Введение

Флуоресцентная визуализация на основе генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров является одним из динамично развивающихся направлений молекулярного имиджинга [1]. Экспрессия генетически кодируемых сенсоров представляет собой управляемый процесс, который может быть адаптирован под конкретные задачи исследователей, в частности для диагностики и терапии рака. Несмотря на успехи, широкое применение методов имиджинга, основанного на генетически кодируемых сенсорах, ассоциировано с рядом ограничений [1].

Для молекулярной визуализации воспаления и стадий канцерогенеза в реальном времени (in vivo и in vitro) применяют генетически кодируемые флуоресцентные белки и сенсоры на их основе [1]. Лентивирусные векторы высоко специфичны в отношении генетических конструкций. Кроме того, они обладают способностью к самоинактивации, что обеспечивает дополнительную безопасность. Титр лентивирусного вектора и оптимизация векторных плазмид определяет последующую эффективность трансфекции [2]. Качество/продуктивность/результативность трансдукции варьируется в зависимости от емкости генетической встройки и от молекулярной природы клеток-мишеней [3, 4], вследствие чего процесс получения трансдуктантов может быть разделен на два подхода. Один из подходов включает в себя сортировку субклонов, обладающих высоким уровнем экспрессии целевого белка [5]. Второй подход подразумевает сохранение исходной клеточной гетерогенности [6]. Очевидно, что при имплнтации in vivo гетерогенных клеточных субпопуляций уровень экспрессии нтрепортерного белка (трансгена) непосредственно влияет на процесс визуализации. Однако неоднородность распределения, равно как и избыточность экспрессии, могут негативно влиять на качество визуализируемых объектов и высокую вариативность данных. Также стоит отметить низкий выход флуоресценции в биологических тканях, который обусловлен рядом факторов, включая рассеяние света и низкую оптическую прозрачность этих тканей [7]. В связи с этим сталкиваются с дилеммой отбора высокофлуоресцирующих популяций клеток или продолжения работы с гетерогенной флуоресцирующей культурой, которая быстро вырождается. Важным вопросом является сохранение свойств исходной клеточной линии [8]. Отбор субклонов еще в большей степени подвергает дополнительной эволюции фенотип и генотип, особенно раковые клетки, характеризующиеся множественными трансформациями на уровне мРНК и белков [8].

Ранее в одной из работ мы использовали гетерогенные флуоресцентные линии Hep2-TagRFP для формирования подкожных ксенографтов in vitro [6]. Эти линии трансфицированы при помощи лентивирусных векторов с коэффициентом эффективности 70–90%. Для неинвазивной визуализации активности каспазы-3, формировали in vivo подкожные опухолевые ксенографты, экспрессирующие сенсор каспазы, и ксенографты Hep2-TagRFP [6]. В ходе исследования отмечено, что длительное культивирование гетерогенных субклонов приводило к истощению флуоресцирующих клеток в популяции [6].

В рамках данного исследования поставлены следующие задачи: изучить уровни экспрессии трансгена (флуоресцирующего белка TagRFP) в клетках Hep2-TagRFP и ее субклонах, описать их морфологию и сравнить фенотипические свойства с исходной гетерогенной клеточной культурой.

Материал и методы

Культивирование опухолевых клеток

Опухолевые клетки аденокарциномы гортани Hep-2 (АТСС, РКК) культивировали в среде DMEM (ООО НПП «ПанЭко», Россия), содержащей L-глутамин, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Франция), антибиотики пенициллин-стрептомицин (ООО НПП «ПанЭко», Россия) в инкубаторе с поддержанием температуры 37 и 5% CO₂. Замену культуральной среды проводили раз в сутки. Для диссоциации использовали раствор 0,05% трипсин-ЭДТА (ООО НПП «ПанЭко», Россия). Подсчет количества клеток проводили с применением камеры Горяева.

Получение гетерогенных субклонов Hep2-TaqRFP

Трансдукцию осуществляли с помощью лентивирусных частиц pLVT—TagRFP (ЗАО «Евроген», Россия). Клетки Hep-2 высевали в 6-луночные планшеты в плотности 2·10⁴ клеток на лунку согласно протоколу производителя (ЗАО «Евроген», Россия). После прикрепления клеток вносили лентивирусные частицы. Спустя 48 ч проводили визуальную оценку при помощи инвертированного флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse TE200-U (Япония).

Клонирование и селекция трансдуцированных клеточных линий

Клонирование осуществляли методом предельных разведений в 96-луночных планшетах в среде DMEM:F12 (ООО НПП «ПанЭко», Россия), содержащей 10% фетальной сыворотки и 30% кондиционной среды. Полученные флуоресцирующие субклоны культивировали до 7—8 пассажа, контролируя стабильность флуоресцентного сигнала. Интенсивность флуоресценции оценивали с помощью программы NIH Image (NIH, США).

MTT-тест

Клетки высевали на 96-луночные планшеты (5·10⁴ клеток на лунку) за 48 ч до проведения теста. Затем среду меняли на среду DMEM без фетальной сыворотки (200 мкл). Далее вносили по 20 мкл 0,5% раствора 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолия бромида, растворенного в растворе DPBS, и инкубировали 2 ч при температуре 37 °C. Затем отбирали среду, однократно отмывали буфером DPBS, после чего вносили в лунки по 100 мкл DMSO. Затем встряхивали планшеты на ротационном шейкере 5 мин при комнатной температуре. В качестве нулевого уровня для планшетного сканера были использованы 3 лунки 96-луночного планшета, содержащие среду (200 мкл) и МТТ (20 мкл), а далее DMSO (100 мкл), но не содержащие клеток, и 1 лунку, не содержащую среду и МТТ, но содержащую DMSO (100 мкл). Окрашивание детектировали на многоканальном микропланшетном ридере CLARIOstar Plus (BMG LABTECH, ФРГ) при 570 нм (референтная длина волны — 650 нм). Эксперимент повторили 6 раз на 1, 3, 5, 7-е сутки соответственно.

Синхронизация клеток двойным тимидиновым блоком

Клетки высевали в 6-луночные планшеты в количестве 5·10⁵—1·10⁶ клеток на лунку, содержащей 2 мл полной среды DMEM и инкубировали в течение суток. Далее добавляли раствор тимидина в DPBS до конечной концентрации 2 мМ и культивировали в течение 18 ч. Затем удаляли тимидин с помощью промывания в 2 мл раствора DPBS и вносили по 2 мл культуральной среды и проводили повторную инкубацию в течение 9 ч. По истечении времени повторно вносили тимидин до конечной концентрации 2 мМ и культивировали еще 18 ч для синхронизации клеток на границе G1/S фаз.

Анализ клеточного цикла

Синхронизированные клетки на 6-луночных планшетах диссоциировали через каждые 4 ч на протяжении 28 ч (0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 ч). Клеточный осадок переносили в пробирки с 10 мл DPBS и центрифугировали 2 мин при 1200—1300 об/мин при комнатной температуре. К осадку добавляли 263 мкл DPBS и 737 мкл 95% этанола, тщательно ресуспендировали и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Фиксированные образцы центрифугировали 6 мин при 800 об/мин. К осадку клеток добавляли 0,3 мл буфера DPBS, содержащего 200х Cyber Green, 100 мкг/мл RNAse A. Инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Измерение флуоресценции клеток производили на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter Life Sciences, США). После измерения всех образцов сохраняли файлы FCS. Обработку результатов проводили при помощи программного обеспечения CytExpert 2.4.

Синтез первой цепи комплементарной ДНК (кДНК). Синтез кДНК осуществляли с помощью набора MMLV RT KIT (ЗАО «Евроген», Россия) согласно протоколу производителя. На реакцию брали 1 мкг РНК.

Геноспецифические праймеры. Подбор праймеров для генов-кандидатов эндогенного контроля проводили и на основе нуклеотидных последовательностей из GenBank: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH, NM_002046.7), бета-актин (ACTB, NM_001101.5), тубулин-бета III (TUBB3, NM_006086.4) и флуоресцентного белка TaqRFP. Для осуществления количественного анализа с использованием метода qPCR была составлена таблица с перечнем всех праймеров, которые были применены в исследованиях (табл. 1). Эти праймеры были разработаны с учетом специфичности к целевым генам, а также оптимизированы для достижения максимальной эффективности и точности в амплификации. Продукты амплификации были очищены и секвенированы по методу Сэнгера.

Таблица 1. Праймеры, использованные для количественной ОТ-ПЦР

Специфичность праймеров. Однородность продукта определяли по кривым плавления. Эффективность амплификации определяли серией 10-кратных разведений кДНК по тангенсу угла наклона линии тренда (табл. 2).

Таблица 2. Характеристика реакции амплификации исследованных генов

E=10^{—1/коэффициент наклона калибровочной кривой,}

где Е — эффективность ПЦР.

Выбор гена эндогенного контроля. Выбор оптимального гена эндогенного контроля был осуществлен с использованием программного обеспечения BestKeeper Software, позволяющего сопоставить наиболее стабильные референсные гены на основе значений пороговых циклов амплификации Ct (табл. 3), с учетом эффективности каждой реакции, рассчитанной по формуле [9]. Множественный корреляционный анализ Пирсона (coeff. of corr. [r]) с оценкой p-value, выявил, что для изучения экспрессии генов в различных условиях в качестве гена эндогенного контроля подходит ген GAPDH (coeff. of corr. [r]=0,919 и p-value =0,001).

Таблица 3. Описательная статистика генов-кандидатов эндогенного контроля на основе их значений Ct*

Примечание. * – значения рассчитаны из 12 экспериментов.

Количественная ПЦР в реальном времени

Реакцию амплификации проводили с использованием готовой смеси для ПЦР qPCRmix-HS SYBR+ROX (ЗАО «Евроген», Россия) согласно инструкции производителя. В реакционную смесь объемом 20 мкл вносили 50 нг кДНК и геноспецифические праймеры (см. табл. 1) в концентрациях 0,2—0,4 мкМ (концентрацию оптимизировали для каждой пары). Программа амплификации: 5 мин при 95 °C, 45 циклов (95 °C 15 с, 58 °C 20 с, 72 °C 30 с), и плавление продукта реакции (Melting Curve program: 70—95 °C, +1 °C/с). Реакции проводили в тройной повторности на 48-луночных планшетах, для каждой ПЦР-смеси ставили негативный контроль (NTC). Значения Ct интересующего гена (мишень) нормализовали на референсный ген. Анализ данных qRT-PCR проводился с использованием сравнительного метода ΔCT [10]. Обработка результатов измерений осуществлялась с помощью программного обеспечения MS Office Excel и Origin Pro 2024 (OriginLab Corporation, США) с использованием t-критерия Стьюдента.

Оценка туморогенности субклонов

В работе использовали самок мышей линии Nude возраста 10—12 нед (НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН, Россия). Опухолевые клетки, трансдуцированные флуоресцентным белком TagRFP, вводили в область лопатки подкожно в количестве 6,5 млн, в 100 мкл холодного фосфатно-солевого буфера. Через 7 сут наблюдали формирование опухолевых узлов. Динамику роста опухоли оценивали на 7, 14, 20, 27-е сутки после трансплантации клеток. Объем опухоли вычисляли по формуле:

V=(W2·L)/2 мм³,

где V — объем опухоли, W — ширина опухоли, L — длина опухоли.

Измерение флуоресцентного сигнала в опухолях производили на установке для планарного имиджинга iBox (UVP, США), включающей темный бокс с автоматизированной платформой и каруселью с фильтрами для регистрации флуоресценции, источник освещения Biolite, оснащенный галогеновой лампой 150W и фильтрами для возбуждения флуоресценции. Анализ и обработку изображений проводили в программном обеспечении Launch Vision Work (UVP, США). Обработка результатов измерений осуществлялась с помощью программного обеспечения MS Office Excel с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Для успешного встраивания репортерных генов необходимы эффективные методы их доставки. Лентивирусная доставка используется для получения стабильных клеток-трансдуктантов для исследовательских задач и лекарственного скрининга, а также для масштабного производства рекомбинантных белков в клетках млекопитающих [11]. Интеграция лентивирусных векторов в геном соматических клеток сопряжена с воздействием на гены [12, 13]. Однако такой метод трансдукции востребован, особенно в случае генной терапии [14]. Для повышения безопасности предложены лентивирусы нового поколения, которые описываются как более надежные [15]. Также предлагаются модернизированные методы сортировки клеточных клонов, например, один из них — оптическое фенотипирование [16].

В ходе проведенных исследований в результате лентивирусной трансфекции была получена гетерогенная культура Hep2-TagRFP, которая конститутивно экспрессирует флуоресцентный белок TagRFP, а также ее субклоны. Из пяти полученных субклонов в процессе культивирования были отобраны два наиболее перспективных: 2B10 и 2F11. При этом были выявлены заметные отличия в их морфологическом строении по сравнению с контрольной культурой Hep2-TagRFP. В частности, в процессе клеточного деления отмечался очаговый плотный рост колоний, сопровождающийся характерным изменением клеточных полигональных форм на более округлые (рис. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_01_034_add.zip ).

Анализ флуоресцентных профилей показал, что культура Hep2-TagRFP включала смесь флуоресцирующих и не флуоресцирующих клеток, в то время как субклоны 2B10 и 2F11 демонстририровали более однородное распределение флуоресцентного сигнала (см. рис. 1). Нормированное на фоновый сигнал значение интенсивности флуоресценции в клетках субклона 2F11 оказалось в 1,5—1,8 раза выше, чем в клетках субклона 2B10, согласно анализу, выполненному с использованием программного обеспечения ImageJ/Fiji. Результаты амплификации гена TagRFP показали, что уровень транскрипта в субклоне 2F11 был в 6,8 раза выше, чем в субклоне 2B10 (рис. 2). Это различие в уровне транскрипта, вероятно, является причиной выявленных различий в интенсивности флуоресценции между клонами.

Для оценки влияния лентивирусной трансдукции на экспрессию генов цитоскелета и белка TagRFP в гетерогенной культуре Hep2-TagRFP и субклонах 2F11 и 2B10 был проведен анализ ключевых характеристик транскрипции, включая эффективность амплификации (см. табл. 2) и значения пороговых циклов Ct (см. табл. 3). В качестве гена эндогенного контроля выбран ген GAPDH, уровень экспрессии которого оставался стабильным во всех образцах, что подтверждается значением Ct=22,75±0,93 цикла.

Как видно из рис. 3, уровень экспрессии генов ACTB и TUBB3, которые отвечают за формирование цитоскелета в клетке, выявил отличительные черты между субклонами. Клоны 2F11 и 2B10 демонстрировали существенное снижение наработки транскриптов актина и тубулина по сравнению с гетерогенной клеточной линией Hep2-TagRFP. Экспрессия гена тубулина снизилась примерно в 15 раз для обоих субклонов, а актина в 5 раз для F11 и 1,5 раза для 2B10. Полученные данные поясняют ранее выявленные морфологические особенности клеток.

В отличие от здоровых раковые клетки характеризуются неконтролируемым делением, аномальной скоростью пролиферации и активацией механизмов избегания/уклонения от иммунного ответа или, иначе говоря, защиты от повреждений ДНК, что отражается в дезорганизации фаз клеточного цикла. Благодаря регуляции контрольных точек G1, S, G2/M клеточного цикла происходит активация киназ, за счет гиперэкспрессии которых раковые клетки способны эффективно восстанавливать дефекты клеточной ДНК до продолжения пролиферации. Более подробно изучить причины снижения жизнеспособности и скорости пролиферации отобранных изогенных клонов и гетерогенной контрольной линии позволяет анализ распределения событий в фазах клеточного цикла.

Для всех трех линий были получены данные распределения событий в периоде 0–36 ч (рис. 4, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_01_035_add.zip ). Необходимо отметить, что доля клеток в фазе митоза (М) отличалась для субклонов и для исходной клеточной линии, причем клетки Hep2-TagRFP достигали пика (G2/M 25,84%) в интервале 8 ч (см. рис. 4, а). Для клона 2B10 (G2/M 19,65%) фаза митоза наступала спустя 12 ч (см. рис. 4, в) и гораздо позже для 2F11 (G2/M 25,64%) — спустя 20 ч (см. рис. 4, б). Кроме того, во всех трех образцах спустя 24 ч наблюдался выраженный переход из фазы G0 (фаза покоя или фаза старения) в фазу апоптоза Ap, в сравнении с гетерогенной линией Hep2-TagRFP (14,30%) клоны 2B10 (29,55%) и 2F11 (46,05%) демонстрировали более высокие уровни к 36 ч рис. 5, 6,см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_01_035_add.zip ).

Митотический индекс (МИ) считается важным прогностическим показателем выживаемости клеток [15]. Для оценки фактора были произведены расчеты интенсивности деления МИ всех трех образцов, данные представлены в табл. 4. Показатель рассчитывали по формуле:

Таблица 4. Динамика изменения митотического индекса

В активно делящихся популяциях клеток, что характерно для большинства опухолевых линий, МИ может достигать 10%. Культуры считаются низко делящимися, если МИ в диапазоне 1—0,1%. Нами было отмечено снижение МИ к 36 ч для клонов 2B10 (0,79%) и 2F11 (0,69%) в отличие от гетерогенной популяции Hep2-TagRFP, для которой МИ во всем временном интервале не опускался ниже 2%. В целом стоит отметить, что хотя и гетерогенная линия Hep2-TagRFP оказалась более жизнеспособной (среднее значение МИ 3,55%) — в отличие от ее субклонов 2B10 (среднее значение МИ 2,12%) и 2F11 (среднее значение МИ 2,07%) — тем не менее, исходя из полученных данных, можно заключить, что все исследуемые линии являются низко делящимся. Мы предположили, что неточность интеграции и неравномерная экспрессия трансгена может приводить к накоплению продукта, что в свою очередь вызывает повреждение митохондрий, инициируя вторичные пути некроза клеток. Кроме того, одним из признаков клеточного старения (увеличение фазы G0 и переход в фазу Ap) служит изменение формы и увеличение размеров клеток, что также отмечено выше в анализе морфологии.

Опухолевым клеткам свойственен высокий уровень метаболизма, характеризующийся эффектом Варбурга (аэробный гликолиз), образованием большого количества пирувата и быстрым закислением среды, что обеспечивается за счет высоких уровней АТФ [17]. Одним из показателей уровня метаболизма является активность митохондриальных редуктаз.

Активность митохондриальных редуктаз оценивали в логарифмической фазе роста с первых по седьмые сутки. Измеряемая оптическая плотность (количество образовавшегося формазана) была пропорциональна уровню их активности в клетках. Данные на рис. 7 демонстрируют, что митохондриальный потенциал гетерогенной культуры повышается примерно в 4 раза к пятым суткам, а 2B10, 2F11 примерно в 6 и 15 раз соответственно. Возможно, задержка пролиферации способствовала более выраженному митохондриальному биогенезу в клонах [18, 19].

Предварительная оценка туморогенности полученных субклонов продемонстрировала снижение туморогенного потенциала 2B10 и 2F11 по сравнению с исходной линией Hep2-TagRFP (рис. 8, см. и табл. 5 https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_01_036_add.zip ).

Таблица 5. Динамика роста опухолей и развития флуоресцентного сигнала

Примечание. * — животное пало

Таким образом, в данной работе методом лентивирусной трансдукции были получены изогенные клеточные клоны, отличающиеся по морфологии от исходной клеточной линии более плотной упаковкой клеточного монослоя, редуцированием их площади, изменением формы клеток, а также снижением пролиферативного потенциала. При переходе от гетерогенной культуры Hep2-TagRFP к клонам 2B10 и 2F11, в особенности у 2F11, наблюдалось закономерное изменение таких характеристик, как снижение пролиферативного индекса, удлинение клеточного цикла, снижение наработки транскриптов актина и тубулина (ACTB и TUBB3) и снижение туморогенности в мышах Nude.

Полученные в данной работе результаты могут быть обусловлены как возможными хромосомными перестройками, которые происходят в опухолевых культурах в процессе их длительного культивировании [8], так и проблемой сайт-специфичной интеграции, гиперэкспрессией/неравномерной экспрессией трансгена, индуцирующей преждевременное старение и гибель изогенных клонов [14].

Заключение

Таким образом, продемонстрированные изменения в фенотипе и генотипе полученных клонов, вероятно, являются результатом нелетального инсерционного мутагенеза, обусловленного многокопийной встройкой в регуляторные области, которые прямо или косвенно влияют на транскрипцию. Проблемы высокой копийности трансгена и связанный с этим риск воздействия лентивирус-опосредованных генетических встроек на молекулярный ландшафт клетки требуют особого внимания при получении опухолевых клеток-трансдуктантов. Клонирование таких клеток, демонстрирующих высокий уровень экспрессии трансгена, может привести к подавлению транскрипции ряда ключевых генов, что, в свою очередь, может изменить фенотипические характеристики опухолевых субклонов и снизить их туморогенный потенциал, что подтверждается результатами нашего исследования. Опухолевые модели являются важным инструментом для изучения молекулярных механизмов канцерогенеза и разработки инновационных протоколов доклинических исследований, в том числе с использованием современных методов прижизненной визуализации. В связи с этим нет сомнения, что релевантность таких моделей должна быть максимально высокой. Поэтому фенотипическое и генотипическое соответствие получаемых опухолевых клеточных моделей становится одной из важнейших задач при создании релевантных исследовательских систем.

Фондовая поддержка. Работа Жердевой В.В., Рассомахиной Н.В, Малошенок Л.Г., Гук Е.А., Апухтиной У.А. выполнена при поддержке гранта РНФ № 22-14-00205 (13 мая 2020 г.), https://rscf.ru/project/22-14-00205/

Благодарности: 1) лаборатории физической биохимии ФИЦ Биотехнологии РАН за предоставленный доступ к чистым помещениям для временного содержания мышей Nude и системе флуоресцентной визуализаци iBox (UVP, США); 2) лаборатории молекулярной генетики ФИЦ Биотехнологии РАН за помощь и консультации по проведению исследований на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter Life Sciences, США).

Соблюдение этических стандартов. В ходе исследования были соблюдены все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных. Вся экспериментальная работа осуществлялась в соответствии с нормами Международных рекомендаций по биомедицинским исследованиям (International Recommendations for Biomedical Research (CIOMS) и приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ «Об утверждении Правил лабораторной практики» (№ 708н от 23.08.2019). Работы с животными одобрены этическим комитетом ФИЦ Биотехнологии РАН (№ 23/1, 16 июня 2022).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.