Рак желудка (РЖ) является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований во всем мире. Наиболее высокие показатели заболеваемости обнаруживаются в Восточной Азии, а также в Восточной Европе [1]. По данным GLOBCAN, в 2022 г. было зарегистрировано более 968 тыс. новых случаев и около 660 тыс. смертей от рака желудка, что ставит его на 5-е место по заболеваемости и смертности во всем мире [1]. По данным статистики злокачественных новообразований в России в 2023 г., по уровню заболеваемости рак желудка занимает 5-е место среди мужчин, 8-е среди женщин и 4-е место по уровню смертности среди обоих полов [2]. В последние годы подходы к лечению РЖ претерпевают значительные изменения. Успешно применяется мультимодальная терапия, включающая радикальные хирургические вмешательства, неоадъювантную химиотерапию, таргетную и иммунотерапию, однако общая выживаемость по-прежнему остается низкой [3]. В основном это обусловлено несвоевременной диагностикой, прогрессирующим течением заболевания, неудовлетворительным ответом на терапию и отсутствием стандартизированных и воспроизводимых биомаркеров для персонализированного подхода к назначению лечения.

Золотым стандартом прогностической стратификации пациентов с РЖ остается система TNM, дополняемая гистологической классификацией Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и P. Lauren, а также такими факторами, как наличие/отсутствие лимфоваскулярной и периневральной инвазии [4]. Также используются некоторые новые прогностические биомаркеры, включающие соотношение пораженных и интактных лимфатических узлов (LNR), наличие циркулирующих опухолевых клеток в кровотоке (CTCS) и соотношение нейтрофилов и лимфоцитов в строме опухоли (NLR) [5—7]. Однако внедрение данных маркеров в рутинную клиническую практику не способствует увеличению выживаемости. Таким образом, поиск новых чувствительных, специфичных и воспроизводимых биомаркеров для разработки персонализированного подхода к ведению пациентов с РЖ не теряет своей актуальности. Одним из многообещающих прогностических факторов является опухолевое почкование [8].

Феномен опухолевого почкования (tumor budding, TB) определяется как наличие в опухолевой строме отдельных атипичных клеток или кластеров, состоящих из четырех клеток и менее и считается патоморфологическим маркером агрессивного поведения опухоли, имитирующим эпителиально-мезенхимальную трансформацию (Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT). Исследовательская группа Международной консенсусной конференции по феномену опухолевого почкования (International Tumour Budding Consensus Conference, ITBCC) в 2016 г. утвердила точку отсечения для определения опухолевой почки на уровне четырех клеток и менее, что отличает почку от «малодифференцированного кластера», который определяется как 5 клеток или более [9, 10] (рис. 1).

Рис. 1. Различия малодифференцированных кластеров и опухолевых почек.

а — пример «малодифференцированных кластеров» в виде 5 или более опухолевых клеток (обведены); б — феномен опухолевого почкования в виде отдельных опухолевых клеток и/или опухолевых кластеров из 4 и менее клеток (обведены). Окраска гематоксилином и эозином, ×400.

Установлено, что TB является неблагоприятным прогностическим фактором для колоректальной карциномы [11]. Считается, что часть опухоли, в которой TB наиболее выражено, характеризуется более агрессивным фенотипом по сравнению с ее основным массивом [12]. ТВ все чаще рассматривается как ценный морфологический прогностический признак при раке пищевода [13, 14], аденокарциноме желудка кишечного типа [15] и протоковой аденокарциноме поджелудочной железы [16].

Первое описание того, что мы сейчас понимаем под феноменом опухолевого почкования, было дано T. Imai [8] еще в 1950-х годах и обозначено как «прорастание» в инвазивном крае карцином.

В исследовании, проведенном K. Hase и соавт. [17] в 1993 г., впервые был введен в употребление термин «опухолевое почкование» и показано резкое снижение выживаемости при увеличении количества опухолевых почек у больных колоректальным раком (пятилетняя выживаемость составила 22% против 71%). В данной работе феномен опухолевого почкования определялся как небольшие скопления опухолевых клеток в инвазивном крае новообразования и классифицировался как отсутствие/легкая степень (Bd-1) и умеренная/тяжелая степень (Bd-2).

В течение последних 20 лет было предложено множество методов оценки TB с различными вариантами обозначения предельных значений, которые базируются на анализе как гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, так и результатов иммуногистохимического окрашивания антителами к панцитокератину. Один из первых количественных и наиболее популярных методов был предложен H. Ueno и соавт. [18]. Авторы подсчитывали количество опухолевых почек в области максимального почкования, используя увеличение в пределах поля зрения об.×25, а затем классифицировали пациентов на группы с низкой (менее 10 опухолевых почек) и высокой степенью TB (10 опухолевых почек и более). В последующем исследовании научная группа H. Ueno и соавт. [19] модифицировала предложенный способ: после выбора одного поля с более выраженным TB подсчет опухолевых почек проводился с использованием об. ×20. Другой популярный метод оценки опухолевого почкования был впервые описан E. Karamitopoulou и соавт. [20]. В исследовании протоковой аденокарциномы поджелудочной железы для идентификации опухолевых почек авторы использовали иммуногистохимический маркер панцитокератин. Опухолевое почкование оценивалось в 10 полях зрения при большом увеличении (HPF). Карциномы были разделены на две группы — с низким и высоким TB, которое определялось как среднее значение (пороговое значение — 10 опухолевых почек в 10 HPF). В сравнительном исследовании двух вышеописанных методов их воспроизводимость оказалась одинаковой. Использование иммуногистохимического маркера цитокератина увеличивало количество опухолевых почек (частично за счет обнаружения отдельных клеток в железах, разрушенных воспалительным инфильтратом), вместе с тем это не увеличивало вероятность расхождения между методами [21].

В научной литературе ведется дискуссия относительно выбора области, в которой следует оценивать опухолевое почкование. В большинстве исследований [18, 19] используется метод «горячих точек» (hotspot), заключающийся в выборе единственного поля с максимальным почкованием для проведения подсчета. Другие авторы [20, 22, 23] предлагают рассматривать различные области, начиная от оценки всего инвазивного края и заканчивая подсчетом почек в 5—10 областях с использованием средних значений. Однако в упомянутом выше многоцентровом исследовании методы H. Ueno и L.M. Wang (среднее значение на 5 HPF) имели сопоставимую межнаблюдательную вариабельность (k=0,35 против 0,25) [21].

Метод H. Ueno и соавт. [19] с некоторыми модификациями был выбран в качестве рекомендованного на конференции ITBCC, 2016 [12].

Таким образом, консенсусный метод оценки TB основан на применении рутинной окраски гематоксилином и эозином и подсчете количества единичных клеток или скоплений из четырех клеток и менее в области инвазивного края с использованием об. микроскопа ×20. По количеству TB выделяют низкую — Bd1 (0—4 почки), умеренную — Bd2 (5—9 почек) и высокую степень — Bd3 (10 почек более) (рис. 2). Чтобы свести к минимуму вариабельность при выборе области максимального почкования, рекомендуется проводить подсчет не менее чем в 10 HPF в инвазивном крае опухоли.

Рис. 2. Примеры различных степеней опухолевого почкования в инвазивном крае колоректального рака на основе ITBCC, 2016.

а — отсутствие опухолевых почек в инвазивном крае — Bd1 (низкий); б — 1 опухолевая почка в инвазивном крае — Bd1 (низкий); в — 7 опухолевых почек в инвазивном крае — Bd2 (умеренный); г — 27 опухолевых почек в инвазивном крае — Bd3 (высокий). Окраска гематоксилином и эозином, ×400.

Публикации о применении TB в качестве потенциального прогностического фактора при аденокарциноме желудка немногочисленны [24—27]. В данных работах TB оценивается только в кишечном подтипе РЖ, поскольку диффузный и промежуточный подтипы по определению содержат множество опухолевых почек [15].

В исследовании M. Gulluoglu и соавт. [24] оценили предиктивный потенциал TB в отношении метастазирования в лимфатические узлы в 126 аденокарциномах желудка I стадии после выполненной резекции. Случаи относили к положительным, если почки были обнаружены при увеличении об. ×40 в инвазивном крае опухоли (31 из 126 случаев), при этом подсчет их количества не проводился. Исследователи обнаружили, что опухолевые почки значительно чаще встречались у пациентов с метастатическими карциномами pT1b по сравнению с пациентами, не имеющими метастазов в лимфатических узлах, и предположили, что ТВ может быть одним из критериев, по которому пациенты со стадией Т1b могут быть отнесены к кандидатам для прохождения только хирургического лечения.

Оценка опухолевого почкования как неблагоприятного прогностического фактора в когортах пациентов, перенесших резекцию желудка, была проведена в 3 исследованиях, в которых использовались различные методы оценки TB [15, 25, 26]. D.J. Szor и соавт. [7] проанализировали выборку из 52 аденокарцином желудка кишечного типа методом подсчета количества опухолевых почек в 10 полях зрения при увеличении об. ×20. При среднем количестве (≥1 почки в поле зрения) случай считался положительным по TB (63% случаев). TB высокой степени достоверно ассоциировалось с метастазированием в лимфатические узлы. B. Qi и соавт. [25] изучали более крупную когорту из 153 аденокарцином желудка кишечного типа. Авторы оценивали TB при помощи иммуногистохимического маркера цитокератина с использованием среднего количества почек по меньшей мере в 3 полях зрения при увеличении об. ×40 в области максимального почкования. Пациенты были разделены на 2 группы (TB низкой и высокой степени) в соответствии со средним количеством опухолевых почек. TB высокой степени было достоверно связано со снижением общей выживаемости. Третье исследование [26] когорты из 296 пациентов с любой T-стадией аденокарциномы желудка показало снижение общей выживаемости при TB высокой степени. Однако в этом исследовании совместно рассматривались аденокарциномы как кишечного, так и диффузного типа, в связи с чем анализ результатов затруднен из-за смешивающего фактора (заведомо более неблагоприятный прогноз для аденокарциномы диффузного типа по сравнению с аденокарциномой кишечного типа).

Несмотря на многообразие методик подсчета TB, обнаружено, что повышенная плотность опухолевых почек всегда коррелирует с неблагоприятными клинико-морфологическими характеристиками РЖ, такими как больший размер опухоли, низкая степень дифференцировки, диффузный подтип по классификации P. Lauren, большая глубина инвазии, наличие метастазов в лимфатических узлах и отдаленных метастазов, а также лимфоваскулярной и периневральной инвазии [27]. Среди этих клинико-морфологических характеристик подтип по P. Lauren и наличие метастазов в лимфатических узлах могут иметь наиболее важное практическое значение. В исследованиях, которые включали все подтипы по P. Lauren, РЖ диффузного типа классифицируется как карцинома с TB высокой степени. Что касается метастазирования в лимфатические узлы, то взаимосвязь этого параметра с TB изучалась практически во всех исследованиях: продемонстрировано, что высокая степень TB способствует распространению в регионарные лимфатические узлы. Более того, научные группы под руководством D. Ulase и соавт. [28] и L. Szalai и соавт. [29] обнаружили, что у пациентов с TB высокой степени количество пораженных лимфатических узлов также было значительно больше.

Y.X. Guo и соавт. [27] в опубликованном метаанализе, посвященном изучению взаимосвязи опухолевого почкования и РЖ, также проанализировали ассоциацию этого феномена с выживаемостью пациентов. В 9 исследованиях сообщалось о влиянии почкования на общую выживаемость, и только в работах D. Ulase и соавт. [28] и C. Pun и соавт. [30] прогностическая значимость этого параметра не обнаружена. В обоих исследованиях TB оценивали в соответствии с рекомендациями ITBCC, 2016; вероятно, противоречивые результаты могут быть следствием влияния других факторов [28, 30]. Только в 2 исследованиях рецидив и летальный исход пациента были установлены в качестве первичных контрольных точек и в каждом из них сообщалось о более высокой вероятности рецидива или смерти в случае TB высокой степени [15, 31]. В дополнение к общей выживаемости только в 3 исследованиях обнаружены данные о влиянии TB на безрецидивную выживаемость. Результаты только 1 из исследований продемонстрировали независимую прогностическую ценность TB при РЖ, в то время как в 2 других работах сообщалось, что связь между TB и безрецидивной выживаемостью была статистически значимой только при однофакторном анализе [28, 29, 32].

С точки зрения патологии опухолевое почкование представляет собой процесс, при котором клетки основного массива опухоли проникают в прилежащую строму, образуя пальцевидные выступы, от которых отделяются одиночные клетки или группы клеток. В «отпочковывающихся» клетках активируются различные сигнальные пути, приводящие к повышенной экспрессии факторов транскрипции, связанных с ЕМТ, и потере межклеточной адгезии [33]. Помимо этого меняются состав и плотность опухолеинфильтрирующих лимфоцитов (рис. 3). Опухолевая почка представляет собой особую часть — «авангард» опухоли, ответственный за начало процессов инвазии и метастазирования. Некоторые ученые рассматривают TB как специфическое гистологическое проявление ЕМТ [34, 35].

Рис. 3. Механизм опухолевого почкования при раке желудка.

Повышение экспрессии факторов транскрипции, связанных с ЕМТ, а также изменение плотности и состава опухолеинфильтрирующих лимфоцитов с CD8+> FOXP3+ T-клеток в области хорошо сцепленного опухолевого пласта до FOXP3+ > CD8+ T-клеток в области опухолевого почкования (S.M. Xiao и соавт., 2023 с изменениями) [52].

Связь между TB и ЕМТ была исследована при различных солидных опухолях [35]. Например, замечено, что в инвазивном крае наблюдается снижение экспрессии E-кадгерина, когда опухолевые клетки теряют свой эпителиальный фенотип [35]. E-кадгерин обычно связывает β-катенин в межклеточных контактах, а снижение его уровня в мембране может привести к ядерной транслокации β-катенина и последующей активации сигнального пути Wnt/β-катенин по мере развития ЕМТ, который играет решающую роль в регуляции дифференцировки клеток и развитии злокачественных опухолей. Напротив, основные регуляторы ЕМТ, включая ЕМТ-ассоциированные факторы транскрипции (ZEB1, ZEB2, TWIST1, TWIST2, SNAI1 и SNAI2) и сигнальные пути (WNT/β-катенин, TGF-β), избыточно экспрессируются или активируются в раковых клетках, полученных из области TB [35]. Кроме того, маркеры опухолевых стволовых клеток, включая CD44, LGR5 и ALDH1, часто экспрессируются в опухолевых почках, что указывает на устойчивость к аноикису, самообновление и способность диссоциированных клеток к метастазированию [35]. Эти данные свидетельствуют, что опухолевые почки представляют собой морфологическое проявление ЕМТ. Исследования по ассоциации TB, ЕМТ и опухолевых стволовых клеток при РЖ немногочисленны. В инвазивном крае РЖ кишечного типа показатели TB положительно коррелировали с экспрессией гена ZBTB7A, который, как было показано, увеличивает экспрессию EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), играющего ключевую роль в регулировании клеточного роста и дифференцировки, приводя к активации путей PI3K-AKT-mTOR и MAPK-ERK, обеспечивающих выживаемость опухолевой клетки [36]. Кроме того, в нескольких исследованиях [37—39] обнаружена повышенная экспрессия биомаркеров ЕМТ и опухолевых стволовых клеток в инвазивном крае РЖ, хотя это не изучалось конкретно в опухолевых почках.

Для описания взаимодействия опухолевых почек и перитуморального иммунного микроокружения была предложена модель «атакующего—защищающегося». В этой модели опухолевые почки играют роль «атакующего» благодаря своим агрессивным свойствам, в то время как клетки врожденной и адаптивной иммунной системы опосредуют «контратаку» [40, 41]. Сообщалось, что TB связано со слабой воспалительной реакцией со стороны окружающих тканей и с плохим прогнозом при раке пищевода и раке гастроэзофагального перехода [42]. В 2018 г. при поддержке Общества иммунотерапии рака (SITC) был создан международный консорциум для валидации консенсусного метода подсчета иммунных клеток в клинической практике у пациентов с раком толстой кишки I–III стадии [43]. За основу предложены показатели плотности CD3+ и цитотоксических CD8+T-клеток в опухоли и в зоне инвазивного края. Регуляторные клетки FOXp3+ (Tregs), играющие критическую роль в механизмах иммунной толерантности и недостаточности противоопухолевого иммунитета, часто использовались в качестве отрицательного показателя [44]. Анализ иммунного микроокружения в зоне TB в РЖ показал, что плотность опухолевых почек отрицательно коррелирует с количеством инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILs), а плотность TILs изменилась с CD8+ > FOXp3+ > OX40+ > GrB+ T-клеток в области хорошо сцепленного опухолевого пласта до FOXp3+ > CD8+ > OX40+> GrB+ T-клеток в зоне ТВ, что указывает на привилегированную иммунную среду, создаваемую опухолевыми почками [41]. Таким образом, в зоне активного опухолевого почкования уменьшается количество CD8+ цитотоксических T-лимфоцитов, составляющих основу противоопухолевого иммунитета и «атакующих» раковые клетки, и в то же время увеличивается количество FOXP3+клеток, осуществляющих иммуносупрессорную функцию, тем самым способствуя распространению онкологического процесса и метастазированию.

Cancer Genome Atlas (TCGA) и Asian Cancer Research Group (ACRG) было предложено несколько систем молекулярной классификации РЖ, основанных на молекулярных маркерах [45, 46]. Однако эти молекулярные тесты крайне дорогостоящие, что препятствует их широкому применению в клинической практике. Основным преимуществом стратификации пациентов с РЖ на основе TB является то, что его можно подсчитывать в процессе обычного патолого-анатомического исследования при окраске гематоксилином и эозином без дополнительных затрат. Следовательно, если будет накоплено больше высококачественных фактических данных и достигнут консенсус в отношении методов оценки TB в РЖ, опухолевое почкование потенциально можно считать актуальным в различных клинических сценариях (рис. 4).

Рис. 4. Перспективы применения и проблемы опухолевого почкования при раке желудка.

(S.M. Xiao и соавт., 2023 с изменениями) [52].

К тому же РЖ часто диагностируется на поздней стадии, что требует предоперационной химиотерапии для улучшения результата хирургического лечения и увеличения выживаемости. В настоящее время решение о назначении предоперационной терапии определяется главным образом стадией TNM и общим соматическим статусом пациента, а показания и методы разнятся из-за отсутствия надежных прогностических биомаркеров [47]. ТВ можно оценивать в материале эндоскопических биопсий: для этого материала также показано, что данный показатель является важным прогностическим фактором [48]. В работе [49], включавшей исследование аденокарциномы пищевода и гастроэзофагального перехода, продемонстрировано, что наличие TB в предоперационной эндоскопической биопсии ассоциировано с низкой выживаемостью.

Несмотря на то что РЖ является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований во всем мире, доступно относительно небольшое количество вариантов эффективной терапии по сравнению с другими солидными опухолями. В настоящее время химиотерапия на основе фторпиримидина, платины, таксанов и иринотекана по-прежнему является основой лечения прогрессирующего РЖ [3]. Однако до настоящего времени все еще не разработаны надежные предиктивные биомаркеры для прогнозирования ответа на эти препараты. Следовательно, их назначение в настоящий момент зависит только от клинической стадии и общего клинического статуса пациентов. В качестве экономически эффективного гистопатологического биомаркера TB было исследовано для прогнозирования ответа на химиотерапию при некоторых видах рака: в данных работах сообщалось о плохом ответе у пациентов с большим количеством опухолевых почек [49].

Оценка TB в операционном материале может предоставить косвенную информацию о потенциальном ответе на другие методы лечения, такие как таргетная терапия и иммунотерапия, которые приобретают широкое распространение в лечении РЖ в последние годы. Например, известно, что активность опухолевых почек обратно коррелирует с уровнем экспрессии HER-2 и MSI-статусом [28]. Как HER-2-статус, так и MSI-статус являются четко определенными критериями для назначения химиотерапии при раке и широко используются в клинической практике [50]. Поскольку для этих таргетных методов лечения надежные прогностические биомаркеры уже определены, значение клинического применения опухолевого почкования в этих клинических ситуациях ограничено.

В настоящее время актуален вопрос выявления более перспективных биомаркеров ответа на иммунотерапию. Опухолевое почкование рассматривается как особая морфология ЕМТ, которая коррелирует с активацией различных молекул иммунологических контрольных точек, включая лиганд белка 1 запрограммированной клеточной гибели (PD-L1) [51]. Таким образом, вопрос о том, может ли высокое TB быть потенциальным предиктором ответа на терапию ингибиторами иммунологических контрольных точек, заслуживает дальнейшего изучения. При РЖ усиление перитуморального воспаления приводит к снижению количества опухолевых почек из-за связанного с воспалением разрушения раковых клеток в инвазивном крае, однако влияние на выживаемость не оценивалось [28]. Анализ иммунного микроокружения вокруг опухолевых почек в РЖ показал, что их плотность отрицательно коррелирует с количеством TILs, что указывает на привилегированную иммунную среду, создаваемую опухолевыми почками [41]. Таким образом, эти результаты указывают, что высокая степень опухолевого почкования при РЖ может представлять собой перспективный отрицательный биомаркер для иммунотерапии.

Заключение

Опухолевое почкование становится важным патоморфологическим маркером агрессивного поведения опухоли при большинстве карцином желудочно-кишечного тракта. На сегодняшний день разработана стандартизированная система оценки опухолевого почкования для колоректального рака. Однако для других карцином желудочно-кишечного тракта, в том числе и желудка, общепринятый метод подсчета и определения опухолевого почкования отсутствует.

Несмотря на высокий прогностический и предиктивный потенциал применения подсчета TB при РЖ, опухолевое почкование все еще не оценивается в повседневной практике в основном из-за отсутствия стандартизированных методов оценки, специфичных для РЖ, включая определение, отсечение количества и локализацию для подсчета. Кроме того, гистологическая гетерогенность карцином дополнительно препятствует последовательной валидации этого биомаркера в различных исследованиях.

Опухолевые почки создают в зоне инвазивного роста опухоли область высокой инфильтрации клетками FOXP3+, которые препятствуют активации иммунной системы и предотвращают гибель опухолевых почек. Привлечение иммуносупрессивных клеток позволяет опухолевым клеткам уклоняться от иммунного ответа и, как предполагается, является критическим шагом на пути к прогрессированию.

В совокупности прогностическая и предиктивная ценность опухолевого почкования определяется только косвенными доказательствами, в то время как прямых подтверждающих данных в литературе нет. Учитывая удобство оценки и отсутствие дополнительных затрат, прогностические значения могут быть легко проверены, когда эффективность различных стратегий терапии исследуется в клинических испытаниях.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.