Применение методики атомно-силовой микроскопии для сравнения острого панкреатита средней тяжести и тяжелого течения в ранние сроки заболевания

Острый панкреатит, одно из наиболее распространенных неотложных хирургических заболеваний брюшной полости, продолжает оставаться в центре внимания как хирургов, так и исследователей в России и за рубежом [1, 2]. Несмотря на то что в глобальном аспекте вопросы диагностики и тактики лечения острого панкреатита в целом урегулированы, определение степени тяжести этого заболевания на ранних этапах [3, 4], своевременная коррекция терапии и определение показаний к хирургическому вмешательству [5, 6] остаются актуальными и вызывают широкий резонанс в профессиональном сообществе.

К сожалению, ни лабораторные показатели крови и мочи, ни данные ультразвукового и компьютерного томографического исследования поджелудочной железы не позволяют достоверно оценить степень ее повреждения [7, 8]. Панкреатит средней степени тяжести можно дифференцировать от легкой формы, однако надежно отличить его от тяжелого панкреатита в течение первых 48 ч невозможно [9, 10]. Объективную информацию о тяжести течения заболевания может дать только гистологическое исследование, однако проведение биопсии поджелудочной железы у пациентов с выраженной клинической симптоматикой зачастую невозможно и не всегда оправданно.

В связи с этим продолжается активный поиск альтернативных надежных методов диагностики, позволяющих определить степень тяжести острого панкреатита без инвазивного вмешательства.

Одним из перспективных методов оценки тяжести острого панкреатита является атомно-силовая микроскопия (АСМ) эритроцитов периферической крови [11]. В последние годы АСМ все чаще применяется для диагностики в реаниматологии и кардиологии, в том числе при патологии органов брюшной полости, таких как гепатит, холецистит и панкреатит. Выявляемые с ее помощью изменения мембран эритроцитов и лимфоцитов рассматриваются как возможные предикторы патологического процесса [12].

Кроме того, степень изменения мембран эритроцитов позволяет судить о выраженности системного воспалительного ответа, а также о наличии и тяжести гнойно-септических осложнений [13, 14]. Важным преимуществом данного метода является его способность выявлять тяжелое течение заболевания даже при отсутствии выраженной клинической симптоматики, изменений лабораторных показателей и признаков патологии при компьютерной томографии брюшной полости.

Доказано, что изменения мембран эритроцитов отражают общие патологические процессы, происходящие также в мембранах других клеток организма. Это позволяет с высокой степенью вероятности экстраполировать выявленные в эритроцитах структурные нарушения на клетки поджелудочной железы и прогнозировать утяжеление течения заболевания, вплоть до развития панкреонекроза.

Несомненным преимуществом метода является доступность биологического материала — эритроцитов периферической крови. К относительным недостаткам следует отнести ограниченное наличие атомно-силовых микроскопов в стационарах. Тем не менее следует отметить, что еще 10 лет назад и компьютерная томография не была повсеместным и рутинным методом диагностики, что свидетельствует о высоком потенциале внедрения АСМ в клиническую практику.

Увеличение количества публикаций в тематической литературе по вопросам атомно-силовой микроскопии свидетельствует о возрастающем интересе к обозначенной теме.

Цель исследования — сравнить состояние эритроцитов и эритроцитарной мембраны при панкреатите средней степени тяжести и тяжелой степени тяжести в ранние сроки острого панкреатита.

Проведено мультицентровое проспективное исследование, в которое вошли 15 практически здоровых людей и 61 пациент с острым панкреатитом, находившихся на лечении в стационарах г. Красноярска в 2021—2023 гг. У 29 пациентов отмечен клинически подтвержденный острый панкреатит средней степени тяжести, у 32 — острый панкреатит тяжелой степени.

У всех пациентов длительность заболевания на момент поступления в стационар не превышала 48 ч. У пациентов (16 человек) с длительностью заболевания 24 ч и менее диагностирован так называемый молниеносный панкреатит.

Все пациенты были комплексно обследованы в соответствии со стандартами оказания медицинской помощи. Помимо рутинных методов всем проводилась атомно-электронная микроскопия эритроцитов крови, забранной из кубитальной вены при поступлении. Атомно-электронный анализ состояния эритроцитов проведен также у 15 практически здоровых людей. Исследование проводилось с помощью атомно-силового микроскопа Integra Aura (ООО «НТ-МТД», Россия) в полуконтактном режиме для изучения состояния поверхностной мембраны. В контактном режиме оценивались силы адгезии.

Проведена статистическая обработка полученных результатов АСМ эритроцитов с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0 («StatSoft Inc.», США) с использованием критерия Шапиро—Уилка. Статистическую значимость различий оценивали по критериям Шеффе, Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни, используя поправку Бонферрони.

После поступления проведена оценка тяжести состояния пациентов по трем шкалам (Ranson, SOFA, APACHE II) (табл. 1).

Таблица 1. Оценка тяжести состояния пациентов в течение первых 48 ч после начала заболевания

Как видно из табл. 1, среднее количество баллов распределилось по всем трем шкалам — с преобладанием у пациентов с тяжелой степенью острого панкреатита.

Проведен сравнительный анализ лабораторных показателей пациентов с острым панкреатитом средней и тяжелой степени течения, полученных в течение первых 24 ч после поступления (табл. 2).

Таблица 2. Основные лабораторные показатели у пациентов исследуемой группы

Примечание. АлАТ — аланинаминотрансфераза; АсАТ — аспартатаминотрансфераза; СОЭ — скорость оседания эритроцитов.

По результатам анализа необходимо отметить отсутствие выраженных, статистически значимых изменений, которые можно было бы использовать для верификации степени тяжести заболевания.

Первыми шагами при проведении атомно-силовой микроскопии была сравнительная оценка линейных размеров эритроцитов. Учитывая двояковогнутую форму эритроцита, помимо длины и ширины измеряли максимальную и минимальную высоту и глубину впадины исследуемых клеток (табл. 3).

Таблица 3. Сравнение линейных параметров эритроцитов

При анализе полученных данных отчетливо прослеживаются статистически значимое уменьшение длины и возрастание ширины эритроцита по мере увеличения тяжести процесса. Отмечается уменьшение высоты эритроцита и глубины эритроцитарной впадины, что свидетельствует о тенденции к превращению эритроцита в сфероцит. В последующем проведено определение площади и объема эритроцитов, а также визуализация состояния поверхностной мембраны клетки (табл. 4).

Таблица 4. Сравнение площади, объема и поверхности эритроцитов

Выявлены статистически значимые уменьшение площади и увеличение объема эритроцита. Потеря эритроцитом двояковогнутой формы приводит к уменьшению газообмена клеткой и, как следствие, к гипоксии тканей, что, в свою очередь, усугубляет тяжесть состояния и вызывает апоптоз клеток тканей организма, в том числе поджелудочной железы.

При сравнительном сканировании мембран эритроцитов можно отчетливо проследить ее негативные изменения по сравнению с мембраной здоровых людей и в зависимости от тяжести процесса (рисунок).

Сравнение сканов поверхности эритроцитов, полученных с помощью атомно-силовой микроскопии.

ОПССТ — острый панкреатит средней степени тяжести; ОПТСТ— острый панкреатит тяжелой степени тяжести.

При изучении состояния клеточной мембраны эритроцитов отмечается появление эрозий на их поверхности. При этом как количество язвенных изменений, так и их размеры зависят от степени тяжести состояния. При утяжелении состояния количество эрозий увеличилось практически в 2 раза при увеличении их длины, ширины и глубины. Чем больше указанных изменений, тем больше вероятность возникновения распада, то есть гибели клетки.

Как уже отмечено выше, аналогичные процессы происходят и в клетках поджелудочной железы. Соответственно, выраженные изменения эритроцитарной мембраны свидетельствуют о возможности развития панкреонекроза и присоединения гнойно-септических осложнений в поджелудочной железе и в организме в целом. Получение свидетельства о разрушении эритроцитарной мембраны способствует своевременной коррекции тактики проводимого лечения.

Несмотря на наличие большого количества клинических протоколов диагностики и лечения острого панкреатита, вопрос достоверного определения степени тяжести заболевания на ранних этапах остается нерешенным. В течение первых часов от начала клинических проявлений сложно объективно оценить тяжесть течения процесса.

В литературе мы не обнаружили описания аналогичных исследований с применением атомно-силовой микроскопии в данном контексте.

В связи с идентичностью структурных изменений мембран эритроцитов и клеток других органов, включая поджелудочную железу, атомно-силовая микроскопия представляется перспективным методом для диагностики степени тяжести и прогнозирования прогрессирования патологического процесса на ранних этапах заболевания.

Таким образом, атомно-силовая микроскопия эритроцитов периферической крови может быть рекомендована в качестве дополнительного дифференциально-диагностического теста при оценке тяжести течения острого панкреатита.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Гуликян Г.Н., Пахомова Р.А.

Сбор и обработка материала — Гуликян Г.Н.

Статистическая обработка данных — Козлов В.В.

Написание текста — Гуликян Г.Н.

Редактирование — Пахомова Р.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Author contributions:

Study design and concept — Gulikyan G.N., Pakhomova R.A.

Data collection and processing — Gulikyan G.N.

Statistical analysis — Kozlov V.V.

Text writing — Gulikyan G.N.

Editing — Pakhomova R.A.