Способность клеток к направленной миграции и хемотаксису играет важную роль при репарации поврежденных тканей, она также важна для участия в таких процессах, как нейрогенез, ангиогенез и др. Множество патологических состояний, включая рак, атеросклероз и воспалительные реакции, связаны с нарушением клеточной подвижности и преимущественно с повышением миграционной активности клеток. В связи с этим изучение механизмов регуляции двигательной активности клеток и определение основных ее регуляторов являются важной задачей для понимания патофизиологии опухолевого роста.
Кальдесмон (CaD) — это актинсвязывающий белок, который впервые был выделен из мышц желудка курицы. Название произошло от комбинации двух слов: calmodulin и desmos, что в переводе с греческого означает «связывание», и было дано за способность белка связываться с кальмодулином в зависимости от концентрации кальция [1].
Основной функцией данного белка является способность регулировать сокращение гладких мышц путем ингибирования связывания актина и миозина [2]. Кроме того, отмечено его участие в образовании волокон стресса, подавлении образования подосом и инвадоподий, а также транспорте гранул внутри клеток [3—5]. Роль CaD в онкологической патологии требует дальнейшего изучения, но, несмотря на это, он уже рассматривается как потенциальный диагностический и терапевтический биомаркер при опухолевых заболеваниях [6].
Структура и функции белка кальдесмона
Данный белок имеет две изоформы: H-CaD (высокомолекулярный, 120—150 кДа) и L-CaD (низкомолекулярный 70—80 кДа). Первый вид встречается преимущественно в гладких мышцах, тогда как низкомолекулярный экспрессируется почти во всех видах клеток. Обе формы кодируются одним геном CALD1 (ENSG00000122786), расположенным в хромосоме 7q33 человека, благодаря альтернативному сплайсингу [7]. Несмотря на разницу в молекулярной массе, свойства этих двух изоформ схожи. Различие состоит в строении молекул: у CaD, встречающегося в немышечных клетках, отсутствует центральный домен, тогда как аминоконцевые и карбоксильные концевые участки присутствуют у обоих видов [4, 8].
N-конец имеет один миозинсвязывающий и один кальмодулинсвязывающий сайты, карбоксильный конец содержит сайты связывания актина, а также сайты связывания кальмодулина и тропомиозина [4, 9]. Центральная область CaD гладкой мускулатуры имеет 9 или 10 повторов высокозаряженных остатков, которые образуют 35-наномикронный участок одноцепочечных α -спиралей [2, 4].
Основная функция CaD — регулирование сокращения гладких мышц, так как он способен ингибировать активность АТФазы актомиозина путем связывания с Ca2+/кальмодулином, а также фосфорилирования, препятствуя или блокируя взаимодействия актина и миозина [7, 10].
CaD способен связываться с F-актином как в присутствии кальция, так и в его отсутствие. В то же время в зависимости от концентрации Ca2+ белок проявляет альтернативную способность связывания либо с кальмодулиновыми, либо с актиновыми нитями в условиях in vitro. CaD связывается с актиновыми нитями при менее чем 1 мкмоль свободного Ca2+, тогда как при более высокой концентрации кальция более 1 мкмоля белок образует комплекс с кальмодулином, активированным Ca2+, и этот комплекс освобождается от актиновых нитей (рис. 1) [1].
Рис. 1. Модель контроля Ca2+/кальмодулином ингибирующей активности кальдесмона (CaD).
Два сайта молекулы CaD, связывающих актин, занимают сайты слабого связывания миозина с актином, тем самым ингибируя взаимодействие актин-миозин. В присутствии Ca2+ кальмодулин связывается с CaD, это вызывает выпрямление его C-конца и отделение от актина; сайты слабого связывания миозина на актине открываются, ингибирующая активность CaD отменяется [модифицировано по 1].
Способность H-CaD стерически блокировать взаимодействия актомиозина в состоянии покоя, чтобы модулировать развитие сокращения, предполагает его участие в нарушении моторики гладкой мускулатуры, которая является основной причиной нарушения моторики желудочно-кишечного тракта [11]. При фосфорилировании H-CaD активированной киназой (ERK), регулируемой внеклеточными сигналами, C-концевая часть белка отделялась от актина, в результате чего происходило сокращение мышц [12].
При связывании CaD с миозином N-концевая область CaD смещает равновесие в сторону конфигурации heads-up, тем самым «активируя» головку миозина как и при фосфорилировании миозина, когда он претерпевает конформационные изменения и принимает расширенную форму 6S (рис. 2). CaD способствует сборке нитей нефосфорилированного миозина, когда он остается растворимым [10]. Одновременное связывание CaD как с актином, так и с миозином может быть причиной явления «защелки», известного для гладких мышц тонического типа [13].
Рис. 2. Модель, изображающая как кальдесмон (CaD) может изменять конфигурацию миозина.
Тяжелые цепи миозина гладких мышц (оранжевые) меняют свою конформацию при фосфорилировании (красные точки) в легких цепях (желтые) от удлиненной (6S) до компактной (10S) конфигурации. Связывание N-концевого домена CaD (синий) с S2-областью миозина препятствует взаимодействию головка-стержень и сдвигает конформацию миозина в форму 6S [модифицировано по 11].
Многие исследования показывают, что функция CaD in vivo может быть как ингибирующей для активного напряжения, так и поддерживающей пассивное напряжение [14, 15]. В немышечных клетках CaD также играет роль регулирования клеточного напряжения [16].
Исследования показали, что при повышенной экспрессии CaD в клетках немышечного типа увеличивается образование волокон стресса и снижается подвижность клеток, при уменьшении экспрессии волокна стресса исчезают [3, 17, 18]. CaD необходим для образования толстых волокон стресса, так как его связывание с F-актином защищает нити от факторов, разрушающих актин, таких как гелсолин и кофилин, а также обеспечивает устойчивость толстых нитей к действию цитохолазина B [3].
При исследовании клеточной линии аденокарциномы легкого человека было показано, что глюкокортикоидзависимая (GC-зависимая) регуляция CaD увеличивает образование толстых стрессовых волокон и очаговых спаек, подавляющих миграцию клеток [3, 19]. Также GC-индуцированная регуляция CaD задерживает миграцию нейронов во время развития неокортикальных клеток. Избыточное воздействие GC замедляет миграцию клеток-предшественников нейронов (NPC) из-за дисрегуляции взаимодействий актина и миозина через регуляцию CaD [4, 20].
Кроме того, CaD также участвует в регуляции секреции и внутриклеточном движении гранул кальцийзависимым образом. Данный белок регулирует организацию актиновых нитей в клетке во время секреторного процесса [21], участвует в гонадотропин-рилизинг-гормонстимулированном высвобождении гонадотропина из гипофиза [22]. Также CaD влияет на внутриклеточное движение гранул, регулируя сократительную систему в ответ на изменения концентрации Ca2+ в клетках немышечного типа [5].
Посттрансляционная модификация CaD, к которой относится фосфорилирование, может изменять функцию данного белка. Например, фосфорилирование (Thr-627, Ser-631, Ser-635 и Ser-642) может как ослаблять ингибирующую активность CaD, так и косвенно повышать его ингибирующую активность за счет ослабления связывания с Ca2+/кальмодулином, при этом влияние Ca2+/кальмодулина на активность CaD зависит от комбинации фосфорилированных остатков [23].
Фосфорилирование некоторыми киназами, такими как ERK, может отменить ингибирование CaD при сокращении гладкой мускулатуры [24, 25]. Было показано, что фосфорилирование CaD, опосредованное ERK, изменяет способность актинсвязывающего фрагмента белка стабилизировать актиновые нити, при этом CaD частично диссоциируется от актина [25, 26]. Такое структурное изменение в H-CaD освобождает сайты связывания миозина на поверхности актина, благодаря чему в гладких мышцах образуются актомиозиновые комплексы [26].
Фосфорилирование CaD Р21-активируемой киназой (PAK) уменьшает его способность связывать кальмодулин в 10 раз, также снижается сродство к актин-тропомиозину и ингибирование активности АТФазы актомиозина [4]. В случае фосфорилирования CaD циклинзависимой киназой 2 (CDC2) (во время митоза) снижается сродство белка к актиновым нитям [27].
При фосфорилировании CaD онкогенной v-ErbB (ген вируса эритробластоза птиц) тирозинкиназой увеличивается его связывание с белком-адаптером сигнала Grb2 (белок, связанный с рецептором фактора роста 2), что способствует образованию сигнального комплекса, связанного с трансформацией, а это, свою очередь, приводит к разборке волокон при стрессе, пролиферации клеток и трансформации [24].
Изменение L-CaD ослабляет стабильность актиновой нити и облегчает ее разборку [27]. CaD фосфорилируется ERK во время образования подосом, что отменяет ингибирующее действие белка на Arp2/3-опосредованную полимеризацию актина [25].
Кальдесмон — возможный биомаркер опухолей
Большое число исследований по изменению уровня экспрессии CaD при разных типах опухолей показало, что в большинстве случаев в них наблюдается повышенная экспрессия CaD. Однако так происходит не всегда, например, в злокачественных меланомах по сравнению с доброкачественными меланоцитарными опухолями и с нормальными тканями наблюдается пониженная экспрессия данного белка [28].
Исследования показывают, что H-CaD является высокочувствительным и специфичным маркером, позволяющим отличать стромальные опухоли эндометрия от эпителиальных новообразований матки. Экспрессия H-CaD отсутствует в нормальной строме эндометрия и стромальных новообразованиях эндометрия [29].
Кроме миогенных опухолей данный белок может экспрессироваться также в стромальных опухолях желудочно-кишечного тракта, злокачественных мезотелиомах плевры и гранулезоклеточных опухолях яичников, поэтому экспрессия H-CaD не может быть единственным доказательством миогенной дифференцировки [30].
Высокомолекулярная изоформа данного белка — специфический маркер хорошо дифференцированных гладкомышечных опухолей — может быть полезна для дифференцировки опухолей гладкой мускулатуры от опухолей с миофибробластической дифференцировкой, саркомы стромы эндометрия, рабдомиосаркомы, опухоли оболочки периферического нерва и остеосаркомы. Исследования показали, что миофибробластические опухоли не экспрессируют данный маркер [31].
Кроме того, H-CaD не экспрессируется в неопластических миоэпителиальных клетках смешанных опухолей кожи и слюнных желез, однако экспрессия данной молекулы наблюдается в нормальных миоэпителиальных клетках [31].
При исследовании H-CaD как маркера для дифференциальной диагностики эпителиоидной мезотелиомы и аденокарциномы легких была выявлена реактивность на H-CaD в 97% эпителиальных мезотелиом. При этом иммунореактивность к этому белку не была обнаружена ни в одном случае аденокарциномы. Это может быть показателем того, что H-CaD является высокочувствительным и специфичным маркером клеточной дифференцировки [32].
Снижение экспрессии CaD обнаружено в метастатических клетках лимфатических узлов рака желудка, где потеря экспрессии белка может быть связана с прогрессированием метастазирования рака желудка [33]. После снижения экспрессии L-CaD в клетках рака предстательной железы обнаружено двукратное увеличение способности к миграции и трехкратное увеличение способности к инвазии [34].
При исследовании кровеносных сосудов меланомы обнаружено, что уровень экспрессии H-CaD обратно пропорционален частоте метастазирования. В гладких мышцах сосудов содержится как H-CaD, так и L-CaD, при этом H-CaD является наиболее специфичным и чувствительным маркером для обнаружения метастазов [35, 36].
Изучение линии клеток рака толстой кишки человека показало, что L-CaD может снижать восприимчивость раковых клеток к химиолучевой терапии [6].
Миофибросаркомы могут экспрессировать гладкомышечный актин и кальпонин и в редких случаях десмин, но в большинстве опухолей отсутствует H-CaD [37, 38]. Кальпонин является чувствительным, но не специфичным маркером миофибробластов. Фокальная экспрессия H-CaD обнаруживается в редких случаях. Изучение экспрессии обоих белков помогает исключить лейомиосаркому, при которой обычно выявляются H-CaD и кальпонин [38, 39].
Кроме того, L-CaD также считается потенциальным сывороточным маркером глиомы. Уровень L-CaD в сыворотке крови является хорошим предиктором и используется для дифференцировки пациентов с глиомой и другими внутричерепными опухолями [40].
Было выявлено, что у пациентов с глиомой уровень белка L-CaD в сыворотке крови значительно повышен по сравнению с контрольной группой [41]. Отмечена положительная корреляция между экспрессией CaD и степенью патологии глиом. Кроме того, случаи с более высокой экспрессией белка демонстрировали худшие клинические результаты, чем те, где выявлена более низкая экспрессия CaD [41].
Исследования показали, что на экспрессию данного белка оказывает влияние аномальный сплайсинг гена CALD1 человека в сосудистой сети глиомы, который приводит к усилению регуляции L-CaD [42]. Повышенная экспрессия L-CaD способствует прогрессированию глиомы, усиливая ангиогенез опухоли, а также инфильтрацию иммуноцитов [41].
Кроме того, была показана связь между сверхэкспрессией данного белка и активацией подвижности эндотелиальных клеток, которая является показателем прогрессирования опухоли, связанного с неоваскуляризацией [40]. Было выявлено, что L-CaD играет критическую роль в ангиогенезе и онкогенном процессе глиомы, и данный белок участвует в онкогенных сигнальных путях [41].
Исследования показали, что высокая экспрессия CaD коррелирует с ростом миграции опухолевых клеток, обеспечиваемой сигнальным путем фактора роста эндотелия сосудов. CaD также участвует в регуляции сборки межклеточных плотных соединений, морфогенезе эндотелия кровеносных сосудов, клеточном ответе на повышение концентрации оксида азота. Кроме того, обнаружены данные о том, что повышенная экспрессия белка CaD активирует сигнальные пути p53 и JAK/STAT, непосредственно участвующих в делении, гибели клеток и образовании опухолей [41].
Отмечается, что необходимы дальнейшие исследования для проверки возможной роли L-CaD как диагностического маркера глиомы и использования данного белка при мониторинге опухоли во время лечения [40].
Изучение экспрессии CaD при раке мочевого пузыря показало влияние этого белка на экспрессию лиганда запрограммированной гибели клеток (PD-L1), принимающего участие в иммунной активности. Так, множественные типы солидных опухолей создают иммуносупрессивное микроокружение опухоли и избегают цитолиза Т-клетками за счет экспрессии PD-L1 [43]. Кроме того, сверхэкспрессия PD-L1 при раковых опухолях различной локализации ассоциируется с неблагоприятными клиническими исходами [44].
В процессе клеточной трансформации и онкогенеза повышенная регуляция PD-L1 аномальными сигнальными путями или генными мутациями ослабляет активность иммунных клеток, тем самым позволяя опухолевым клеткам уклоняться от иммунного ответа, и повышает их выживаемость и метастатический потенциал. Активация пути JAK/STAT является распространенным явлением при раке мочевого пузыря и способствует клеточной пролиферации и подвижности [43, 45]. Активация данного пути может стимулировать экспрессию PD-L1 [46]. Как уже упоминалось выше, CaD способен активировать сигнальный путь JAK/STAT, что в последствии приводит к повышенной экспрессии PD-L1 in vitro [43].
Имеются данные об использовании анти-PD-L1-терапии при различных видах рака, включая карциному легкого, лимфому Ходжкина, почечно-клеточный рак и рак мочевого пузыря. Также для повышения чувствительности и улучшения терапевтического эффекта в иммунотерапии рекомендуется использовать сочетание ингибиторов CaD с ингибиторами PD-L1 [43, 47].
Показано, что сверхэкспрессия CaD оказывает синергетическое действие на сократительную способность клеток сосудистых компонентов, повышая проницаемость микрососудов и тем самым способствуя экстравазации и миграции опухолевых клеток [48].
Еще одной функцией CaD является подавление образования подосом и инвадоподий в клетках гладких мышц, а также в трансформированных или раковых клетках. Уменьшение CaD приводит к увеличению образования многочисленных мелких подосом/инвадоподий, которые отличаются большей подвижностью. Сверхэкспрессия CaD, напротив, подавляет образование подосом, конкурируя с комплексом Arp2/3, который необходим для их формирования. Эти данные говорят о том, что CaD является мощным супрессором инвазии раковых клеток [4].
Активация p53 регулирует экспрессию CaD и подавляет образование опухолевых фенотипов [49], а также способствует стабильности актиновых волокон стресса и ослабляет миграцию клеток, опосредованную регуляцией CaD [21].
Заключение
Анализ данных литературы свидетельствует, что белок CaD обладает широким спектром действия и принимает непосредственное участие в таких процессах, как регуляция подвижности и миграции клеток, цитокинез и секреция, а также сокращение гладкой мускулатуры.
CaD регулирует организацию актинового цитоскелета и сократительную способность миоцитов, участвует во внутриклеточном транспорте. Функции CaD контролируются связыванием Ca2+/кальмодулином, а также фосфорилированием.
CaD принимает важное участие в патогенезе опухолевого роста. Необходимо проведение дальнейших исследований роли белка CaD в развитии онкологической патологии, которые будут способствовать разработке CaD как нового диагностического и таргетного терапевтического биомаркера для оптимизации диагностики и терапии злокачественных новообразований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.