенеративной медицине. Таким образом, полученные данные могут способствовать развитию подходов к клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Исследование выполнено при финансовой поддержке ГЗ НИР (№НИОКТР 121031300093-3) и Российского научного фонда (грант РНФ №19-15-00384-П).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.