Научно-практический интерес к исследованию биомеханических особенностей капсулы хрусталика связан, с одной стороны, с анатомической значимостью этой структуры в современной микроинвазивной факохирургии, а с другой стороны — с изучением механизма изменения кривизны хрусталика в процессе аккомодации.

От уровня прочностных свойств передней капсулы (ПК) во многом зависит адекватное проведение такого важного этапа микроинвазивной факоэмульсификации, как передний капсулорексис. Исходя из этого, в серии экспериментальных исследований была изучена механическая устойчивость края ПК после различных методик капсулорексиса [1].

В механизме аккомодации, согласно так называемой хрусталиковой теории Гельмгольца, задействованы три основных компонента: цилиарное тело, связочно-капсулярный аппарат хрусталика и непосредственно вещество хрусталика, а в изменениях рефракции хрусталика первостепенное значение имеют колебания его формы и толщины за счет упругих сил вещества и капсулы [2—6].

В качестве морфологического субстрата возрастного снижения способности к аккомодации (пресбиопии), как правило, рассматривают изменения цилиарной мышцы и/или непосредственно вещества хрусталика [7, 8]. Привычная характеристика развития пресбиопии в виде использования такого функционального показателя, как объем аккомодации (кривая Дондерса), чаще ассоциируется с изменениями именно цилиарной мышцы. Между тем в отдельных исследованиях не было выявлено существенного возрастного уменьшения сократительной способности последней [9, 10]. Что же касается непосредственно вещества хрусталика, то в отсутствие капсулы оно имеет тенденцию к уплощению, т.е. не способно сохранять исходные центральную толщину и радиус кривизны, а следовательно, и изменять форму в процессе аккомодации [11]. Модуль эластичности ПК хрусталика почти в 2000 раз выше, чем корковых и ядерных слоев хрусталика [12, 13]. В состоянии покоя ПК хрусталика практически однородна по своей толщине, а в процессе аккомодации толщина капсулы максимальна в зоне экватора и минимальна — в участках переднего и заднего полюсов хрусталика [14]. Тем не менее в так называемой связочной теории пресбиопии акцент сделан на потенциальные возрастные изменения только одной анатомической составляющей связочно-капсулярного аппарата хрусталика — цинновой связки [15, 16].

Следует отметить, что в ранее проведенных исследованиях объектом биомеханических тестов, как правило, являлась ПК хрусталика [2, 17—24]. Между тем в контексте оценки возможного «участия» капсулы в механизме нарушений аккомодации научный интерес представляет детальное изучение различий «биомеханики» ПК и задней капсулы (ЗК) хрусталика. При этом следует учитывать известные топографические особенности капсулы хрусталика. Так, в норме толщина ПК и ЗК хрусталика человека колеблется в пределах 11—15 и 1—5 мкм, а кривизна — 4 и 6 мм соответственно. С возрастом толщина ПК капсулы увеличивается, а ЗК, наоборот, уменьшается [14].

Селективная оценка биомеханических показателей капсулы хрусталика связана с решением двух основных задач: выбора метода получения образцов и принципа механических испытаний. В первом случае необходимо обеспечить возможность получения образцов ПК и ЗК от идентичного «источника» (в данном случае — хрусталика человека) в широком возрастном диапазоне, а во втором — учитывать микронную толщину образцов, существенно ограничивающую фиксацию и уровень механического воздействия в процессе тестирования.

Образцы капсулы хрусталика человека для проведения биомеханических тестов могут быть получены из кадаверных глаз (т. е. ex vivo) и/или в процессе микроинвазивной факохирургии в результате капсулорексиса (т. е. практически in vivo). В последнем случае имеются объективные ограничения в плане репрезентативности материала, связанные с возрастом пациентов (в основном пожилой и старческий диапазон) и ограниченными показаниями к выполнению заднего капсулорексиса для получения образцов ЗК. При этом вопрос о выраженности постмортальных изменений капсулы и потенциальном влиянии этих изменений на ее биомеханические показатели остается открытым. В качестве методов выбора биомеханического тестирования рассматривают растяжение до момента разрыва и индентирование или продавливание (в том числе в наномасштабе — так называемое наноиндентирование) образцов, а также атомно-силовую микроскопию (АСМ).

Целью настоящего исследования явилась селективная оценка биомеханических показателей капсулы хрусталика, а решение конкретных задач было связано со сравнительной оценкой и анализом возрастных изменений биомеханических показателей ПК и ЗК.

Материал и методы

Материал исследования — 73 парных центральных фрагмента ПК и ЗК хрусталика человека, полученных из донорских (кадаверных) глаз и в результате переднего и заднего капсулорексиса в процессе микроинвазивной факохирургии (38 и 35 парных образцов соответственно). Образцы ПК и ЗК кадаверных глаз формировали с помощью микрохирургических ножниц и капсульного пинцета после предварительного извлечения хрусталика. В процессе микроинвазивной факохирургиии передний и задний капсулорексис выполняли после «насечки» и формирования дупликатуры капсулы с помощью капсульного пинцета за счет центростремительного направления манипуляций (все вмешательства были выполнены одним хирургом). Диаметр образцов ПК находился в пределах 4,0—5,5, а ЗК — 2,5—3,0 мм. Полученные образцы помещали в сбалансированный солевой раствор (BSS) и хранили в холодильнике до проведения испытаний (время хранения составляло от 1,5 до 3 ч). Возраст доноров и пациентов находился в диапазоне от 28 до 85 лет.

Критерии исключения из отбора: наличие сахарного диабета и воспаления сосудистой оболочки глаза (у пациентов), псевдоэксфолиативного синдрома (у пациентов и доноров), разрушение и скручивание образца на этапе подготовки (независимо от источника получения образцов).

Количественное распределение исследованных образцов в зависимости от методики получения, а также возраста доноров и пациентов представлено в табл. 1. Первоначально указанные возрастные диапазоны были выделены на основе известных временных периодов формирования и развития пресбиопии с учетом предполагаемых перспектив прикладного значения возрастных изменений «биомеханики» капсулы хрусталика в нарушениях аккомодации. Необходимо отметить ожидаемое превалирование объема материала (независимо от «источника»), полученного в возрастной группе старше 50 лет и ограниченное — в возрастных группах до 50 лет (в большей степени в результате микроинвазивной факохирургии, что объяснимо с позиций возрастных особенностей катарактогенеза).

Таблица 1. Количественное распределение парных образцов ПК и ЗК в зависимости от «источника» получения и возрастного диапазона доноров и пациентов

Планируемое биомеханическое тестирование включало ранее разработанный протокол оценки биомеханических показателей передней капсулы — определение модуля Юнга с помощью АСМ методом наноиндентирования [17, 18]. Модуль Юнга (модуль продольной упругости) характеризует свойство материала сопротивляться сжатию/растяжению при упругой деформации. Данный показатель определяют как отношение напряжения к деформации и выражают в мега- или килопаскалях (МПа и кПа соответственно паскаль (Па) — единица измерения давления, вызываемого силой, равной одному ньютону (Н); 1 МПа равен 1 000 000 Па, а 1 кПа — 1000 Па).

При исследовании ПК субкапсулярный эпителий не удаляли и использовали в качестве маркера при идентификации внутренней поверхности образцов, так как в приведенных выше исследованиях было выявлено, что применяемое рядом авторов удаление субкапсулярного эпителия с помощью 0,1% раствора Triton X-100 практически не влияло на биомеханические показатели.

В процессе АСМ применяли кантилеверы Scan Asyst-Fluid (Bruker, США) с коэффициентом жесткости, равным 0,7 Н/м, и радиусом острия 20 нм. Измерения проводили в режиме Fast Force Volume (FFV), который заключается в снятии массива (набора) силовых кривых на заданном участке. В данном исследовании эта область представляла собой квадрат размером 80×80 мкм, 32×32 точки снятия и по 3—6 участков измерения на наружной и внутренней поверхности образца. Каждая силовая кривая отражает зависимость силы от глубины продавливания (вертикального смещения кантилевера). Силовые кривые обрабатывали в программе Nanoscope Analysis (Bruker, США) и использовали модель Герца, которая позволяет вычислить модуль Юнга образца капсулы на основе зависимости силы от глубины продавливания:

,

где F — сила (нН), δ — глубина продавливания (нм), R — радиус острия кантиливера (нм), ν — коэффициент Пуассона передней капсулы хрусталика, который принимают за 0,47 [8].

Следует отметить, что идентификация внутренней поверхности ЗК была связана с объективными трудностями, с одной стороны, из-за отсутствия эпителия, а с другой стороны — из-за выраженной тенденции образцов к «слипанию» вследствие малой толщины и диаметра. Исходя из этого, при трактовке результатов АСМ-исследования обеих поверхностей ЗК учитывали ранее полученные данные тестирования ПК и считали, что наружная поверхность ЗК имеет меньший модуль упругости в сравнении со своей внутренней поверхностью [17, 18]. При этом интраоперационное окрашивание внутренней поверхности ЗК сочли нецелесообразным, принимая во внимание ранее представленные данные о возможном влиянии красителя Trypan blue на «биомеханику» капсулы, не исключающие возможности снижения жесткости последней [18, 25, 26].

Для упрощения оценки зависимости биомеханических свойств образцов от величины модуля Юнга использовали такую характеристику, как «жесткость» (англ. stiffness): этот показатель повышается при увеличении модуля Юнга.

Статистический анализ и оценка значимости получаемых результатов проведены с помощью программ Microsoft Excel, IBM SPSS Statistics 26.0.0.0. Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро—Уилка в первичных группах образцов, полученных из донорского материала и в процессе микроинвазивной факохирургии (38 и 35 парных образцов соответственно). Направление и тесноту корреляционной связи между двумя количественными показателями оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона (при нормальном распределении сопоставляемых показателей). В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывали с помощью медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей [25-го; 75-го перцентилей]. Сравнение двух выборок по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполняли с помощью U-критерия Манна—Уитни. Для проверки различий между связанными выборками по уровню количественного признака был применен T-критерий Уилкоксона. Прогностическую модель, характеризующую зависимость количественной переменной от факторов, разрабатывали с помощью метода линейной регрессии. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Для объединенной выборки (73 парных образца независимо от источника получения) количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. Направление и тесноту корреляционной связи между двумя количественными показателями оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена — r (при распределении показателей, отличном от нормального).; 0,01<r≤0,29 — слабая положительная связь, 0,30<r≤0,69 — умеренная положительная связь, 0,70<r≤1,00 — сильная положительная связь, –0,01<r≤–0,29 — слабая отрицательная связь, –0,30<r≤-0,69 — умеренная отрицательная связь, –0,70<r≤–1,00 — сильная отрицательная связь. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Решение основной задачи исследования предполагало определение биомеханических показателей парных, т.е. полученных из одного источника, образцов ПК и ЗК. В процессе отработки описанного выше протокола биомеханического тестирования были выявлены ограничения в применении методики наноиндентирования для исследования ЗК, связанные с малой толщиной и диаметром образцов, полученных в результате микроинвазивной факохирургии. Ранее было показано, что данные АСМ и наноиндентирования для ПК хорошо коррелируют между собой и метода АСМ достаточно для анализа механических свойств ПК [18]. Исходя из этого, в дальнейшем сравнительную оценку и анализ возрастных изменений биомеханических показателей ПК и ЗК проводили на основе данных АСМ.

Результаты первого фрагмента исследования, который был связан со сравнительной оценкой биомеханических показателей образцов ПК и ЗК, полученных из донорского материала и в результате микроинвазивной факохирургии в общей выборке (т.е. независимо от возраста), представлены в табл. 2. Независимо от источника получения образцов модуль Юнга внутренней поверхности (т.е. жесткость) как ПК, так и ЗК превышал аналогичный показатель наружной поверхности. При дифференцированном анализе модуля Юнга наружной и внутренней поверхности ПК и ЗК выявлена общая тенденция, которая заключалась в превалировании показателей ПК — только для наружной поверхности образцов, полученных из донорского материала, разница результатов исследования ПК и ЗК была статистически незначимой.

Таблица 2. Модуль Юнга (медиана [25-й; 75-й перцентили], кПа) по данным АСМ-исследования наружной и внутренней поверхности образцов ПК и ЗК

Примечания. * — T-критерий Уилкоксона; ** — различия статистически значимы.

Решение задачи следующего фрагмента исследования (анализ возрастных изменений биомеханических показателей ПК и ЗК) в аналогичном формате, т.е. в зависимости от источника их получения, осложнялось рассмотренными выше объективными трудностями получения парных образцов ПК и ЗК в процессе микроинвазивной факохирургии у пациентов в возрасте до 50 лет (всего 12). Объединение образцов в одну группу независимо от методики получения в известной степени могло повысить репрезентативность выборки и упростить возможности статистической обработки результатов. На наш взгляд, основным условием подобного объединения являлась бы сопоставимость четырех результатов биомеханических тестов образцов (наружной и внутренней поверхности ПК и ЗК), полученных из донорского материала и в процессе микроинвазивной факохирургии. При статистической обработке указанных биомеханических показателей с помощью U-критерия Манна—Уитни значимой разницы в зависимости от источника получения выявлено не было (p=0,064; p=1,000; p=0,468; p=0,361 соответственно). Для наглядности результаты сравнения представлены в виде ящичных диаграмм на рис. 1. Полученные результаты, с одной стороны, позволяют высказать предположение о минимальном влиянии на биомеханические показатели капсулы постмортальных изменений хрусталика, а с другой — в контексте настоящего исследования на основе корреляционного анализа оценить возрастные изменения ПК и ЗК в общей выборке, т.е. независимо от источника получения образцов.

Рис. 1. Ящичные диаграммы, отражающие различия модуля Юнга (кПа) наружной (А) и внутренней (Б) поверхности ПК; наружной (В) и внутренней (Г) поверхности ЗК в зависимости от источника получения образцов (1 — донорский материал; 2 — микроинвазивная факохирургия).

Общая тенденция возрастных изменений «биомеханики» капсулы хрусталика заключалась в увеличении модуля Юнга наружной поверхности и снижении — внутренней. В совокупности эти изменения приводили к уменьшению такого условного показателя, как соотношение жесткости внутренней и наружной поверхности. В процессе корреляционного анализа переменных этого соотношения и возраста была выявлена незначимая слабая отрицательная связь для ЗК (r=–0,109; p=0,357; рис. 2, а) и значимая умеренная отрицательная связь для ПК (r=–0,349; p=0,002; рис. 2, б).

Рис. 2. График зависимости соотношения модуля Юнга внутренней и наружной стороны капсулы хрусталика от возраста.

а — ЗК; б — ПК.

Обсуждение

Исследование биомеханических показателей капсулы хрусталика человека непосредственным образом связано с выбором источника получения образцов и методики проведения механических испытаний.

Образцы капсулы хрусталика человека могут быть получены ex vivo (глаза доноров) и практически in vivo в результате микроинвазивной факохирургии [1, 18]. Гипотетические преимущества последнего подхода в плане снижения влияния постмортальных изменений на результаты биомеханического тестирования в определенной степени нивелируются ограничениями в формировании репрезентативной возрастной выборки. В проведенном исследовании эта проблема осложнялась необходимостью получения парных образцов ПК и ЗК в связи с известными показаниями и условиями выполнения заднего капсулорексиса в процессе микроинвазивной факохирургии. Сравнение результатов тестирования образцов, полученных из донорских глаз и интраоперационно, не выявило значимой разницы средних показателей модуля Юнга. Исходя из этого, анализ возрастных изменений ПК и ЗК проводили в общей выборке, т.е. независимо от источника получения образцов.

Использование классических тестов, включающих растяжение образцов, при исследовании «биомеханики» капсулы хрусталика человека связано с определенными трудностями фиксации образцов из-за их малой толщины. На основе одноосного растяжения образцов, полученных из донорских глаз, было показано, что с увеличением возраста происходит уменьшение механической устойчивости (англ. mechanical strength) как ПК, так и ЗК хрусталика [27, 28]. При этом выявлены более высокие значения модуля Юнга ПК.

При сравнительной оценке «биомеханики» края ПК после мануальной и фемтолазерной капсулотомии перед фиксацией образцов предложено формировать дупликатуру капсулы, что позволяет «отодвинуть» измеряемые показатели от нижней границы чувствительности испытательной машины [19]. Такая подготовка образцов к механическим испытаниям, по мнению авторов, не препятствует решению основной задачи исследования — определения не абсолютных, а относительных (сравнительных) прочностных характеристик в основном края капсулы в идентичных условиях тестирования. Следует учитывать, что в естественных (физиологических) условиях выраженность факторов, индуцирующих изменения формы и структуры биоматериалов, как правило, минимальна и несопоставима с усилиями, необходимыми для растяжения образцов.

Потенциал применения АСМ и наноиндентирования как методов биомеханического тестирования биоматериалов, и капсулы хрусталика в том числе, продемонстрирован в ряде исследований [17, 18, 22, 29—38]. К основным преимуществам указанных методов относят возможность измерения модуля упругости (модуля Юнга) за счет приложения минимальных силовых нагрузок локально в заданной точке с учетом исходной биомеханической неоднородности поверхности образца. При этом следует учитывать, что «локальность» воздействия в некоторой степени ограничивает получение информации о биомеханических особенностях структуры в целом.

Наноиндентирование и АСМ ранее использовали для оценки возрастных изменений биомеханических свойств ПК хрусталика человека. Отмечено возрастное увеличение модуля Юнга наружной поверхности ПК [35, 39]. В другом исследовании «биомеханики» ПК было высказано предположение о том, что АСМ более чувствительна к свойствам отдельных волокон, поскольку наноиндентер из-за большей площади контакта и глубокого продавливания (~1000 нм против ~200 нм для АСМ) усредняет измеренное значение модуля Юнга и тем самым уменьшает разницу между показателями модуля Юнга внутренней и наружной поверхности ПК [18]. В настоящей работе ограничения в применении наноиндентирования ЗК были связаны и с метрическими характеристиками (толщиной и размерами) образца, что исключало возможность адекватного использования этого метода в тестировании полученных интраоперационно образцов ЗК.

Более высокая жесткость внутренней поверхности ПК по сравнению с наружной, предположительно из-за особенностей распределения белков внеклеточного матрикса, была показана в предыдущих исследованиях [17, 18, 36, 40]. В настоящей работе аналогичное направление изменений отмечено и в отношении ЗК хрусталика. Кроме этого подтверждена ранее отмеченная закономерность возрастных изменений ПК хрусталика, заключающаяся в уменьшении модуля Юнга внутренней поверхности и увеличении наружной и, как следствие, снижении соотношения модуля Юнга внутренней и наружной поверхности капсулы. При этом в отношении ЗК эта тенденция носила менее выраженный характер.

С клинической точки зрения, выявленные различия в «биомеханике» ПК и ЗК хрусталика человека, на наш взгляд, можно рассматривать, исходя из следующих анатомических и функциональных особенностей хрусталика:

— отмеченного выше существенного различия толщины ПК и ЗК;

— возрастного увеличения толщины ПК в результате синтеза компонентов внеклеточного матрикса эпителиальными клетками [14, 39];

— неравномерного изменения кривизны ПК и ЗК в процессе аккомодации, которое наглядно иллюстрируют результаты оптической когерентной томографии переднего сегмента глаза (рис. 3, а, б).

Рис. 3. Результаты оптической когерентной томографии переднего сегмента глаза.

а — в покое аккомодации; б — при напряжении аккомодации: уменьшение радиуса кривизны («укручение») ПК и ЗК в результате напряжения аккомодации — 2,06 и 1,27 мм соответственно.

Заключение

Принцип селективного исследования биомеханических свойств капсулы хрусталика на основе АСМ может быть использован для выявления различий в показателях как различных участков (в частности ПК и ЗК), так и поверхностей (внутренней и наружной) капсулы. При сравнении модуля Юнга образцов капсулы хрусталика человека, полученных из донорских глаз и в процессе микроинвазивной факохирургии, значимой разницы средних показателей выявлено не было, что косвенно свидетельствует о минимальном влиянии на биомеханические показатели капсулы постмортальных изменений хрусталика.

Общие закономерности «биомеханики» капсулы хрусталика человека заключаются в превалировании модуля Юнга (жесткости), с одной стороны, ПК над ЗК, а с другой — внутренней поверхности над наружной как ПК, так и ЗК. Возрастные изменения связаны с увеличением жесткости наружной поверхности и снижением жесткости внутренней поверхности и более выражены в отношении ПК.

Полученные результаты свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения роли «биомеханики» капсулярного компонента в возрастных нарушениях аккомодации.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Аветисов С.Э., Тимашев П.С.

Сбор и обработка материала: Аветисов К.С., Шитикова А.В., Ефремов Ю.М., Патеюк Л.С., Асламазова А.Э.

Написание текста: Аветисов К.С., Шитикова А.В.

Редактирование: Аветисов С.Э., Борисенко Т.Е.

Источник финансирования. Работы по измерению механических свойств капсулы хрусталика с помощью атомно-силового микроскопа выполнены при поддержке гранта Российского научного фонда (грант №23-74-10113, https://rscf.ru/project/23-74-10113/).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.