Введение
Острый панкреатит, одно из наиболее распространенных неотложных хирургических заболеваний брюшной полости, продолжает оставаться в центре внимания как хирургов, так и исследователей в России и за рубежом [1, 2]. Несмотря на то что в глобальном аспекте вопросы диагностики и тактики лечения острого панкреатита в целом урегулированы, определение степени тяжести этого заболевания на ранних этапах [3, 4], своевременная коррекция терапии и определение показаний к хирургическому вмешательству [5, 6] остаются актуальными и вызывают широкий резонанс в профессиональном сообществе.
К сожалению, ни лабораторные показатели крови и мочи, ни данные ультразвукового и компьютерного томографического исследования поджелудочной железы не позволяют достоверно оценить степень ее повреждения [7, 8]. Панкреатит средней степени тяжести можно дифференцировать от легкой формы, однако надежно отличить его от тяжелого панкреатита в течение первых 48 ч невозможно [9, 10]. Объективную информацию о тяжести течения заболевания может дать только гистологическое исследование, однако проведение биопсии поджелудочной железы у пациентов с выраженной клинической симптоматикой зачастую невозможно и не всегда оправданно.
В связи с этим продолжается активный поиск альтернативных надежных методов диагностики, позволяющих определить степень тяжести острого панкреатита без инвазивного вмешательства.
Одним из перспективных методов оценки тяжести острого панкреатита является атомно-силовая микроскопия (АСМ) эритроцитов периферической крови [11]. В последние годы АСМ все чаще применяется для диагностики в реаниматологии и кардиологии, в том числе при патологии органов брюшной полости, таких как гепатит, холецистит и панкреатит. Выявляемые с ее помощью изменения мембран эритроцитов и лимфоцитов рассматриваются как возможные предикторы патологического процесса [12].
Кроме того, степень изменения мембран эритроцитов позволяет судить о выраженности системного воспалительного ответа, а также о наличии и тяжести гнойно-септических осложнений [13, 14]. Важным преимуществом данного метода является его способность выявлять тяжелое течение заболевания даже при отсутствии выраженной клинической симптоматики, изменений лабораторных показателей и признаков патологии при компьютерной томографии брюшной полости.
Доказано, что изменения мембран эритроцитов отражают общие патологические процессы, происходящие также в мембранах других клеток организма. Это позволяет с высокой степенью вероятности экстраполировать выявленные в эритроцитах структурные нарушения на клетки поджелудочной железы и прогнозировать утяжеление течения заболевания, вплоть до развития панкреонекроза.
Несомненным преимуществом метода является доступность биологического материала — эритроцитов периферической крови. К относительным недостаткам следует отнести ограниченное наличие атомно-силовых микроскопов в стационарах. Тем не менее следует отметить, что еще 10 лет назад и компьютерная томография не была повсеместным и рутинным методом диагностики, что свидетельствует о высоком потенциале внедрения АСМ в клиническую практику.
Увеличение количества публикаций в тематической литературе по вопросам атомно-силовой микроскопии свидетельствует о возрастающем интересе к обозначенной теме.
Цель исследования — сравнить состояние эритроцитов и эритроцитарной мембраны при панкреатите средней степени тяжести и тяжелой степени тяжести в ранние сроки острого панкреатита.
Материал и методы
Проведено мультицентровое проспективное исследование, в которое вошли 15 практически здоровых людей и 61 пациент с острым панкреатитом, находившихся на лечении в стационарах г. Красноярска в 2021—2023 гг. У 29 пациентов отмечен клинически подтвержденный острый панкреатит средней степени тяжести, у 32 — острый панкреатит тяжелой степени.
У всех пациентов длительность заболевания на момент поступления в стационар не превышала 48 ч. У пациентов (16 человек) с длительностью заболевания 24 ч и менее диагностирован так называемый молниеносный панкреатит.
Все пациенты были комплексно обследованы в соответствии со стандартами оказания медицинской помощи. Помимо рутинных методов всем проводилась атомно-электронная микроскопия эритроцитов крови, забранной из кубитальной вены при поступлении. Атомно-электронный анализ состояния эритроцитов проведен также у 15 практически здоровых людей. Исследование проводилось с помощью атомно-силового микроскопа Integra Aura (ООО «НТ-МТД», Россия) в полуконтактном режиме для изучения состояния поверхностной мембраны. В контактном режиме оценивались силы адгезии.
Проведена статистическая обработка полученных результатов АСМ эритроцитов с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0 («StatSoft Inc.», США) с использованием критерия Шапиро—Уилка. Статистическую значимость различий оценивали по критериям Шеффе, Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни, используя поправку Бонферрони.
Результаты и обсуждение
После поступления проведена оценка тяжести состояния пациентов по трем шкалам (Ranson, SOFA, APACHE II) (табл. 1).
Таблица 1. Оценка тяжести состояния пациентов в течение первых 48 ч после начала заболевания
| Тяжесть течения острого панкреатита | Оценка тяжести состояния по шкалам, баллы | ||
| Ranson | SOFA | APACHE II | |
| Средняя (n=29) | 6,7±1,8 | 9,8±1,7 | 12,9±1,9 |
| Тяжелая (n=32) | 8,6±2,9 | 9,6±3,9 | 13,8±1,6 |
Как видно из табл. 1, среднее количество баллов распределилось по всем трем шкалам — с преобладанием у пациентов с тяжелой степенью острого панкреатита.
Проведен сравнительный анализ лабораторных показателей пациентов с острым панкреатитом средней и тяжелой степени течения, полученных в течение первых 24 ч после поступления (табл. 2).
Таблица 2. Основные лабораторные показатели у пациентов исследуемой группы
| Показатель | Степень тяжести острого панкреатита | |
| средняя (n=29) | тяжелая (n=32) | |
| Общий белок, г/л | 67,6±1,9 | 71,8±3,9 |
| Общий билирубин, мкмоль/л | 34,8±13,1 | 39,1±12,7 |
| АлАТ, Ед/л | 83,6±10,9 | 89,7±11,9 |
| АсАТ, Ед/л | 95,4±14,8 | 98,8±13,4 |
| Глюкоза крови, ммоль/л | 8,7±0,3 | 8,2±0,5 |
| Амилаза крови, Ед/л | 526,7±131,5 | 542,1±129,1 |
| Амилаза мочи, Ед/л | 2246±722,1 | 2298±764,3 |
| Креатинин, мкмоль/л | 111,4±11,2 | 128,2±11,7 |
| Мочевина, ммоль/л | 7,7±0,4 | 7,8±0,7 |
| Гемоглобин, г/л | 154,1±3,8 | 169,2±4,6 |
| СОЭ, мм/ч | 22,7±2,9 | 23,8±4,1 |
| Лейкоциты, ·109/л | 15,2±0,9 | 17,8±0,7 |
| Палочкоядерные нейтрофилы, ·109/л | 2,3±0,3 | 2,8±0,2 |
| Тромбоциты, ·109/л | 297,3±37,1 | 305,4±40,6 |
| Лейкоцитарный индекс интоксикации, усл. ед. | 7,2±0,7 | 7,6±0,3 |
Примечание. АлАТ — аланинаминотрансфераза; АсАТ — аспартатаминотрансфераза; СОЭ — скорость оседания эритроцитов.
По результатам анализа необходимо отметить отсутствие выраженных, статистически значимых изменений, которые можно было бы использовать для верификации степени тяжести заболевания.
Первыми шагами при проведении атомно-силовой микроскопии была сравнительная оценка линейных размеров эритроцитов. Учитывая двояковогнутую форму эритроцита, помимо длины и ширины измеряли максимальную и минимальную высоту и глубину впадины исследуемых клеток (табл. 3).
Таблица 3. Сравнение линейных параметров эритроцитов
| Критерий | Длина, мкм | Ширина, мкм | Высота, нм | Глубина впадины, мкм | |
| max | min | ||||
| Здоровые люди | 8,81±0,2 | 8,49±0,18 | 351±1,7 | 161,5±5,8 | 186,1±3,9 |
| Средняя степень тяжести острого панкреатита | 8,76±0,6 | 8,52±0,21 | 346,3±0,2 | 159,1±6,7 | 183,1±4,8 |
| Тяжелое течение панкреатита | 8,68±0,9 | 8,39±0,14 | 342,1±0,1 | 157,2±6,1 | 182,1±4,7 |
| p | p1—2=0,928 p1—3=0,919 | p1—2=0,836 p1—3=0,815 | p1—2=0,759 p1—3=0,742 | p1—2=0,939 p1—3=0,981 | p1—2=0,861 p1—3=0,859 |
При анализе полученных данных отчетливо прослеживаются статистически значимое уменьшение длины и возрастание ширины эритроцита по мере увеличения тяжести процесса. Отмечается уменьшение высоты эритроцита и глубины эритроцитарной впадины, что свидетельствует о тенденции к превращению эритроцита в сфероцит. В последующем проведено определение площади и объема эритроцитов, а также визуализация состояния поверхностной мембраны клетки (табл. 4).
Таблица 4. Сравнение площади, объема и поверхности эритроцитов
| Критерий | Площадь, мкм2 | Объем, мкм3 | Количество эрозий на 4×4 нм | Длина эрозий, мкм | Ширина эрозий, мкм | Глубина эрозий, мкм |
| Здоровые люди | 45,96±1,2 | 12,19±0,3 | — | — | — | — |
| Средняя степень тяжести острого панкреатита | 45,1±1,3 | 12,98±0,4 | 13±1 | 0,48±0,4 | 0,39±0,3 | 0,46±0,4 |
| Тяжелое течение панкреатита | 44,2±1,1 | 13,82±0,36 | 22±4 | 0,51±0,3 | 0,41±0,2 | 0,51±0,3 |
| p | p1—2=0,968 p1—3=0,949 | p1—2=0,964 p1—3=0,938 | p1—2<0,001 p1—3<0,001 | p1—2<0,001 p1—3<0,001 | p1—2<0,001 p1—3<0,001 | p1—2<0,001 p1—3<0,001 |
Выявлены статистически значимые уменьшение площади и увеличение объема эритроцита. Потеря эритроцитом двояковогнутой формы приводит к уменьшению газообмена клеткой и, как следствие, к гипоксии тканей, что, в свою очередь, усугубляет тяжесть состояния и вызывает апоптоз клеток тканей организма, в том числе поджелудочной железы.
При сравнительном сканировании мембран эритроцитов можно отчетливо проследить ее негативные изменения по сравнению с мембраной здоровых людей и в зависимости от тяжести процесса (рисунок).
Сравнение сканов поверхности эритроцитов, полученных с помощью атомно-силовой микроскопии.
ОПССТ — острый панкреатит средней степени тяжести; ОПТСТ— острый панкреатит тяжелой степени тяжести.
При изучении состояния клеточной мембраны эритроцитов отмечается появление эрозий на их поверхности. При этом как количество язвенных изменений, так и их размеры зависят от степени тяжести состояния. При утяжелении состояния количество эрозий увеличилось практически в 2 раза при увеличении их длины, ширины и глубины. Чем больше указанных изменений, тем больше вероятность возникновения распада, то есть гибели клетки.
Как уже отмечено выше, аналогичные процессы происходят и в клетках поджелудочной железы. Соответственно, выраженные изменения эритроцитарной мембраны свидетельствуют о возможности развития панкреонекроза и присоединения гнойно-септических осложнений в поджелудочной железе и в организме в целом. Получение свидетельства о разрушении эритроцитарной мембраны способствует своевременной коррекции тактики проводимого лечения.
Заключение
Несмотря на наличие большого количества клинических протоколов диагностики и лечения острого панкреатита, вопрос достоверного определения степени тяжести заболевания на ранних этапах остается нерешенным. В течение первых часов от начала клинических проявлений сложно объективно оценить тяжесть течения процесса.
В литературе мы не обнаружили описания аналогичных исследований с применением атомно-силовой микроскопии в данном контексте.
В связи с идентичностью структурных изменений мембран эритроцитов и клеток других органов, включая поджелудочную железу, атомно-силовая микроскопия представляется перспективным методом для диагностики степени тяжести и прогнозирования прогрессирования патологического процесса на ранних этапах заболевания.
Таким образом, атомно-силовая микроскопия эритроцитов периферической крови может быть рекомендована в качестве дополнительного дифференциально-диагностического теста при оценке тяжести течения острого панкреатита.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Гуликян Г.Н., Пахомова Р.А.
Сбор и обработка материала — Гуликян Г.Н.
Статистическая обработка данных — Козлов В.В.
Написание текста — Гуликян Г.Н.
Редактирование — Пахомова Р.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Author contributions:
Study design and concept — Gulikyan G.N., Pakhomova R.A.
Data collection and processing — Gulikyan G.N.
Statistical analysis — Kozlov V.V.
Text writing — Gulikyan G.N.
Editing — Pakhomova R.A.