Введение

Изучение строения, функций экзосом и их диагностического, терапевтического и прогностического потенциала — новая область исследований, привлекающая внимание многих ученых во всем мире [1]. Экзосомы представляют собой небольшие двухслойные мембранные внеклеточные нановезикулы (ВНВ) размером 30—100 нм в диаметре, которые секретируются различными типами клеток, в том числе опухолевыми, иммунными клетками, фибробластами и проч. [2, 3].

ВНВ осуществляют межклеточную коммуникацию для регуляции различных биологических процессов, в том числе связанных с опухолевыми поражениями, включая канцерогенез, ангиогенез, прогрессирование, метастазирование и устойчивость к лекарственным препаратам [4]. ВНВ реализуют свои функции благодаря переносу множества содержащихся в них биоактивных компонентов, которые способствуют структурно-функциональным изменениям клетки-реципиента [5—8]. К специфическими биологическим компонентам, находящимся внутри ВНВ и образующимся в разных линиях клеток в разных условиях, относятся более 1010 видов липидов, около 9700 видов белков, более 3300 видов мРНК, более 1400 видов микроРНК, 18 видов рРНК, 60 видов тРНК, 110 видов snoРНК, 27 видов snРНК, 6 видов lncРНК, 3 вида lincРНК, 5 видов ncРНК [9, 10].

Новый класс молекул РНК, которые выполняют множество основных регуляторных функций у эукариот, в том числе регулируют нормальный рост клеток и апоптоз, играют роль в аномальных функциях клеток, связанных с прогрессированием рака и метастазированием, — некодирующие РНК (ncРНК) [11, 12]. Некодирующие РНК можно разделить на две группы в зависимости от длины их транскриптов: малые ncРНК (<200 последовательностей нуклеотидов), такие как транспортные РНК (тРНК), рибосомальные РНК (рРНК), малые ядрышковые РНК (snoРНК), микроРНК (miРНК), малые интерферирующие РНК (siРНК), PIWI-взаимодействующие РНК (piРНК), антисмысловые РНК и РНК, ассоциированные с промотором (PARs), и длинные ncРНК (lncРНК, >200 последовательностей нуклеотидов) [13].

Материал и методы

Данный обзор посвящен анализу имеющихся в литературе данных о роли экзосомальных некодирующих РНК в канцерогенезе и ангиогенезе при опухолях легкого, а также о возможностях их использования для малоинвазивной диагностики и прогнозирования рака легкого. Поиск литературы был проведен на платформах PubMed, Google Scholar и eLibrary. При поиске литературы использовались такие ключевые слова, как «диагностика рака легкого» (diagnosis of lung cancer), «экзосомальные микроРНК» (exosomal miRNAs), «некодирующие РНК» (non-coding RNAs, ncRNAs), «жидкая биопсия» (liquid biopsy) с вариабельной композицией указанных терминов. Для подготовки обзора выбрано более 150 источников, часть из которых была исключена в связи с отсутствием, недостаточностью или неактуальностью имеющейся в работах информации по теме обзора. Для анализа было выбрано 85 иностранных источников, содержащих необходимую для обзора информацию. Обзор не является систематическим, представляет собой классический формат реферативного научного обзора литературы.

Роль микроРНК в канцерогенезе при раке легкого

Среди nсРНК наиболее изучены микроРНК, представляющие собой тип коротких некодирующих РНК, которые могут опосредовать паракринные и эндокринные эффекты путем посттранскрипционной модуляции экспрессии генов и клеточной функции в клетках-реципиентах [14]. Многие авторы, проводившие исследования в области изучения экзосом и их компонентов, приводят возможные механизмы участия микроРНК в канцерогенезе, инвазии и метастазировании опухолей легкого.

Потенциальная роль микроРНК в канцерогенезе исходит из их способности влиять на трансляцию генов-супрессоров опухолей и онкогенов. МикроРНК могут секретироваться через ВНВ и комплексы белок—микроРНК. Содержимое комплекса белок—микроРНК ВНВ может передаваться клеткам-реципиентам и доставлять биологическую информацию, которая играет важную роль в метастазировании опухолей и прогнозе [14, 15].

ВНВ присутствуют в различных жидкостях организма и захватываются соседними или отдаленными клетками. При этом микроРНК доставляются в клетку-реципиент, а затем изменяют ее функции. J. Ratajczak и соавт. в своем исследовании показали, что содержащаяся во ВНВ РНК отвечает за горизонтальный перенос генетической информации между клетками [16]. После транслокации из ядра в цитоплазму молекулы экзосомальных РНК связываются с мембранными органеллами или везикулами и транспортируются во внутриклеточные сайты. H. Valadi и соавт. в своей работе показали, что ВНВ содержат подмножество как клеточной мРНК, так и микроРНК, которые могут быть переданы клеткам-реципиентам [17].

ВНВ, выделяющиеся из клеток рака легкого (РЛ), так называемых клеток A549, участвуют в воспалительной реакции и в конечном итоге стимулируют развитие и прогрессирование опухоли. Такие микроРНК, как miR-21 и miR-29a ВНВ, секретируемых клетками A549, действуют как паракринные агонисты семейства Toll-подобных рецепторов (TLR), связываясь с TLR8, стимулируя путь ядерного фактора каппа-B (NF-κB) и способствуя выработке воспалительных цитокинов посредством секреции фактора некроза опухоли α и интерлейкина-6 [18].

Было установлено, что количество ВНВ, содержащих miR-21, увеличивалось за счет активации сигнальных путей трансдукторов и активаторов транскрипции 3 (STAT3) в условиях воздействия экстракта табачного дыма на клетки бронхиального эпителия. Увеличение экспрессии miR-21 может повышать уровень фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и, следовательно, ускорять ангиогенез в опухолевом очаге и вызывать злокачественную трансформацию клеток бронхиального эпителия [19, 20]. Более того, секретируемая из клеток опухоли miR-21 может способствовать пролиферации и изменению соседних нормальных клеток бронхиального эпителия, тем самым подтверждая гипотезу об участии экзосомальных микроРНК в межклеточной коммуникации во время канцерогенеза [21].

В исследовании X. Li и соавт. [22] показано, что выделяющиеся из опухолевых клеток ВНВ могут повышать экспрессию микроРНК TLR2, TLR7 и TLR8 в мезенхимальных стволовых клетках, особенно TLR2. В своем исследовании авторы пришли к выводу о том, что TLR индуцируют секрецию воспалительных факторов и усиливают экспрессию белка теплового шока 70 (HSP70), что в итоге приводит к активации сигнального пути NF-κB с увеличением роста опухолевых клеток при РЛ [22].

В недавно проведенных исследованиях было показано, что экзосомальная miR-23a может способствовать прогрессированию РЛ за счет снижения уровня пролилгидроксилазы 1/2 (PDH1/2) и накопления индуцируемого гипоксией фактора-1α (HIF-1α) как в нормоксических, так и в гипоксических условиях. Экзосомальная miR-23a также подавляла белок плотных контактов Zonula occludens-1 (ZO-1), что приводило к повышению проницаемости сосудов и облегчению трансэндотелиальной миграции опухолевых клеток [23, 24].

H. Wu и соавт. [25] доказали, что циркулирующая экзосомальная miR-96 может способствовать прогрессированию РЛ благодаря связыванию с 3’-нетранслируемой областью дикого типа LIM-домена белка 7 (LMO7). Авторы на основе полученных результатов исследования предположили, что ось miR-96—LMO7 может быть потенциальным диагностическим маркером и терапевтической мишенью при РЛ [25].

H. Cui и соавт. [26] в своей работе показали, что сверхэкспрессия тканевого ингибитора металлопротеиназ-1 (TIMP-1) увеличивает секрецию ВНВ, содержащих miR-210, полученных из клеток аденокарциномы (АК) легкого через CD63/фосфатидилинозитол-3-киназа/AKT/HIF-1-зависимый путь и стимулирует ангиогенез in vitro [26]. N. Kosaka и соавт. утверждают, что содержащие miR-210 ВНВ облегчают работу нейтральной сфингомиелиназы 2 (nSMase2) и могут связываться с эффекторной единицей рецептора преметастатических эндотелиальных клеток, что итоге активирует миграцию эндотелиальных клеток и ускоряет ангиогенез [27].

M. Rodriguez и соавт. [28] определили связь miR-122 и miR-126 с ангиогенезом при немелкоклеточном РЛ (НМРЛ) и регуляцией эмбриональных стволовых клеток человека. Экзосомальная miR-9 может снижать экспрессию цитокинового сигнального пути 5 и стимулировать ангиогенез в опухоли, активируя сигнальный путь янус-киназы — трансдуктора сигнала и активатора транскрипции (JAK-STAT) [29]. Выделяющиеся из опухоли ВНВ, содержащие большое количество miR-494 и miR-542-3p, могут подавлять экспрессию кадгерина-17, а затем повышать уровни матриксной металлопротеиназы 2 и 3, способствуя формированию преметастатической ниши и метастазированию [30].

Экзосомальные микроРНК как потенциальные биомаркеры в диагностике рака легкого

G. Rabinowits и соавт. [31] указывают на то, что экзосомальные микроРНК в плазме пациентов с НМРЛ аналогичны выделяющимся из опухолевых клеток микроРНК. Данный факт может означать, что жидкая биопсия обладает мощным диагностическим потенциалом и, вероятно, может позволить проводить неинвазивную верификацию опухолевых поражений легкого, устраняя необходимость проведения травматичных процедур для получения образцов опухолевых тканей [31].

В настоящее время известно, что состав экзосомальных микроРНК различается в зависимости от подтипа НМРЛ и является потенциальным в качестве биомаркеров для диагностики, терапии и прогнозирования НМРЛ [32, 33]. Например, X. Jin и соавт. [34] удалось выделить из плазмы пациентов с ранней стадией НМРЛ экзосомальные микроРНК, которые могут быть использованы не только для ранней диагностики НМРЛ, но и для дифференциальной диагностики между АК легкого и плоскоклеточным раком (ПКР) легкого. Так, авторы исследования показали, что экзосомальными микроРНК, специфичными для АК легкого, являются miR-181-5p, miR-361-5p, miR-30a-3p и miR-30e-3p; специфичными для ПКР легкого — miR-10b-5p, miR-320b и miR-15b-5p [34].

R. Cazzoli и соавт. [35] в своем исследовании оценили 746 экзосомальных микроРНК у группы пациентов с АК легкого, пациентов с гранулемой легкого и группы здоровых лиц. Авторами были идентифицированы четыре экзосомальные микроРНК (miR-378a, miR-379, miR-139-5p и miR-200b-5p) в качестве маркеров при верификации АК легкого среди группы бывших курильщиков [35]. Кроме того, авторы обнаружили шесть микроРНК (miR-151a-5p, miR-30a-3p, miR-200b-5p, miR-629, miR-100 и miR-154-3p), которые позволили провести дифференциальную диагностику между АК и гранулемой легкого [35].

В других исследованиях авторы идентифицировали экзосомальные микроРНК, являющиеся маркерами разных стадий РЛ и его прогрессирования. Так, в исследовании Z.J. Zhang и соавт. [36] экзосомальные miR-20b-5p и miR-3187-5p были значительно снижены у пациентов с НМРЛ на ранней стадии в сравнении с контрольной группой здоровых лиц. На основании полученных результатов авторы предположили, что обе экзосомальные микроРНК могут выступать диагностическими биомаркерами ранней стадии НМРЛ. F. Grimolizzi и соавт. идентифицировали экзосомальную miR-126 как возможный диагностический биомаркер прогрессирования НМРЛ [37].

ВНВ широко распространены не только в крови, но и в других биологических жидкостях. H. Tamiya и соавт. [38] в своем исследовании показали, что экзосомальные miR-182 и miR-210 обладают диагностическим потенциалом для дифференциации плеврального выпота при АК легкого и неопухолевых процессах. P. Hydbring и соавт. [39] показали высокий диагностический потенциал экзосомальной miR-200 и транскрипта мРНК, кодирующего липокалин-2, в дифференциальной диагностике метастатического выпота у пациентов с АК легкого и реактивного выпота у пациентов с доброкачественными процессами.

Экзосомальные микроРНК как прогностические биомаркеры при раке легкого

Содержащиеся во ВНВ компоненты могут быть не только маркерами для диагностики, но и служить потенциальными прогностическими биомаркерами при РЛ [40]. D.L. Yuwen и соавт. [41] показали, что сверхэкспрессия сывороточной экзосомальной miR-146a-5p может предположить низкие показатели рецидива у пациентов с прогрессирующим НМРЛ. Более того, miR-146a-5p может повысить чувствительность клеток НМРЛ к противоопухолевому препарату цисплатину (цис-диаминдихлорплатине), блокируя экспрессию связанного с аутофагией белка 12 и ингибируя аутофагию [41]. C. Ostheimer и соавт. [42] указывают на то, что экзосомальный HSP70 может активировать врожденный иммунитет, а повышение уровня HSP70 вызывало благоприятный клинический ответ у пациентов с НМРЛ. Между тем экспрессия HSP70 коррелировала с уровнем остеопонтина (маркера, связанного с гипоксией), и у пациентов с более высокими посттерапевтическими уровнями HSP70 отмечался значительно лучший ответ на радио/химиотерапию [42].

Экзосомальные miR-1, miR-486 и miR-499, по мнению Z. Hu и соавт. [43], могут быть независимыми предикторами общей выживаемости пациентов с НМРЛ. Авторы утверждают, что экспрессия экзосомальных miR-486 изменялась в бронхоальвеолярных стволовых клетках (BASC) по сравнению с контрольными клетками. BASC, вероятно, могут трансформироваться в стволовые клетки-предшественники РЛ и в конечном итоге способствовать рецидивированию опухолевого поражения [44, 45]. Хотя уровень miR-486 в плазме пациентов значительно снижался через год после резекции опухоли, тем не менее он был выше, чем у группы здоровых лиц [46].

R. Rosell и соавт. [47] обнаружили, что повышенная экспрессия экзосомальных miR-155 и пониженная экспрессия let-7a-2 коррелировали с неблагоприятным прогнозом у пациентов с НМРЛ, при этом выживаемость пациентов с НМРЛ с высоким уровнем let-7 была лучше в сравнении с теми пациентами, у которых отмечалась низкая экспрессия let-7 [48]. В целом семейство микроРНК let-7 является супрессорами при НМРЛ [49,50].

В исследовании Q. Lin и соавт. [51] экспрессия miR-19a в опухолевых тканях пациентов с НМРЛ была значительно выше, чем в соседних нормальных тканях, а высокая сывороточная экспрессия miR-19a показала положительную корреляцию с наличием метастазов НМРЛ в лимфатических узлах. Кроме того, у группы пациентов с НМРЛ с высокой экспрессией сывороточной miR-19a отмечалась худшая общая выживаемость, чем у группы пациентов с НМРЛ и низкой экспрессией указанной микроРНК [51]. Высокая экспрессия miR-512 в ряде исследований была связана с лучшей безрецидивной выживаемостью пациентов с НМРЛ [52—54]. S. Adi и соавт. [55] в своей работе указывают на важность того, что повторная экспрессия экзосомальных miR-512 и miR-373 у пациентов с НМРЛ после терапии цисплатином может замедлить рост опухоли и противоопухолевая терапия у данных пациентов будет успешной. В исследовании R. Kanaoka и соавт. [56] показано, что экспрессия экзосомальной miR-451a коррелировала с наличием метастазов в лимфатические узлы, сосудистой инвазией и выживаемостью пациентов с НМРЛ I, II или III клинических стадий [56].

H. Dejima и соавт. [57] обнаружили, что уровни экспресии miR-21 и miR-4257 значительно повышаются у пациентов с рецидивирующим НМРЛ после хирургического лечения и предсказывают низкую выживаемость пациентов без клинических симптомов заболевания. Q. Liu и соавт. [58] изучили 83 ассоциированные с РЛ экзосомальные микроРНК и обнаружили, что девять из них присутствуют во ВНВ у пациентов с НМРЛ. При этом уровни miR-23b-3p, miR-10b-5p и miR-21-5p были повышены у пациентов с НМРЛ по сравнению с группой здоровых лиц и были связаны с низкой общей выживаемостью пациентов [58].

Экзосомальные длинные некодирующие РНК (lncРНК) как диагностические и прогностические биомаркеры немелкоклеточного рака легкого

В ряде опубликованных работ авторы утверждают, что экспрессия lncРНК является более специфичной для заболеваний в сравнении с экспрессией микроРНК [59, 60]. Появляется все больше исследований, подтверждающих роль экзосомальных lncРНК как циркулирующих биомаркеров для диагностики, прогнозирования и терапии НМРЛ [61]. lncРНК представляют собой большой и разнообразный класс транскриптов РНК длиной более 200 нуклеотидов [62—65]. Изначально lncРНК считались побочным продуктом («отходами») транскрипции генома [66], однако в последнее время появляются доказательства того, что lncРНК могут выполнять регуляторные функции и участвовать во многих биологических процессах [67]. lncРНК могут модулировать биологическую активность клеток-реципиентов, переносясь в форме экзосом [67]. lncРНК регулирует стабильность мРНК, влияя на уровень экспрессии мРНК [68], участвует в регуляции трансляционных модификаций белков [69—70].

В последнее время появляется все больше данных о том, что при различных злокачественных опухолях происходят дисфункции экзосомальных lncРНК, что влияет на рост, прогрессирование опухоли и ее резистентность к терапии [67]. В ряде исследований обнаружено, что полученные из сыворотки экзосомы, выделенные у пациентов с НМРЛ, содержат высокие уровни специфических lncРНК MALAT-1, HOTAIR, UFC1, FOXD3-AS1, GAS5, оказывающих положительное влияние на пролиферацию клеток НМРЛ, инвазию и миграцию опухолевых клеток, а также ингибирование клеточного цикла и апоптоза [71—76]. На основе полученных в исследованиях данных можно предположить, что подавление активности данных маркеров представляет собой механизм сдерживания роста и прогрессирования опухоли. Кроме того, данные маркеры могут быть одними из потенциальных для прогнозирования НМРЛ.

X. Zhang и соавт. [77] в своей работе рассматривают экзосомальную lncРНК DLX6-AS1 в качестве диагностического биомаркера НМРЛ. Авторы утверждают, что экспрессия DLX6-AS1 в экзосомах сыворотки пациентов с НМРЛ заметно выше, чем у группы здоровых лиц. В отличие от сывороточного маркера CYFRA21-1 циркулирующий DLX6-AS1 в исследовании авторов имел более высокие диагностические показатели при верификации НМРЛ [77].

D. Xiong и соавт. [78] в своей работе приводят данные о том, что экзосомальная lncРНК LINC00917 может рассматриваться как маркер для диагностики разных стадий НМРЛ в связи с тем, что в исследовании авторов уровень ее экспрессии был гораздо выше у пациентов с поздними стадиями НМРЛ (стадии III/IV), чем у пациентов на ранних стадиях НМРЛ (стадии Ⅰ/II) [78]. По сравнению с некоторыми сывороточными биомаркерами НМРЛ, включая CEA, CYFRA21-1 и CA-125, экзосомальная LINC00917 в исследовании демонстрировала больший диагностический потенциал для пациентов с распространенным НМРЛ (стадия III/IV) [78].

В исследовании Y. Tao и соавт. [79] установлено, что уровни экспрессии экзосомальных lncРНК TBILA и AGAP2-AS1 в сыворотке пациентов с НМРЛ относительно высоки по сравнению с уровнями их экспрессии у здоровых лиц, при этом уровни экспрессии обеих lncРНК снижаются после хирургического лечения пациентов. Кроме того, экзосомальная lncРНК TBILA более чувствительна при верификации ранних стадий НМРЛ (чувствительность 63,2%) в сравнении с экзосомальной lncРНК AGAP2-AS1 (чувствительность 42,1%) и CYFRA21-1 (чувствительность 36,3%) [79].

Y. Bai и соавт. [80] выявили повышенную экспрессию экзосомальных SLC9A3-AS1 и PCAT6 у пациентов с РЛ [80]. Y. Teng и соавт. в своей работе [81] указывают на то, что уровень экспрессии экзосомальной lncРНК SOX2-OT значительно повышался в плазме пациентов с ПКР легкого и снижался после хирургической резекции. Кроме того, экзосомальная SOX2-OT положительно коррелировала с клинико-патологическими параметрами, включая размер опухоли, клиническую стадию и наличие метастазов в лимфатических узлах [81].

P. Han и соавт. [82] установили повышенный уровень экспрессии экзосомальной lncРНК SNHG15 у группы пациентов с НМРЛ в сравнении с группой пациентов с доброкачественными поражениями легких и группой здоровых лиц. При этом уровень ее экспрессии снизился после хирургического лечения (резекции) опухоли. Повышенный уровень экспрессии SNHG15 демонстрировал положительную корреляцию с метастазированием НМРЛ в лимфатические узлы, поздней клинической стадией и низкой дифференцировкой опухоли. Кроме того, у группы пациентов с НМРЛ с более высокими уровнями SNHG15 отмечался неблагоприятный прогноз и низкие показатели выживаемости. Авторы приводят результаты многофакторного анализа, дополнительно подтверждающие, что SNHG15 может рассматриваться как независимый индикатор прогноза НМРЛ [82].

J. Xian и соавт. [83] определили более высокий уровень экспрессии экзосомальной lncРНК LINC01125 у группы пациентов с НМРЛ по сравнению с контрольной группой пациентов с пневмонией. Вместе с тем высокий уровень экспрессии LINC01125 был ассоциирован с поздней клинической стадией и неблагоприятным общим течением заболевания у пациентов с НМРЛ [83]. L. Min и соавт. [84] продемонстрировали результаты исследования, согласно которым у пациентов с НМРЛ высокий уровень экспрессии экзосомальной lncРНК RP5-977B1 положительно коррелировал с поздними стадиями опухолевого поражения, наличием отдаленных метастазов и низкими показателями выживаемости. На основании полученных результатов авторы полагают, что RP5-977B1 может быть потенциальным индикатором плохого прогноза у пациентов с НМРЛ [84]. L. Rao и соавт. [85] установили, что экзосомальная lncРНК HAGLR может быть индикатором для прогнозирования рецидива и метастазов у пациентов с НМРЛ в связи с обнаруженной положительной корреляцией между увеличением уровня экспрессии HAGLR и наличием метастазов в лимфатических узлах, а также клинической стадией опухолевого поражения [85]. Кроме того, авторы отмечают, что повышенный уровень HAGLR ассоциирован с увеличением частоты обнаружения циркулирующих опухолевых клеток, что подразумевает высокий диагностический потенциал комбинированного использования нескольких биомаркеров при прогнозировании у пациентов с НМРЛ [85].

Заключение

Поздняя выявляемость РЛ и низкие показатели выживаемости пациентов с РЛ предопределяют необходимость поиска альтернативных методов выявления данной патологии. Жидкая биопсия представляет собой новый перспективный метод диагностики РЛ в связи с рядом преимуществ: малая инвазивность, выбор широкого спектра экзосомальных маркеров, высокие диагностические показатели, возможность использования ВНВ при прогнозировании и терапии РЛ.

Экзосомальные некодирующие РНК рассматриваются исследователями из разных стран в качестве потенциальных биомаркеров для эффективной верификации и прогнозирования опухолевых поражений легкого. Несмотря на рост числа исследований, рассматривающих молекулярные основы и подтверждающих диагностическую и клиническую ценность данного класса РНК в диагностике РЛ, требуется проведение дальнейших исследований для уточнения конкретных наиболее эффективных, надежных маркеров для верификации РЛ. Кроме того, для внедрения в рутинную клиническую практику метода жидкой биопсии необходима разработка стандартизированных технологических решений и диагностических процедур с использованием экзосомальных маркеров.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.