Неоадъювантная терапия (НАТ) предполагает проведение системной терапии перед началом локального лечения. Цели проведения НАТ — снижение объема хирургического вмешательства, прогностическая информация, оценка эффекта лекарственного препарата in vivo, эрадикация микрометастазов, улучшение безрецидивной и общей выживаемости [1]. В настоящее время морфологическая оценка регресса опухоли имеет и прогностическую, и предиктивную значимость, идут многочисленные клинические исследования эффективности системной терапии резидуального рака молочной железы (РМЖ) [2—5]. В результате активного внедрения НАТ существует значительная вариабельность в методах патоморфологической оценки регресса опухоли, интерпретации самой оценки и, исходя из этого, появляются различные последующие клинические решения [6]. В клинических рекомендациях Европейского общества онкологов (ESMO) 2015 г., клинических рекомендациях по патолого-анатомической диагностике РМЖ Российского общества патологоанатомов (РОП) 2018 г. и в современной гистологической классификации опухолей молочной железы Всемирной организации здравоохранения (2019) для определения выраженности лечебного эффекта НАТ при РМЖ рекомендуется использовать систему оценки ложа остаточной опухоли — RCB (residual cancer burden). Система RCB — математическая модель, предложенная W. Symmans и соавт. в 2007 г., на основании оценки характеристик остаточной опухоли и кривых безрецидивной выживаемости больных стратифицирует пациентов при неполной морфологической регрессии [7, 8]. Однако данная система не полностью обеспечивает объективную оценку ответа опухоли на НАТ за счет трудностей определения числовых характеристик опухолевого ложа. Наиболее сложной задачей метода RCB является точное определение размера ложа опухоли, так как критерии его недостаточно четкие [9, 10]. В мировой практике в некоторых крупных медицинских учреждениях система рентгеновской визуализации удаленных образцов молочной железы используется более 30 лет. В отечественной науке метод рентгенографии (РГ) удаленных образцов молочной железы малоизвестен. Наиболее частой сферой применения РГ является интраоперационное сканирование образцов тканей при секторальной резекции молочной железы, особенно при пальпаторно неопределяемых образованиях. Цифровая рентгенография (ЦРГ) макропрепаратов является современной заменой аналоговой РГ [11]. Учеными из Великобритании показано, что при ЦРГ по сравнению с РГ статистически значимо лучше различимы микрокальцинаты, которые являются важным индикатором ложа опухоли после проведенной НАТ [12]. Гипотеза данной работы заключается в том, что применение ЦРГ при морфологическом исследовании послеоперационных образцов от больных РМЖ после проведенного НАТ способно повысить точность оценки степени патоморфологического регресса опухоли.
Цель настоящей работы — оптимизировать морфологическую оценку ответа опухоли на неоадъювантное лечение.
Материал и методы
Проведено ретро- и проспективное когортное исследование, выполненное на материале от 32 пациенток, проходивших лечение в Московском клиническом научном центре им. А.С. Логинова (МКНЦ) по поводу РМЖ за период с 2019 по 2020 г. Объектом исследования послужил операционный материал после НАТ. Исследование одобрено этическим комитетом МКНЦ. Определялись макроскопические параметры остаточной опухоли с применением ЦРГ и без нее. Для образцов ЦРГ применялась рентгеновская система визуализации PathVision Faxitron (digital X-Ray). Главным критерием включения послужила положительная клиническая динамика в ответ на лечение — уменьшение размеров или исчезновение опухолевого узла по данным пальпации. Проведен анализ динамики клинических характеристик. Сравнивались два метода исследования ложа опухоли. Определена диагностическая эффективность макроскопического исследования образцов молочной железы с применением ЦРГ.
Макроскопическое исследование операционного материала с применением ЦРГ
Образец доставлялся в лабораторию патоморфологии в течение 30 мин после операции строго в нативном виде. Сопроводительное направление на морфологическое исследование включало дозы и сроки НАТ, сведения о признаках клинического ответа на проведенное лечение, размерах и локализации первичной опухоли по данным пальпации и лучевых методов до начала лечения и после, данные о размещении металлического маркера и вовлечении лимфатических узлов до лечения. Морфологическое исследование начиналось с констатации факта соответствия доставленного материала и его маркировки сведениям, указанным в направлении.
Начальный этап макроскопического исследования и описания материала включал общеизвестный алгоритм:
1) правильная ориентация препарата;
2) окрашивание краев маркировочной гистологической краской;
3) определение размеров образца в трех плоскостях (ткань железы, лоскут кожи и регионарная клетчатка измерялись отдельно);
4) оценка состояния поверхности кожи, соска и ареолы (цвет, плотность, мацерация, втяжение, изъязвление и др.);
5) оценка состояния фасциального края;
6) идентификация хирургических меток при их наличии.
Рентгенография образца проводилась дважды. Первый раз — до разреза ткани молочной железы с целью точной идентификации металлической клипсы, имплантированной в ложе первичной опухоли до начала лечения, во избежание ее механического смещения (рис. 1, а). Второй раз — после разреза образца на серийных срезах толщиной 3—5 мм с целью исследования ложа опухоли оценивались расстояние до краев резекции, наличие/отсутствие микрокальцинатов и другие наиболее подозрительные участки с повышенной контрастностью (рис. 1, б).
Рис. 1. Рентгенография образца и цифровое картирование ложа опухоли.
а — образец до разреза ткани, идентификация ложа первичной опухоли и определение локализации металлической клипсы, имплантированной в опухоль до начала лечения; б — образец после разреза ткани на серийных срезах толщиной 3—5 мм, исследование ложа опухоли, измерение размеров (в мм2) наибольшей площади плоскости поперечного сечения ложа, оценка расстояния (в мм) до краев резекции, идентификация микрокальцинатов и других подозрительных участков с повышенной контрастностью; в — радиографическая оценка и цифровое картирование ложа опухоли; г — картирование и маркировка в соответствии с цифровым изображением для гистопатологического исследования.
Протокол последовательности запуска и основные принципы работы рентгеновской системы визуализации PathVision Faxitron
При работе с digital X-Ray важно соблюдать последовательность запуска системы, дать системе выполнить полную калибровку до начала использования.
Основные процедуры визуализации включали:
1) размещение образца внутри установки;
2) выбор и введение данных пациента в программное обеспечение;
3) запуск системы;
4) появление изображения (время, затраченное на генерацию изображения, составляет около 10 с);
5) выполнение необходимых измерений, нанесение дополнительных разметок;
6) сохранение файла цифровой карты в формате DICOM.
Для определения ложа первичной остаточной опухоли при макроскопическом исследовании проводили измерение (в мм) в трех проекциях, также определяли два наибольших размера плоскости поперечного сечения. При ЦРГ оценивались размеры наибольшей площади (в мм2) плоскости поперечного сечения ложа, расстояние (в мм) до краев резекции, микрокальцинаты и другие подозрительные участки с повышенной контрастностью. Проводились радиографическая оценка и цифровое картирование ложа опухоли для дальнейшего сопоставления с гистологическими препаратами. Файл цифровой карты для патоморфолога сохранялся в формате DICOM. Изображения макропрепаратов служили картой для описания макроскопического исследования и локализации каждого среза ткани для гистопатологического исследования (рис. 1, в). Однако при значительной площади поражения точно реконструировать пластину микропрепаратов было крайне сложно. Поэтому дополнительно проводили маркировку гистологическими красителями соответствующих по цвету краев стыковки фрагментов ложа до их помещения в гистологическую кассету. Для планового микроскопического исследования тотально использовалось ложе опухоли, проводилось картирование в соответствии с цифровым изображением выбранных срезов, маркировка выполнялась слева—направо, сверху—вниз (рис. 1, г).
Основная информация, которая была получена после макроскопического и микроскопического исследований, — это точная пространственная оценка остаточного инвазивного рака, доля компонента злокачественной опухоли in situ, наличие инвазии лимфатических и кровеносных сосудов, статус краев резекции. Основная информация, полученная при оценке регионарных лимфатических узлов, — общее количество лимфатических узлов, число лимфатических узлов с метастазами и размер наибольшего метастаза. Затем проводился расчет индекса регресса опухоли по формуле RCB:
:
;
где d1, d2 — микроскопические размеры ложа опухоли, dprim — наибольшая площадь плоскости поперечного сечения ложа первичной опухоли;
— выраженность инвазивного компонента, рассчитанная на основании процента карциномы in situ (CIS) инвазивного рака (CA) в опухоли; LD — число лимфатических узлов с метастазами; dmet — наибольший диаметр метастаза в лимфатическом узле.
Опухолевое ложе было исследовано полностью на нескольких серийных срезах (метод 1) и на одном срезе максимальной плоскости поперечного сечения опухолевого ложа (метод 2). Для оценки согласия между методами рассчитан коэффициент каппа Коэна.
Статистический анализ и визуализация полученных данных проводились с использованием среды для статистических вычислений R 4.1.0 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия). Для сравнения количественных переменных между группами пациенток использовался тест Манна—Уитни, для сравнения связанных выборок — тест Уилкоксона, для оценки динамики бинарных переменных — тест Макнемара. Для сравнения ранговых переменных использовались смешанные модели с кумулятивной функцией связи. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Для изучения связи категориальных переменных использовался точный тест Фишера, ассоциацию считали статистически значимой при p<0,05. Для оценки связи между количественными переменными использовался коэффициент ранговой корреляции (ρ) Спирмена с соответствующим 95% доверительным интервалом, между ранговыми переменными — коэффициент корреляции τB Кендалла с соответствующим 95% доверительным интервалом. Диагностические характеристики методов оценивались с использованием точности, чувствительности и специфичности (с соответствующими точными 95% доверительными интервалами).
Результаты
В исследование было включено 32 женщины, больных РМЖ. Средний возраст пациенток составил 52,5 (9,4) года, медианный возраст — 52,0 (46,5—58,2) года. У 19 (59,4%) пациенток опухоль локализовалась с правой стороны, у 13 (40,6%) — с левой. На рис. 2 представлена клиническая стадия (cTNM) РМЖ. Длительность заболевания до операции составила до 6 мес в 7 (21,9%) случаях, от 6 мес до 1 года — в 23 (71,9%) и от 1 года до 3 лет — в 2 (6,2%) случаях. В результате микроскопического исследования инвазивный протоковый рак был диагностирован в большинстве случаев (29, или 90,6%), кроме того, были выявлены единичные случаи инвазивного долькового и микропапиллярного рака. Уровень злокачественности по Ноттингемской системе (NGS) до проведения НАТ была определена как III степень у 10 (31,2%) пациенток, II степень у 20 (62,5%) и I степень у 2 (6,2%).
Рис. 2. Распределение пациенток по клиническим стадиям рака молочной железы.
По данным ультразвукового исследования (УЗИ), у 26 (81,2%) пациенток отмечено уменьшение опухолевого узла, исчезновение узла наблюдалось у 4 (12,5%) пациенток, у 2 женщин не выявлено существенной положительной динамики после лечения или наблюдалось увеличение узла. По данным маммографии (ММГ), у 29 (93,5%) пациенток диагностировано уменьшение узла, у 2 женщин не выявлено существенной положительной динамики после лечения или установлено увеличение узла. Данные ММГ в отношении признаков регресса опухоли сильнее коррелировали с клиническими данными при пальпации (τB = 0,79 [95% ДИ: 0,32; 1], p<0,0001) по сравнению с данными УЗИ (τB=0,51 [95% ДИ: 0,12; 0,91], p=0,0032), корреляция результатов инструментальных методов составила 0,66 ([95% ДИ: 0,28; 1], p=0,0002).
Анализ динамики клинических характеристик
До проведения НАТ опухолевые узлы локализовались чаще всего в верхненаружном квадранте (ВНК) — 20, или 62,5% случаев, реже в нижневнутреннем квадранте (НВК) — 4, или 12,5%, верхневнутреннем квадранте (ВВК) — 2, или 6,2% случаев и в области границы наружных квадрантов — 2, или 6,2%, отмечены единичные случаи локализации в области границы внутренних, верхних и нижних квадрантов, а также 1 случай субареолярной локализации. После проведенной терапии в 3 (9,4%) случаях отмечено изменение локализации опухолевого узла (рис. 3, а). Унифокальные узлы выявлены у большинства пациенток (30, или 93,8%). Наибольший размер узла, по данным ММГ, до проведения химиотерапии в среднем составлял 3,4 (1,4) см, медианный наибольший размер — 2,8 (2,6—4,1) см, после НАТ средний наибольший размер узла был 2,5 (2,0) см, медианный — 2,0 (1,3—3,1) см, таким образом, наблюдалась статистически значимая динамика (p=0,0002) в отношении размеров узла (рис. 3, б, в). При анализе данных УЗИ отмечены систематически меньшие оценки наибольших размеров узла после НАТ (p<0,0001). Так, наибольший размер узла составлял 2,0 (1,9) см, медианное значение — 1,6 (1,0—2,2) см. Тем не менее наблюдалась сильная ранговая корреляция размеров узла на основании данных, полученных с помощью УЗИ и ММГ (ρ=0,83 [95% ДИ: 0,65; 0,92], p<0,0001) (рис. 3, г).
Рис. 3. Динамика локализации и размеров опухолевого узла.
а — локализация опухолевого узла; б — наибольший размер опухолевого узла; в 3 (9,4%) случаях ММГ не выявило узла (отмечено синим); в — размеры узла; г — анализ ассоциации размеров узла, полученных с помощью инструментальных методов исследования.
Кальцинаты в опухолевом узле до проведения НАТ наблюдались у 15 (46,87%) из 32 женщин, после проведения НАТ — у 27 (84,375%) из 32.
Среднее количество исследованных лимфатических узлов составило 14 (12—18). Средняя длина наибольшего метастаза 1,55 (2,98) см. Средний наибольший размер послеоперационного образца молочной железы был 19,4 (6,1) см, медианный — 20,0 (16,4—23,0) см. Средний наибольший размер послеоперационного образца регионарной клетчатки 8,8 (2,3) см, медианный — 9,0 (7,4—10,0) см. Средний наибольший размер послеоперационного образца регионарной клетчатки подключичной области был 2,4 (1,3) см, медианный — 2,5 (1,0—3,0) см. По результатам определения металлического маркера точность макроскопии составила 84,4% (95% ДИ: 67,2—94,7), чувствительность — 0,0%, специфичность — 100,0% (87,2—100,0). Точность ЦРГ была 90,6% (75,0—98,0%), чувствительность — 80,0% (28,4—99,5%), специфичность — 92,6% (75,7—99,1%). При анализе результатов макроскопической оценки ложа опухоли нечеткие размеры ложа при макроскопии определялись в 25 (78,1%) случаях, четкие — в 7 (21,9%). При ЦРГ серийных слайсов ложа опухоли нечеткие границы (контрастные фокальные участки) выявлены только в 1 случае, микрокальцинаты определялись в 29 (90,6%) случаях.
Размеры ложа опухоли, определяемые макроскопически (средний максимальный размер 6,1 (3,3) см, медианный — 5,2 (3,4—8,0) см) и при использовании ЦРГ (средний максимальный размер 4,8 (2,6) см, медианный — 4,1 (2,7—6,2) см), имели статистически значимые различия (p<0,0001) (рис. 4, а). В большинстве случаев (31 (96,9%) из 32) при ЦРГ определялись четкие границы и размеры ложа опухоли, в то время как при макроскопии (в 25 (78,1%) из 32 случаев) выявлялись нечеткие границы и размеры (p<0,0001) (рис. 4, б). Точность макроскопического определения кальцинатов по отношению к обзорной ЦРГ составила 93,8% (79,2—99,2%). Установка металлического маркера в опухоль до начала лечения производилась в 14 (43,75%) случаях. В 14/14 случаях при обзорной ЦРГ время идентификации металлической клипсы составило до 10 с. Средний наибольший размер ложа опухоли на разрезе 6,1 (3,3) см, медианный — 5,2 (3,4—8,0) см. Медианный размер наибольшей площади плоскости поперечного сечения опухоли был 183,0 (0,0—781,2) мм2.
Рис. 4. Характеристики ложа опухоли, определяемые макроскопически и при использовании ЦРГ.
а — размеры ложа опухоли; б — характеристика границы и размеров ложа опухоли.
Среднее количество гистологических блоков при методе 1 было 17, при методе 2—8 и имело статистически значимые различия (p<0,0001). Медианное количество гистологических блоков при методе 1 составило 18 (13,5—20), при методе 2—8 (6—8,5) и также имело статистически значимые различия (p<0,0001). Патоморфологический полный ответ (pCR) был определен методом 2 в 13 (40,63%) случаях, из которых с помощью метода 1 было зафиксировано 12 (37,5%) случаев, в пропущенном при использовании метода 2 случае при методе 1 был зафиксирован класс RCB-I. Совпадение двух методов составило 96,9%. Значение каппы Коэна было 0,95 (p<0,0001), что свидетельствовало о хорошей корреляции с методом 1.
Обсуждение
Морфологическое исследование является неотъемлемой частью проведения клинических испытаний эффективности лекарственных препаратов. Для обеспечения методологической строгости в исследованиях, требующих оценки ответа опухоли на неоадъювантное лекарственное лечение, и для достоверной оценки результатов все больше признается необходимым участие патоморфологов на ранних этапах планирования исследования. Тем не менее это не всегда так. Уровень участия патоморфологов на этапе проектирования и организации клинических испытаний низкий, и это приводит к тому, что важные особенности, такие как стандартизация обработки и оценки патологических образцов часто упускаются из виду. Отсутствие стандартизации параметров, связанных с патоморфологической оценкой ответа опухоли на лечение, может иметь серьезные последствия, приводя к вводящим в заблуждение результатам и напрасной трате ресурсов, а также потенциально может нанести вред здоровью пациенток [13—16].
В проведенном исследовании большое внимание уделялось преаналитическому этапу обработки послеоперационных образцов. Включенные в исследование пациентки (8, или 25%) являлись участницами международного рандомизированного клинического испытания III фазы. Необходимо подчеркнуть, что в руководстве клинического испытания для патологов требовалось идентифицировать ложе опухоли на нативном образце. Пространственная оценка остаточного ложа опухоли — это наиболее сложная при визуальном осмотре и пальпации задача, так как размеры и границы ложа опухоли трудно точно оценить при выраженном регрессе. В результате проведенного исследования показано, что применение ЦРГ облегчило морфологическую идентификацию металлического маркера, имплантированного в ложе опухоли, и микрокальцинатов, улучшилась видимость границы опухолевого ложа, что важно для дальнейшей объективной оценки класса остаточной опухолевой нагрузки.
Важно отметить, что идентификация микрокальцинатов в макропрепарате молочной железы выступает в качестве важного параметра, так как микрокальцинаты являются индикатором карциномы in situ (CIS) и ложа опухоли в образцах после НАТ. В проведенном исследовании во время ЦРГ микрокальцинаты выявлены в 90,6% случаев, что позволило с большой вероятностью идентифицировать ложе опухоли. Четкие контуры опухолевого ложа не определены при ЦРГ лишь в 1 случае при микропапиллярном варианте рака, однако с помощью ЦРГ в образце удалось идентифицировать зону микрокальцинатов, представленную на микроскопии множественными опухолевыми эмболами в лимфатических капиллярах. Такая морфологическая находка не позволила установить pCR и дала возможность подобрать оптимальный вариант адъювантного лечения.
После проведения терапии в части случаев отмечено изменение локализации опухолевого узла, кроме того, получены разные корреляции между данными пальпации, ММГ и УЗИ в отношении признаков регресса опухоли. Вышесказанное свидетельствует о том, что полученных входящих клинических данных о локализации ложа опухоли недостаточно. Кроме того, установка металлической клипсы в опухоль не всегда производится, а также может быть неэффективной в результате ее миграции или поломки. При использовании ЦРГ можно просто и быстро установить точную локализацию металлического маркера в образце и определить область, где следует произвести разрезы ткани во избежание механического смещения клипсы.
Исследование одного среза максимальной площади поперечного сечения опухолевого ложа при методе 2 позволило установить pCR с точностью 96,9%. В условиях ограниченных ресурсов и кадрового дефицита это может быть оптимальным вариантом вместо тотального исследования ложа первичной опухоли. Кроме того, метод 2 позволил снизить среднее количество исследованных микропрепаратов ложа опухоли, что сократило расходы на исследование и время врачей, затрачиваемые на подготовку медицинского заключения.
Выборка в исследовании составила 32 образца, что обусловлено сроками апробации цифрового оборудования и таким критерием включения, как выраженный клинический регресс (непальпируемая опухоль) в ответ на лечение. Авторам представляется перспективным проведение анализа радиогеномики (корреляции данных визуализации ЦРГ и молекулярно-биологических характеристик опухоли), но для решения данной задачи необходимо увеличение когорты и разделение пациенток на целевые группы по суррогатным молекулярным подтипам.
Регламентация использования рентгенографии при исследовании операционного материала молочной железы содержится в европейских рекомендациях по обеспечению квалифицированного скрининга и диагностики РМЖ и в клинических рекомендациях международного экспертного сообщества по РМЖ (BIG-NABCG). К сожалению, вышеописанные информационные источники не содержат описания методики использования цифрового рентгена при морфологическом исследовании [11].
По данным литературы, частой сферой применения ЦРГ является интраоперационное сканирование образцов хирургами-онкологами при секторальной резекции молочной железы. Проведенное исследование имеет большое теоретическое и практическое значение, потому что впервые в мире было произведено оригинальное целенаправленное изучение ЦРГ как метода, применяемого при морфологическом исследовании образцов молочной железы после неоадъювантной химиотерапии.
Заключение
Полученные результаты показали, что применение ЦРГ при морфологическом исследовании послеоперационных образцов от больных РМЖ после НАТ способно повысить точность оценки степени патоморфологического регресса опухоли не только при полном исследовании на нескольких серийных срезах (метод 1), но и на одном срезе максимальной плоскости поперечного сечения опухолевого ложа (метод 2). Хорошо известны успешные аналоги ЦРГ российского производства, что может способствовать внедрению данного метода в повседневную диагностическую практику широкого ряда лечебных учреждений на всей территории Российской Федерации.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — И.М. Тележникова, Г.Р. Сетдикова, Л.Г. Жукова
Сбор и обработка материала — И.М. Тележникова, Н.А. Максимов
Статистическая обработка данных — И.М. Тележникова
Написание текста — И.М. Тележникова.
Редактирование — Г.Р. Сетдикова, Л.Г. Жукова, С.Г. Хомерики, А.Б. Абдураимов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.