Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Майбородин И.В.

НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск

Морозов В.В.

Центр новых медицинских технологий Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия

Новикова Я.В.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск

Матвеева В.А.

Центр новых медицинских технологий Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск

Артемьева Л.В.

Центр новых медицинских технологий Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск

Матвеев А.Л.

Центр новых медицинских технологий Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск

Хоменюк С.В.

Центр новых медицинских технологий Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск

Марчуков С.В.

Центр новых медицинских технологий Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск

Введение мезенхимальных стволовых клеток рядом с тромбированной веной в эксперименте способствует ангиогенезу в грануляциях

Авторы:

Майбородин И.В., Морозов В.В., Новикова Я.В., Матвеева В.А., Артемьева Л.В., Матвеев А.Л., Хоменюк С.В., Марчуков С.В.

Подробнее об авторах

Журнал: Флебология. 2013;7(1): 10‑16

Просмотров: 582

Загрузок: 6

Как цитировать:

Майбородин И.В., Морозов В.В., Новикова Я.В., Матвеева В.А., Артемьева Л.В., Матвеев А.Л., Хоменюк С.В., Марчуков С.В. Введение мезенхимальных стволовых клеток рядом с тромбированной веной в эксперименте способствует ангиогенезу в грануляциях. Флебология. 2013;7(1):10‑16.
Maĭborodin IV, Morozov VV, Novikova IaV, Matveeva VA, Artem'eva LV, Matveev AL, Khomeniuk SV, Marchukov SV. The administration of mesenchymal stem cells close to the thrombosed vein in experiment promotes angiogenesis in granulations. Flebologiya. 2013;7(1):10‑16. (In Russ.).

?>

В настоящее время происходит постоянное увеличение числа больных с тромбозами [1]. Успех репаративных процессов во многом определяется развитием коллатерального кровотока и реканализацией самого тромба. Анализ причин неудачного лечения таких больных свидетельствует о том, что пути их преодоления состоят как в усовершенствовании технологии медикаментозного и хирургического лечения, так и в создании оптимальных условий для восстановления кровотока.

Красный костный мозг содержит прогениторные клетки (мезенхимальные стволовые клетки), способные к дифференцировке в эндотелиоциты и перициты. Это позволяет широко применять такие клетки для ускорения реваскуляризации тканей с нарушенной микроциркуляцией [2-7]. Реваскуляризация тромба, быстрая реканализация вены и восстановление кровообращения в ишемизированных в результате тромбоза тканях были достигнуты в экспериментальных моделях с проангиогенными агентами [3, 7-11].

В литературе имеется множество данных об эффективности использования клеточных технологий для стимуляции ангиогенеза. Однако применение мезенхимальных стволовых клеток как самостоятельно, так и в комбинации с другими препаратами и веществами имеет свои недостатки и преимущества и должно осуществляться только с учетом всех возможных показаний и противопоказаний.

Цель исследования - изучить возможность паравазального применения аутологичных мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток костномозгового происхождения (АМСККП) для восстановления кровотока в тромбированной вене в эксперименте.

Материал и методы

В качестве модели были использованы самцы крыс линии Wag массой 180-200 г в возрасте 6 мес. Все исследования проводили с соблюдением Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных, все манипуляции осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом.

АМСККП второго пассажа, полученные от крысы указанной линии, трансфицировали ДНК плазмиды pЕGFP-N1 («Clontech Laboratories Inc.», США), содержащей ген зеленого флюоресцентного белка GFP под контролем промотора цитомегаловируса и ген устойчивости к неомицину под контролем промотора вируса SV40, необходимого для последующей селекции с использованием дженетицина G418 (pEGFP-N1; «Clontech Laboratories Inc.», США). Трансфекцию проводили в присутствии реагента для трансфекции TurboFect («Fermentas life sciences, Inc.», Канада) согласно рекомендациям производителя, применяли протокол для трансфекции суспезионных клеток. Трансфекцию проводили используя 1×106 клеток в 1 мл суспензии, 4 мкг ДНК плазмиды и 10 мкл реагента для трансфекции (TurboFect).

Через 4 ч после трансфекции клетки разводили нетрансфицированными клетками в соотношении 1:2,5 и использовали для введения экспериментальным животным. Оставшиеся после трансплантации клетки поддерживали в культуре в течение 1 мес для оценки эффективности трансфекции и стабильности экспрессии введенного гена.

Экспрессию введенного гена GFP АМСККП крысы оценивали визуально под флюоресцентным микроскопом, непосредственно просматривая культуру или используя камеру Горяева для подсчета трансфицированных клеток через 48 ч после трансфекции. Эффективность трансфекции оценивали как процент светящихся клеток относительно всех клеток в камере Горяева. Процент трансфицированных клеток в разбавленной культуре составлял около 3.

Как и в большинстве случаев при использовании технологии, основанной на введении плазмидной ДНК, наблюдали только временную экспрессию введенного гена зеленого флюоресцентного белка в АМСККП крысы. Культивирование клеток, трансфицированных плазмидой pЕGFP-N1 без селекции (не использовали дженетицин (G418, «Sigma», США), показало снижение количества клеток, синтезирующих зеленый флюоресцентный белок, вследствие их вытеснения нетрансфицированными клетками. Но даже спустя 1 нед в культуре трансфицированных клеток первого пассажа, высеянных из плотности 5000 клеток на 1 см2, наблюдали клетки, синтезирующие зеленый флюоресцентный белок.

Кроме того, часть АМСККП с геном GFP, согласно инструкции производителя («Sigma», США), инкубировали c красителем ядер клеток DAPI в концентрации

1 мг/мл среды α-МЕМ с 10% эмбриональной сывороткой теленка, антибиотиком/антимикотиком («Gibco», США) в СО2-инкубаторе в атмосфере насыщенной влажности. Через 10 мин среду сливали, клетки промывали физиологическим раствором в модификации Дальбекко («БиолоТ», Россия) и заливали культуральной средой.

В доступной литературе содержится множество экспериментальных моделей венозного тромбоза. Однако самым простым, самым воспроизводимым и наименее травматичным является метод S. Wessler и соавт. [12]: сочетание венозного застоя (например, лигирование вены) и гиперкоагуляции за счет введения активированного фактора свертывания (например, тромбина).

В асептических условиях скальпелем производили разрез кожи длиной до 3 см по внутренней стороне бедра от паховой складки. Тупым способом выделяли сосудистый пучок и накладывали лигатуру на v. femoralis, как можно ближе к месту впадения в v. circumflexa ilium profunda. В нижнюю треть v. femoralis вводили раствор тромбина (0,5 Ед/мл) до заполнения всего участка от места инъекции до места лигирования (0,03-0,05 мл). Место инъекции пережимали на 3 мин (до формирования тромба) для исключения ретроградного распространения и элиминации введенного препарата через инъекционное отверстие. Через 1 сут осуществляли повторный доступ к тромбированной вене и после удаления лигатуры по 50 мкл суспензии АМСККП в культуральной среде (1×106 клеток в 1 мл) вводили в ткани справа и слева (не далее 5 мм) от вены с тромбозом. Животных выводили из эксперимента передозировкой эфирного наркоза через 4 сут, 1, 2, 3, 4 и 5 нед после введения АМСККП. В каждой группе было 11-12 животных. В качестве контроля использовали интактных крыс, животных с венозным тромбозом без использования АМСККП и с паравазальным применением АМСККП без предварительного моделирования венозного тромбоза. Половине животных последней группы на даты 4 сут и 2 нед вводили АМСККП с геном GFP и ядрами, окрашенными DAPI.

V. femoralis с окружающими тканями фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч, обезвоживали в градиенте этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Неокрашенные срезы толщиной 5-7 мкм изучали на световом микроскопе Axioimager M1 при увеличении до 1500 раз в режиме люминесценции с фильтрами Alexa 488 или DAPI.

Результаты исследования

При исследовании методом люминесцентной микроскопии у интактных животных и при тромбозе без последующего введения АМСККП на все точки наблюдения специфическое свечение отсутствовало в стенке магистральных сосудов и в паравазальной клетчатке (рис. 1, а),

Рисунок 1. Участие АМСККП в ангиогенезе после их введения в ткани рядом с нетромбированной и тромбированной веной. Неокрашенные срезы в отраженном ультрафиолетовом свете с фильтром Alexa 488. а - cпецифическое свечение отсутствует в стенке магистральных сосудов и сосудов паравазальной клетчатки интактного животного; б - через 4 сут после введения АМСККП рядом с тромбированной веной в стенке сосуда четко видно специфическое свечение в клеточной цитоплазме и темное ядро (стрелка); в - в грануляциях и формирующемся рубце на месте операции спустя 1 нед после введения АМСККП рядом с нормальной веной присутствует множество мелких сосудов со специфически светящимися стенками и отдельными клетками в них. В ряде случаев видны более темные ядра светящихся клеток (стрелки); г - на 1-й неделе после введения АМСККП рядом с тромбированной веной в ней содержатся фрагменты пристеночного тромба. Светящихся объектов в тромбе и стенке вены нет; д - на месте операции к исходу 1-й недели после введения АМСККП рядом с тромбированной веной
в тканях вдали от сосудистого пучка и в сосудах, проходящих в массиве мышц бедра.

Через 4 сут в качестве контроля возле нормальной вены были введены АМСККП не только меченные GFP, но и с параллельной меткой клеточных ядер DAPI.

Обнаружено, что в паравазальной клетчатке присутствовали единичные специфически светящиеся клетки. В некоторых случаях эти клетки были выстроены в короткие цепочки. Несколько реже были найдены небольшие группы мелких сосудов (грануляции), стенки которых полностью состояли из светящихся клеток (рис. 2, ряд 1).

Рисунок 2. Ангиогенез в послеоперационных грануляциях после введения АМСККП, меченных GFP и ядерным красителем DAPI, рядом с нетромбированной веной. а - неокрашенный срез в отраженном УФ-свете с фильтром Alexa 488; б - неокрашенный срез в отраженном УФ-свете с фильтром DAPI; в - результат компьютерного совмещения рис. 2, а с рис. 2, б. Ряд 1 - через 4 сут после введения АМСККП в месте хирургического вмешательства присутствуют небольшие группы мелких сосудов, стенки которых состоят из светящихся клеток. Иногда на фоне светящейся зеленым цветом клеточной цитоплазмы видно более темное ядро, окрашенное при использовании фильтра DAPI в синий цвет (стрелки). Ряд 2 - спустя 2 нед после инъекций АМСККП в грануляциях на месте операции расположены группы мелких сосудов, в их стенке содержатся единичные светящиеся зеленым цветом клетки, в которых прослеживаются более темные ядра, окрашенные синим цветом при применении фильтра DAPI (стрелки).
Использование двойной метки введенных АМСККП позволило доказать их участие в ангиогенезе: при использовании фильтра Alexa 488 в клетках ярким зеленым цветом светилась цитоплазма и оставалось темным ядро, при применении фильтра DAPI ядро светилось синим цветом, что было хорошо видно после совмещения результатов исследования с разными фильтрами для УФ-света (см. рис. 2, ряд 1).

Через 4 сут после моделирования тромбоза и введения АМСККП в ткани вокруг сосуда, непосредственно в самой вене сохранялись только остатки тромба, большая часть просвета такого сосуда была свободна. Фрагменты тромба на большом протяжении располагались на стенке сосуда (пристеночный тромбоз), были уже фрагментированы на более мелкие остатки и инфильтрированы крупными клетками, скорее всего, макрофагами.

В тканях вокруг сосуда, в грануляциях на месте хирургического вмешательства было обнаружено множество отдельно расположенных клеток со специфическим свечением в цитоплазме (см. рис. 1, б). Иногда в тканях на месте операции были обнаружены группы мелких сосудов капиллярного типа (грануляции), в стенке которых присутствовали светящиеся клетки (см. рис. 1, б). В некоторых случаях можно было четко проследить специфическое свечение в цитоплазме и более темное ядро (см. рис. 1, б).

В 1-ю неделю после инъекции АМСККП рядом с нормальной веной в паравазальной клетчатке и остатках послеоперационных грануляций присутствовали единичные сосуды со специфически светящимися клетками (см. рис. 1, в). В некоторых случаях были найдены группы светящихся мелких сосудов капиллярного типа. Иногда удается проследить более темные ядра светящихся клеток (см. рис. 1, в).

После формирования тромбоза и введения АМСККП в ткани вокруг сосуда тромб был почти полностью лизирован и от него оставались только мелкие пристеночные фрагменты. Ни у одного животного светящихся объектов в стенке тромбированной вены не найдено (см. рис. 1, г).

В тканях на месте операции были отмечены мелкие сосуды, стенка которых содержала светящиеся клетки. Такие сосуды были крупнее, и их стенка была толще, чем в предыдущее время (см. рис. 1, д). В некоторых случаях можно было четко проследить яркое специфическое свечение в цитоплазме и темное ядро (см. рис. 1, д).

Через 2 нед после введения АМСККП, параллельно меченных GFP и ядерным красителем DAPI, возле интактной вены в большинстве наблюдений в паравазальной клетчатке и в послеоперационном рубце присутствовали единичные специфически светящиеся клетки. Также были найдены небольшие группы мелких сосудов, в стенке которых были обнаружены светящиеся объекты. При использовании фильтра Alexa 488 в таких клетках ярко светилась зеленым цветом цитоплазма и оставалось темным ядро, а при применении фильтра DAPI было отмечено специфическое синее свечение ядра (см. рис. 2, ряд 2).

Через 2 нед после введения АМСККП рядом с тромбированной веной проходимость всех сосудов была практически восстановлена. Ни у одного животного светящихся объектов в стенке вены с тромбозом не обнаружено.

Количество сосудов со светящимися клетками в клетчатке возле сосудистого пучка уменьшилось, практически исчезли структуры, похожие на грануляции. Очень редко в клетчатке обнаруживали группы сосудов с клетками, которые имели специфическое свечение в цитоплазме (см. рис. 1, е).

В предыдущие этапы не было отмечено, но в этот период появилось специфическое свечение стенки отдельных сосудов венозного типа, расположенных в массиве мышечной ткани бедра. Практически всегда сосуды со специфическим свечением имели широкий просвет, в котором в ряде случаев находились остатки тромба с макрофагами. Иногда такие сосуды с тромбом имели характерный для процесса реканализации вид. Стенка сосуда была утолщена, в ней можно отметить крупные клетки с темным ядром и светящейся цитоплазмой (см. рис. 1, ж). Просвет сосуда выполнен гетерогенными массами с большими отверстиями и перетяжками между ними, скорее всего, остатками частично лизированного тромба (см. рис. 1, ж).

Через 3, 4 и 5 нед после введения АМСККП около нормального сосуда в стенке вены, в паравазальной клетчатке и в месте хирургического вмешательства не было найдено специфически светящихся объектов.

После операции по моделированию венозного тромбоза и введения АМСККП рядом с пораженной веной, как и в более ранние периоды, ни у одного животного светящихся объектов в стенке вены с тромбозом не найдено, также не было обнаружено фрагментов тромба в ее просвете.

Основное место как в паравазальной клетчатке, так и в рубцовой ткани на месте хирургического вмешательства и грануляций занимали сосуды без специфического свечения в своих структурах. Значительно реже и через 3 нед были найдены группы сосудов со специфическим свечением в стенке, но эти группы были небольшими (см. рис. 1, з). В таких сосудах можно было проследить на фоне ярко светящейся клеточной цитоплазмы темное ядро (см. рис. 1, з).

Обсуждение

Несмотря на многочисленные данные литературы [2-7] о положительных результатах применения клеточных технологий в лечении тромбозов, согласно нашим результатам, восстановление кровотока в магистральной вене с тромбозом в эксперименте на крысах всегда идет за счет тромболизиса, приводящего уже к 4-м суткам к рассасыванию большей, значительной части тромба в магистральной вене. Признаки встраивания АМСККП в стенку тромбированного сосуда не найдены ни в одном случае на всех сроках наблюдения. Признаки реканализации тромба и формирования коллатералей также не обнаружены.

При паравазальном введении АМСККП без предварительного моделирования тромбоза в месте хирургического вмешательства было отмечено появление групп мелких сосудов, построенных из клеток с ярко светящейся зеленым цветом цитоплазмой при использовании фильтра Alexa 488 и светящимся синим цветом ядром при применении фильтра DAPI.

Уже к 4-м суткам в грануляциях, развивающихся на месте хирургической травмы, содержатся сосуды, сформированные из введенных АМСККП. Рост сосудов происходит как в результате прорастания уже имеющихся в регионе сосудов, так и за счет неоангиогенеза с привлечением клеток-предшественников из костного мозга [13-15]. При введении АМСККП они сразу начинают встраиваться в растущие сосуды и формировать новые в результате дифференцировки в эндотелиоциты и перициты [16-18].

Начиная со срока 1 нед после инъекции АМСККП рядом с нормальной веной количество светящихся клеток и сосудов, построенных из них в месте хирургического вмешательства, постепенно уменьшается, а с 3-й недели светящихся объектов практически нет. Это наиболее вероятно связано с заживлением раны и инволюцией грануляций.

После введения АМСККП на фоне сосудистого тромбоза в данный период в послеоперационных грануляциях отмечалось множество отдельно расположенных клеток со специфическим свечением в цитоплазме или группа мелких сосудов капиллярного типа, стенки которых состояли из клеток со светящейся цитоплазмой и более темным ядром. Количество сосудов со светящимися объектами в стенке постепенно нарастало, стенки их становились толще.

Доказательством того, что данные группы сосудов были сформированы именно в результате введения АМСККП и из них, является свечение клеточной цитоплазмы. Ген GFP, введенный в ДНК АМСККП, неизменным передается дочерним клеткам и клеткам следующих поколений. Эти клетки и структуры, сформированные из них, точно так же светятся в отраженном УФ-свете.

Таким образом, экономится время на миграцию собственных плюрипотентных клеток к месту операции и ускоряются процессы развития грануляций.

Со срока 2 нед количество сосудов со светящимися клетками в клетчатке возле сосудистого пучка начинает уменьшаться, постепенно исчезают структуры, похожие на грануляции. В основном там присутствовали сосуды без светящихся объектов в стенке, и только в отдельных случаях в сосудистой стенке среди обычных клеток были найдены клетки со свечением.

В то время как в более ранние сроки эксперимента не было отмечено, в этот период появилось специфическое свечение стенки сосудов венозного типа, расположенных в массиве мышечной ткани бедра. Практически всегда сосуды со специфическим свечением имели широкий просвет. Иногда в мышечной ткани бедра обнаруживали сосуды с широким просветом, в котором находились остатки тромба с макрофагами.

Особенности формирования тромбоза мелких сосудов, проходящих в мышечной ткани бедра после введения тромбина, скорее всего, точно такие же, как и особенности развития тромбоза в сосудах крупного калибра. После введения тромбина тромб развивается не только в зоне введения, но и распространяется ретроградно (вследствие перевязки магистрали и нарушения оттока) на его ветви, осуществляющие сбор крови от тканей. В результате этого происходит тромбоз не только магистральной вены, но и ее более мелких ветвей.

Далее в магистральной вене тромб лизируется, а в мелких сосудах фибрин организуется и постепенно поглощается макрофагами, которые даже могут образовывать гигантские клетки инородных тел [19, 20], что часто приводит к облитерации просвета такого сосуда. Затем (или рядом) развиваются новые сосуды или питание мышечной ткани осуществляется за счет уже имеющихся коллатералей. Яркое свечение эндотелия в сосуде в момент его реканализации может свидетельствовать о восстановлении структур сосудистой стенки и роста эндотелия по каналам в тромбе с участием АМСККП.

К 3-й неделе завершается репарация тканей и полностью формируется рубец на месте операции. Число сосудов, в стенке которых имеются светящиеся объекты, начинает уменьшаться. Также уменьшается интенсивность свечения клеток в сосудистой стенке. В основном, в тканях возле сосудов присутствовали только единичные сосуды со светящимися клетками в различных слоях стенки.

Постепенное исчезновение свечения в стенке сосудов не всегда есть признак того, что появились новые сосуды, построенные с участием собственных стволовых клеток, а сосуды, сформированные с привлечением введенных АМСККП, исчезли. По-видимому, сначала сосуды в паравазальной клетчатке и грануляциях образуются с участием привнесенных извне АМСККП. Постепенно, с исчезновением грануляций, на таких участках исчезают и сосуды, сформированные из клеток с белком GFP. В клетчатке рядом с сосудистым пучком сначала сосуды также образуются с привлечением светящихся клеток, однако затем, пусть и аутологичные, но все-таки взятые у другой особи АМСККП (и клетки, в которые дифференцировались введенные АМСККП), которые, кроме всего прочего, имеют чужеродный ген GFP, постепенно замещаются собственными клетками.

Заключение

Таким образом, на основании вышеизложенного можно заключить, что в результате применения АМСККП раньше и более быстро развиваются грануляции в месте хирургического вмешательства, выполненного при моделировании тромбоза, что может способствовать более быстрому очищению раны от детрита, нежизнеспособных тканей и антигенных веществ, раннему развитию репарационных процессов и быстрому заживлению тканей в месте хирургического вмешательства. Кроме того, АМСККП участвуют в восстановлении кровотока в ветвях тромбированной вены: происходит реканализация тромба или прорастание новых сосудов взамен облитерированных. Постепенно введенные АМСККП и структуры, сформированные с их участием, вытесняются собственными клетками организма-реципиента.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Исследование генных и клеточных подходов в терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы или опорно-двигательного аппарата» (ГК16.512.11.2099 «Исследование возможности использования генных и клеточных подходов в диагностике, профилактике и лечении тромбоэмболических осложнений сердечно-сосудистых заболеваний для снижения уровня смертности и ранней инвалидизации трудоспособного населения РФ»).

Конфликт интересов: авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования - И.М., В.М., Я.Н., В.М.

Сбор и обработка материала - И.М., В.М., Я.Н, В.М., Л.А., А.М., С.Х., С.М.

Написание текста - И.М., В.М., Я.Н., В.М.

Редактирование - И.М., В.М., Я.Н.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail