Значение экспрессии матриксных металлопротеиназ в дифференциальной диагностике патологии пародонта

Во всем мире заболевания пародонта являются широко распространенными и хроническими, сопровождающимися деструктивным характером поражения с вовлечением десны, пародонтальной связки, цемента корня зуба и альвеолярных отростков челюстных костей. Диагностика пародонтита основывается на клинических признаках заболевания и результатах лучевых методов обследования, которые, однако, обладают ограниченным потенциалом на этапе манифестации заболевания для выделения группы пациентов с быстропрогрессирующим течением. В связи с этим необходим поиск новых маркеров, позволяющих провести максимально раннюю диагностику быстропрогрессирующих форм патологии для выбора правильной стратегии лечения с целью снижения скорости деструкции тканей пародонта и профилактики утери зубов.

Важное значение в патогенезе воспаления, в том числе тканей пародонта, в настоящее время придается матриксным металлопротеиназам (MMPs) [1, 2]. При этом в качестве основных протеаз, участвующих в деструкции тканей пародонта, рассматриваются коллагеназы (MMP8, MMP13) и желатиназы (MMP2, MMP9), которые участвуют в деградации коллагена I типа, представляющего собой преобладающий компонент пародонтального внеклеточного матрикса [3—6]. Уровень их содержания коррелирует с тяжестью заболевания, его прогрессированием и ответом на проводимую терапию [7—9]. В очагах воспаления основным источником коллагеназ и желатиназ выступают сегментоядерные лейкоциты и макрофаги [10].

Исследование матриксных металлопротеиназ выявило их влияние на различные биоактивные нематриксные субстраты, такие как цитокины, хемокины, факторы роста и медиаторы иммунного ответа. Основываясь на этих биохимических и иммунологических данных, ткани и биологические жидкости полости рта стали целью исследований MMPs и их регуляторов для диагностики и мониторинга заболеваний пародонта и периимплантитов [11, 12].

Активность и функции MMP2, MMP9 позволяют предположить, что эти ферменты синергически управляют разрушением и ремоделированием тканей пародонта. Повышение уровней MMP9 и MMP8 обладает диагностическим потенциалом для хронического пародонтита, протекающего бессимптомно апикального пародонтита, а определение уровня MMP2 в десневой жидкости имеет диагностическое значение только при хроническом процессе в пародонте [11]. Существует мнение, что MMP13 и MMP14 также являются ключевыми ферментами при патологии пародонта [4, 13].

Любой дисбаланс между MMPs и их тканевыми ингибиторами вызывает разрушение коллагена десны, в том числе необратимое, что неизбежно ведет к развитию пародонтита [14]. Установлено, что соотношение уровней MMP1, MMP2, MMP3 и MMP9 и тканевых ингибиторов MMP (TIMP1 и TIMP2) в ткани десны, ротовой жидкости, десневой жидкости может предоставить дополнительную информацию о прогрессировании заболевания, а MMPs и TIMPs могут выступать в качестве перспективных таргетных молекул для терапии с целью уменьшения деструкции тканей пародонта [14, 15].

В соответствии с вышесказанным исследование особенностей экспрессии MMPs имеет важное значение в понимании механизмов патогенеза воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта и может быть использовано как для определения характера их течения на этапе первичной диагностики и мониторинга заболевания в динамике, так и для разработки патогенетически обоснованной терапии данной группы заболеваний.

Цель настоящего исследования — установить значение экспрессии MMPs для дифференциальной диагностики и определения характера течения пародонтита на этапе манифестации заболевания путем морфометрической оценки экспрессии MMPs в биопсийном материале десен.

Клинические данные. Объектом исследования явился биопсийный материал десен 82 пациентов на базах 1-й кафедры терапевтической стоматологии (ГУ «Республиканская клиническая стоматологическая поликлиника») и патологической анатомии УО «Белорусский государственный медицинский университет» с различным характером течения пародонтита: быстропрогрессирующим (БПП, n=26), хроническим простым (ХПП, n=18) и хроническим сложным (при наличии окклюзионной травмы) (ХСП, n=38). Критериями включения в исследование стали клинико-рентгенологические признаки деструкции пародонта и возраст пациентов: для БПП — 18—35 лет, для ХПП и ХСП — 36—60 лет. Проведено клинико-инструментальное обследование и лечение пациентов с патологией пародонта, включенных в исследование, с получением от каждого из пациентов информированного согласия.

Гистологическое исследование. При проведении морфологической оценки биопсийного материала десен пациентов с различными формами патологии пародонта оценке подлежали признаки альтеративных изменений в эпителиальном компоненте в виде десквамации эпителия, гидропической дистрофии, изъязвления, акантоза, наличия межэпителиальных лейкоцитов, разрушения или гипертрофии коллагеновых волокон, кровоизлияний, воспалительной инфильтрации с преобладанием сегментоядерных лейкоцитов и/или мононуклеарной инфильтрации в сосочковом и сетчатом слое десны.

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование. Гистологические срезы с парафиновых блоков толщиной 2,5 мкм депарафинировали в ксилоле и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации. Отработаны протоколы ИГХ-выявления шести MMPs (MMP1, 2, 8, 9, 13 и 14).

Для морфометрического анализа выполняли сканирование препаратов, окрашенных с использованием ИГХ, с применением цифрового слайд-сканера Motic Easy Scan с последующим программным анализом изображений с использованием Aperio ImageScope v. 12.4.0.5043.

В рамках программного анализа изображений выделяли 6 случайных непересекающихся полей зрения (цифровое увеличение ×20) с анализом ИГХ-окрашивания в поле зрения в целом (которое включало эпителиальный и стромальный компоненты в равных пропорциях; 3 поля зрения — total), а также отдельно в стромальном компоненте десны (3 поля зрения — stromal). В процессе программного анализа экспрессии MMPs в ткани десны интенсивность коричневой окраски (продуктов реакции ДАБ-хромогена) измеряли Aperio ImageScope автоматически и разделяли на 3 уровня интенсивности и негативную реакцию. Результат программной оценки показателей позитивности и доли пикселей с высокой и умеренной экспрессией имел прямую взаимосвязь, а интенсивности экспрессии — обратную взаимосвязь с данными визуальной оценки.

Для анализа исследуемых групп по характеру экспрессии вышеназванных маркеров с использованием программы Aperio ImageScope рассчитывали следующие параметры для каждого маркера:

— позитивность (Positivity — отношение числа позитивных пикселей к общему числу позитивных и негативных пикселей, %);

— долю пикселей с высокой и умеренной интенсивностью (Nsr+p — отношение числа позитивных пикселей с высокой и умеренной интенсивностью к общему числу позитивных и негативных пикселей, %);

— индекс интенсивности в иммунопозитивных участках (MMPs_index — отношение суммы интенсивностей пикселей с высокой, средней, низкой интенсивностью к числу позитивных пикселей);

— общий индекс интенсивности ИГХ-реакции (MMPs_INDEX — отношение суммы интенсивностей негативных и позитивных пикселей к общему числу позитивных и негативных пикселей).

Статистический анализ данных проводили с использованием программного обеспечения Statistica 10.0 с вычислением медианы (Ме), интерквартильного (25-го и 75-го перцентилей — IQR) и 95% доверительного интервалов, максимального и минимального значения. Для оценки характера распределения полученных данных применяли критерий Шапиро—Уилка (W). Парное сравнение независимых выборок по количественным признакам осуществляли с использованием дисперсионного анализа непараметрических данных ANOVA и определением критерия Манна—Уитни (U-критерия). Для решения задачи классификации пародонтитов и оценки ее диагностической эффективности выполняли ROC-анализ с определением пороговых значений и их операционных характеристик (диагностической чувствительности (ДЧ) и специфичности (ДС)). При этом информативность параметров экспрессии оценивали по показателю AUC (площади под ROC-кривой) в соответствии со следующей шкалой: 0,9—1,0 — наивысшая информативность; 0,8—0,9 — хорошая; 0,7—0,8 — приемлемая; 0,6—0,7 — слабая; 0,5—0,6 — крайне слабая. Уровень статистической значимости — при p<0,05.

В рамках морфологического исследования биопсийного материала десен пациентов с различными формами пародонтита статистически значимых различий между исследуемыми группами по оцениваемым признакам альтеративных изменений эпителия и собственной пластинки десны, состоянию коллагеновых волокон, наличию кровоизлияний, выраженности воспалительной инфильтрации выявлено не было. Также группы исследования были сопоставимы по доле случаев с такими клиническими параметрами, как глубина пародонтальных карманов 4—5 мм и 6 мм и более, утеря прикрепления LA «I» и LA «II», рецессия десны, поражение фуркации I—II степени, подвижность зубов I—II степени. Исключение составили данные панорамной и/или компьютерной томографии, при которой в группах БПП и ХСП статистически значимо чаще выявлялась вертикальная резорбция костной ткани I—II степени (p≤0,002), а в группе ХПП преобладала горизонтальная резорбция I—II степени (p≤0,024).

Особенности экспрессии изученных MMPs при различных формах патологии пародонта представлены на рис. 1 и в табл. 1.

Рис. 1. Характер экспрессии MMPs в биопсийном материале десен.

Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к MMPs, ×200 (хромоген — DAB, контрокрашивание гематоксилином Майера) и результат работы алгоритма positive pixel count программы Aperio ImageScope.

Fig. 1. The features of MMP expression in the gingival biopsy.

Таблица 1. Параметры экспрессии MMPs в биопсийном материале десен пациентов с различными формами патологии пародонта

В соответствии с клиническими и рентгенологическими признаками на этапе манифестации заболевания наибольшие трудности возникают при дифференциальной диагностике быстропрогрессирующего и хронического сложного пародонтита.

Изученные особенности экспрессии MMPs (рис. 2, табл. 2) показали, что в группе пациентов с БПП по сравнению с группой с ХСП имеют место более высокие значения параметров площади общей и стромальной экспрессии, доли пикселей с выраженной и умеренной интенсивностью и индексов интенсивности общей и стромальной экспрессии MMP1 и MMP8, площади общей и стромальной экспрессии, доли пикселей с выраженной и умеренной интенсивностью MMP14, интенсивности экспрессии MMP13 в иммунопозитивных участках и статистически значимо более низкие параметры площади общей и стромальной экспрессии и доли пикселей с выраженной и умеренной интенсивностью экспрессии MMP9.

Рис. 2. Характер общей (а) и стромальной (б) экспрессии MMPs в биопсийном материале десен в группах пациентов с различными формами патологии пародонта.

Fig. 2. The features of the general (a) and stromal (b) MMP expression in the gingival biopsy in groups of patients with different forms of periodontal disease.

Таблица 2. Сравнение групп по параметрам экспрессии MMPs в биопсийном материале десен пациентов с различными формами патологии пародонта

Примечание. Жирный шрифт — различия статистически значимы; * — p<0,05.

Сравнение групп БПП и ХПП выявило похожую тенденцию с более высокими параметрами преимущественно стромальной экспрессии по площади и доле пикселей с выраженной и умеренной интенсивностью окрашивания MMP1 и MMP8, более выраженной по интенсивности преимущественно стромальной экспрессией MMP9 и более низкими параметрами общей и стромальной экспрессии MMP14 по площади, доле пикселей с выраженной и умеренной интенсивностью и индексам интенсивности в группе пациентов с БПП.

Согласно полученным нами результатам, MMP2 и MMP13 имели статистически незначимо различающиеся параметры экспрессии как при быстропрогрессирующем, так и при хроническом медленном развитии процесса, что согласуется в данными литературы в части корреляции уровней экспрессии MMP2 с выраженностью и характером течения воспаления [16, 17], ответом на проводимую терапию [18], равно как и влияния повышенных уровней экспрессии MMP13 на степень деструкции альвеолярного отростка [19]. В патогенезе БПП наибольшее значение, вероятно, имеют более высокие, чем при хронических медленно прогрессирующих формах, уровни экспрессии MMP1 и MMP8, а также MMP14 (по сравнению с ХСП) наряду с более низким уровнем экспрессии MMP9. Данные литературы в отношении параметров MMP1 и MMP8 согласуются с выявленной тенденцией [18, 20—23]. Что же касается особенностей экспрессии MMP9, то данные литературы достаточно противоречивы [22]. В нескольких исследованиях показано, что при выключении экспрессии MMP9 в эксперименте отмечали больший объем поражения периапикальных тканей и бóльшую степень деструкции альвеолярного отростка, более высокие уровни MMP2/MMP8, что позволило авторам предположить не только прововоспалительный, но и противовоспалительный эффект MMP9 [24, 25].

Выполненный анализ классификации подтвердил, что среди изученных MMPs наилучшими характеристиками для дифференциальной диагностики быстропрогрессирующего пародонтита от хронических форм на этапе первичной диагностики обладают параметры стромальной экспрессии MMP14, а хорошей и приемлемой степенью характеризуются параметры общей и стромальной экспрессии MMP1, MMP8, MMP9 и параметры общей экспрессии MMP14 (табл. 3, 4). Одновременно не выявлено диагностической значимости параметров экспрессии MMP2 и MMP13 для выделения группы с агрессивным течением.

Таблица 3. Результаты ROC-анализа показателей экспрессии MMPs в дифференциальной диагностике быстропрогрессирующего и хронического простого/сложного пародонтита

Примечание. Жирный шрифт — точки отсечения статистически значимы для классификации случаев по группам; * — качество бинарной классификации пародонтитов от приемлемой и выше.

Таблица 4. Информативность показателей экспрессии MMPs в дифференциальной диагностике быстропрогрессирующего от хронического простого / хронического сложного пародонтита

Примечание. Степень значимости признака: **** — наивысшая, *** — хорошая, ** — приемлемая, * — слабая.

Проведенный анализ характера экспрессии MMPs в биопсийном материале десен пациентов с патологией пародонта показал, что MMP2 и MMP13 приблизительно в равной степени участвуют в развитии и течении изученных форм пародонтита. В патогенезе быстропрогрессирующего процесса, клинически и рентгенологически ассоциированного с прогрессирующей деструкцией тканей пародонта и альвеолярного отростка, наибольшее значение имеют повышенные уровни экспрессии MMP1, MMP8, MMP14 и снижение экспрессии MMP9.

Установленные особенности экспрессии MMPs подтвердили ее значение для классификации пародонтитов на этапе манифестации заболевания. Так, для выделения группы пациентов с агрессивным течением пародонтита в качестве диагностических наиболее информативными определены следующие показатели экспрессии MMPs: позитивность, доля пикселей с высокой и умеренной интенсивностью и индексы общей и стромальной экспрессии MMP1; позитивность и доля пикселей с высокой и умеренной интенсивностью стромальной экспрессии, индексы общей и стромальной экспрессии MMP8; позитивность и доля пикселей с высокой и умеренной интенсивностью общей и стромальной экспрессии MMP9 и MMP14.

Полученные результаты позволяют охарактеризовать некоторые из аспектов патогенеза патологии пародонта с позиции особенностей экспрессии изученных MMPs. Кроме того, быстропрогрессирующий пародонтит и связанная с ним утеря зубов уже отнесены к факторам, модифицирующим общее здоровье пациентов. Поэтому выделение на этапе манифестации заболевания пациентов с агрессивным течением патологии пародонта позволит максимально персонифицировать терапию для данной группы пациентов, исключить либо отсрочить утерю зубов, снизить затраты на лечение, в том числе на протезирование, и улучшить качество жизни пациентов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Л.А. Казеко, В.А. Захарова, Е.Д. Черствый

Сбор и обработка материала — Л.А. Казеко, В.А. Захарова, Е.А. Анфиногенова

Написание текста — Л.А. Казеко, В.А. Захарова

Редактирование — Е.Д. Черствый, Л.А. Казеко, В.А. Захарова

Научное руководство — Е.Д. Черствый

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.