Рак легкого (РЛ) — одна их основных причин смерти от онкологических заболеваний. Это гетерогенная группа злокачественных новообразований, лечебная тактика при которых напрямую зависит от морфологии и генетических характеристик опухоли [1—3]. Молекулярно-генетическое тестирование активирующих мутаций EGFR (19-й и 21-й экзоны) и транслокаций ALK и ROS1 входит в диагностический алгоритм обследования пациента с верифицированной аденокарциномой или аденоплоскоклеточным раком [4, 5]. Это связано с появлением таргетных препаратов, направленных на ингибирование рецепторных тирозинкиназ EGFR, ALK и ROS1, положительный ответ на лечение данными препаратами зависит от наличия в опухоли указанных генетических нарушений, служащих молекулярными мишенями для направленной терапии и встречающихся преимущественно в железистых карциномах [2, 3]. При исключительно плоскоклеточной дифференцировке в карциноме легкого целесообразно проведение иммуногистохимического (ИГХ) исследования уровня экспрессии PD-L1 для уточнения возможности назначения данному пациенту иммунотерапии. Также, говоря о плоскоклеточном раке, необходимо помнить об особой когорте пациентов, характеризирующихся следующими признаками: молодой возраст, преимущественно женский пол, некурящие или имеющие малый стаж курения в анамнезе, периферическое расположение опухоли. Учитывая описанные клинические особенности плоскоклеточного РЛ в данных случаях, первичное молекулярно-генетическое исследование целесообразнее, чем определение PD-L1-статуса.

Таким образом, своевременность и точность патоморфологической диагностики аденогенных и плоскоклеточных карцином легкого приобретают особое значение, так как в зависимости от поставленного морфологом диагноза зависит дальнейшее обследование и лечение пациента.

Однако при дифференциальной диагностике аденокарциномы и плоскоклеточного РЛ патологоанатом может столкнуться со значительными трудностями, особенно при работе с биопсийным материалом. Солидные аденокарциномы могут демонстрировать плотную эозинофильную цитоплазму, имитируя плоскоклеточную карциному. В низкодифференцированных плоскоклеточных раках, как правило, отсутствуют диагностические морфологические плоскоклеточные признаки, такие как кератинизация, роговые жемчужины и межклеточные мостики [6].

Для правильной верификации таких опухолей, если количество материала это позволяет, необходимо проводить дополнительное ИГХ-исследование с использованием как плоскоклеточных маркеров, так и маркеров пневмоцитов. Наиболее часто применяемые маркеры при РЛ — это p40, p63, CK5/6, TTF1, CK7.

Однако следует отметить, что положительная экспрессия TTF1 наблюдается примерно в 75% аденокарцином легкого, но данный маркер также экспрессируется и в других опухолях легкого, таких как мелкоклеточный и крупноклеточный нейроэндокринный рак, в части карциноидов и в редких случаях фокально — в неороговевающей плоскоклеточной карциноме [6, 7]. Также необходимо иметь в виду, что в солидных аденокарциномах экспрессия TTF1 встречается реже, чем в аденокарциномах стелющегося и папиллярного типа [6].

Среди плоскоклеточных маркеров необходимо выделить p40 и p63.

Ген TP63 (белок p63), расположенный на хромосоме 3q27—29, содержит 15 экзонов и является гомологом гена-супрессора опухолевого роста TP53 (белок р53), кроме того, ген TP63 содержит те же «горячие точки» для мутаций, играющих роль в онкогенезе, что и ген TP53. Физиологическая роль p63 заключается в контроле пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток-предшественников.

TP63 содержит два промотора, кодирующих два класса белков путем альтернативного сплайсинга: TAp63, содержащий домен трансактивации, и ΔNp63 (р40), в котором данный домен отсутствует. Как TAp63, так и ΔNp63 демонстрируют перекрывающееся распределение в эпителиальных тканях. Однако если экспрессия TAp63 более характерна для дифференцированных клеток, то ΔNp63 наблюдается в популяциях стволовых клеток. Оба белка (ΔNp63 и TAp63) экспрессируются в немелкоклеточном РЛ, однако ΔNp63α — достоверно преобладающая изоформа, экспрессируемая в плоскоклеточной карциноме легкого [8, 9].

Анти-р63 широко известен как ИГХ-маркер плоскоклеточного РЛ; несмотря на высокую чувствительность, связанную с тем, что антитела к p63 распознают как белок p63, так и p40, он не обладает достаточной специфичностью [7]. Белок p63 экспрессируется в 30% аденокарцином легкого [6—9] и также может выявляться в нейроэндокринных РЛ, особенно в тех, что обладают крупноклеточной морфологией. Интерпретация результатов ИГХ-исследования с использованием p63 зависит от экспрессии TTF1, поскольку только диффузное окрашивание p63 при отсутствии TTF1 свидетельствует в пользу диагноза «плоскоклеточный рак». В ряде случаев ИГХ-панель, включающая только два маркера (p63 и TTF1), может оказаться недостаточной для подтверждения плоскоклеточного рака, в таких случаях приходится прибегать к использованию дополнительных маркеров плоскоклеточной дифференцировки, что ставит под угрозу сохранение тканей для последующих исследований [8].

Несмотря на то что антитело р40, идентифицирующее наличие белка ΔNp63, сравнительно недавно стали применять для дифференциальной диагностики плоскоклеточного РЛ и аденокарциномы, ряд исследований, проведенных различными авторами, подтвердил, что p40 обладает достаточно высокой специфичностью и чувствительностью [8]. В настоящее время белок p40 признан наиболее спе-цифичным маркером плоскоклеточной дифференцировки и рекомендован для включения в ИГХ-панель при проведении дифференциального диагноза между плоскоклеточными и аденогенными карциномами легкого.

Материал и методы

Материалом для исследования послужили 50 образцов операционного и биопсийного материала РЛ, предоставленные кафедрой патологической анатомии РМАНПО за период с 2015 по 2020 г. Образцы РЛ фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин по стандартной технологии. Информация о пациентах получена из компьютеризированной системы медицинских карт. Идентификация пациентов оставалась анонимной, и каждый случай был закодирован соответствующим образом. Выборка произведена случайным образом, критериями отбора были: достаточный объем материала, гистологические варианты опухоли — аденокарциномы солидного типа строения (10 случаев) и плоскоклеточные неороговевающие раки (40). Все опухоли имели низкую степень дифференцировки — G3. Неинвазивные формы рака, а также аденоплоскоклеточные карциномы в исследование не включались. В 49 случаях это были первичные опухоли, в 1 случае — метастаз в надключичном лимфатическом узле. Микропрепараты, окрашенные гематоксилином и эозином, оценены двумя патологами согласно классификации ВОЗ 2015 г. для подтверждения диагноза.

В исследовании использовали следующие первичные антитела VENTANA: мышиные моноклональные антитела anti-p40 (BC28); мышиные моноклональные антитела anti-p63 (4A4); мышиные моноклональные антитела anti-Cytokeratin 5/6 (D5/16B4); кроличьи моноклональные антитела CONFIRM anti-Cytokeratin 7 (SP52); мышиные моноклональные антитела CONFIRM anti-Thyroid Transcription Factor-1 (8G7G3/1).

Для первичного антитела anti-p40 (BC28) использован рекомендуемый производителем протокол окрашивания с системой детекции OptiView DAB IHC Detection Kit на приборе BenchMark ULTRA: депарафинирование образца, демаскировка антигена с помощью Cell Conditioning 1 — 32 мин, предварительная обработка ингибитором пероксидазы, инкубация первичного антитела в BenchMark ULTRA — 16 мин при 36°C, HQ linker OptiView — 8 мин, OptiView HRP Multimer — 8 мин, дополнительное окрашивание Hematoxylin II — 4 мин, контрастное окрашивание Bluing — 4 мин. С каждого образца опухоли делали по 2 среза: один — для нанесения первичных антител, второй — для негативного контроля, в качестве внешнего позитивного контроля использовали ткань плоскоклеточной карциномы легкого.

Для первичных антител CONFIRM anti-Thyroid Transcription Factor-1 (8G7G3/1), anti-p63 (4A4), anti-Cytokeratin 5/6 (D5/16B4), CONFIRM anti-Cytokeratin 7 (SP52) использовали стандартный протокол с системой детекции UltraView DAB IHC Detection Kit (VENTANA). С каждого образца опухоли делали по 2 среза: один — для нанесения первичных антител, второй — для негативного контроля, в качестве внешнего позитивного контроля использовали для anti-p63 (4A4), anti-Cytokeratin 5/6 (D5/16B4) — ткань миндалины, для CONFIRM anti-Cytokeratin 7 (SP52) — ткань легкого. Срезы внутрилабораторного позитивного контроля наносили на стекла с изучаемыми образцами.

Результаты и обсуждение

Экспрессия p40 и p63 наблюдалась во всех случаях плоскоклеточного неороговевающего рака и отсутствовала во всех случаях аденокарциномы. ИГХ-реакция с p40 отличалась диффузным характером и выраженной интенсивностью, тогда как реакция с p63 в 8 случаях имела фокальный характер окрашивания умеренной и слабой интенсивности.

CK5/6 в плоскоклеточном неороговевающем раке продемонстрировал положительную экспрессию в 39 случаях, в 1 случае выявлена фокальная экспрессия слабой интенсивности, в 1 случае экспрессия отсутствовала. Во всех аденокарциномах ИГХ-реакция с данным маркером была отрицательная.

CK7 экспрессировался во всех случаях аденокарцином, также наблюдалась умеренная диффузная экспрессия данного маркера в 1 случае плоскоклеточного неороговевающего рака, при этом экспрессия TTF1 отсутствовала.

Экспрессия TTF1 отмечена во всех аденокарциномах и не определялась в опухолевых клетках плоскоклеточных неороговевающих карцином, однако присутствовала в пневмоцитах окружающей ткани (внутренний позитивный контроль) (рис. 1—4).

Рис. 1. Результаты исследования экспрессии p40, p63, CK5/6, CK7 и TTF1 ИГХ-методом.

Рис. 2. Метастаз аденокарциномы легкого солидного строения в надключичном лимфатическом узле, G3. Результаты ИГХ-исследования.

а — аденокарцинома легкого солидного строения, G3. Окраска гематоксилином и эозином; б—е — ИГХ-реакции с антителами к CK5/6, p40, p63, CK7, TTF1; б — отсутствие экспрессии CK5/6 в клетках опухоли; в — отсутствие экспрессии p40 в клетках опухоли; г — отсутствие экспрессии p63 в клетках опухоли, артифициальное фоновое окрашивание; д — выраженная диффузная экспрессия CK7 в клетках опухоли; е — экспрессия различной интенсивности (от слабой до выраженной) TTF1 в клетках опухоли. а—е — ×200.

Рис. 3. Плоскоклеточный неороговевающий рак легкого, G3.

Результаты ИГХ-исследования. Отсутствие экспрессии CK7 в клетках опухоли.

а — плоскоклеточный неороговевающий рак легкого, G3. Окраска гематоксилином и эозином; б—е — ИГХ-реакции с антителами к CK5/6, p40, p63, CK7, TTF1; б — выраженная диффузная экспрессия CK5/6 в клетках опухоли; в — выраженная диффузная экспрессия p40 в клетках опухоли; г — умеренно выраженная фокальная экспрессия p63 в клетках опухоли; д — отсутствие экспрессии CK7 в клетках опухоли; е — отсутствие экспрессии TTF1 в клетках опухоли. а—е — ×200.

Рис. 4. Плоскоклеточный неороговевающий рак легкого, G3.

Результаты ИГХ-исследования. Наличие экспрессии CK7 в клетках опухоли.

а — плоскоклеточный неороговевающий рак легкого, G3. Окраска гематоксилином и эозином; б—е — ИГХ-реакции с антителами к CK5/6, p40, p63, CK7, TTF1; б — выраженная диффузная экспрессия CK5/6 в клетках опухоли; в — выраженная диффузная экспрессия p40 в клетках опухоли; г — умеренно и слабо выраженная экспрессия p63 в клетках опухоли; д — умеренная диффузная экспрессия CK7 в клетках опухоли; е — отсутствие экспрессии TTF1 в клетках опухоли. а—е — ×200.

Заключение

Резюмируя полученные результаты, необходимо отметить, что в нашем исследовании маркер p40 показал более высокую специфичность по сравнению с другим маркером плоскоклеточной дифференцировки — p63, это подтверждает данные, что для верификации плоскоклеточной карциномы легкого целесообразно использовать маркер p40. При наличии ограниченного объема материала для проведения дифференциальной диагностики между аденокарциномой и плоскоклеточным раком легкого ИГХ-методом оптимальное решение — ограничить ИГХ-панель до двух маркеров — p40 и TTF1. Это позволяет достоверно определить вариант рака и сохранить достаточное количество материала для генетического исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.