Эпигенетические изменения играют не менее важную роль в канцерогенезе, чем структурные нарушения генома. К эпигенетическим относят все нарушения, которые не связаны с изменениями структуры ДНК, но приводят к изменениям уровня экспрессии генов, таким как метилирование регуляторных районов генов (промоторов), нарушения в структуре хроматина, РНК-интерференция, альтернативный сплайсинг, изменение уровня экспрессии микроРНК.

МикроРНК (miRNA) — класс некодирующих одноцепочечных РНК, имеющих длину 18—22 нуклеотида. Эти РНК играют важную роль в регуляции трансляции и деградации матричной РНК (мРНК). Регуляция осуществляется путем комплементарного связывания микроРНК с частично комплементарными сайтами в нетранслируемых участках мРНК («мишенями»). МикроРНК тканеспецифичны и играют важную роль в процессах развития и дифференцировки тканей и органов. Показано, что при различных заболеваниях, в том числе онкологических, происходят изменения уровня экспрессии микроРНК [1]. Из-за их фундаментальной роли в развитии и дифференцировке клеток, их причастности к биологическим механизмам, лежащим в основе канцерогенеза, а также их простого строения, стабильности и доступности обнаружения они представляют собой многообещающий класс биомаркеров рака.

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) является одним из самых распространенных онкологических заболеваний и одной из основных причин летального исхода у онкологических больных. Показано, что при НМРЛ различные уровни экспрессии микроРНК могут быть предиктивными и прогностическими маркерами, специфичными для определенного гистологического типа НМРЛ. Например, микроРНК miR-126, miR-31, miR-519c, let-7a, miR-133B, miR-15a, miR-16 и miR-183 участвуют в регуляции пролиферации, миграции и инвазии клеток при НМРЛ, воздействуя на специфические гены-мишени: Crk, EGFL7, VEGF, LATS2, PPP2R2A, HIF-1a, NIRF, MCL-1, BCL2L2, циклины D1, D2, E1 и Ezrin [2—4]. Согласно данным литературы, экспрессия микроРНК Has-miR-205 является специфическим маркером плоскоклеточного рака легкого [5]. Считается, что гиперэкспрессия miR-21, miR-146b, miR-155 в опухоли является неблагоприятным прогностическим маркером, ассоциированным с низкой выживаемостью пациентов НМРЛ [6]. Другие исследования показали, что снижение уровня экспрессии микроРНК let-7a и miR-34 и гиперэкспрессия miR-221, miR-137, miR-372 и miR-182 ассоциированы с рецидивом заболевания у пациентов НМРЛ [7]. Выявлено наличие микроРНК в образцах плазмы и сыворотки крови у онкологических пациентов и показано, что эти молекулы довольно стабильны даже при многократном замораживании и размораживании [8]. Циркулирующие микроРНК могут быть перспективными маркерами рака, что подтверждается большим числом исследований в этом направлении.

Согласно теории «полей канцеризации», влияние на формирование и прогрессирование опухоли имеют не только нарушения, происходящие непосредственно в потенциально злокачественных клетках-предшественницах или опухолевых клетках, но также большое значение имеют изменения в опухолевой строме и смежных нормальных тканях, так называемых полях канцеризации. С клинической точки зрения важное значение имеет тот факт, что поля канцеризации могут служить основой рецидива заболевания при локальном лечении. Следовательно, знание границ распространения морфологических и молекулярно-генетических изменений в смежной с опухолью условно нормальной ткани позволит правильно определить истинные размеры опухолевого поля в каждом конкретном случае. В нашем исследовании выявлено гиперметилирование промотора генов RASSF1A, FHIT, CDH1, CD44, TIMP3 в смежной с опухолью условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухолевого очага. Показано, что эти нарушения ассоциированы с неблагоприятным прогнозом и метастазированием [9].

Настоящее исследование посвящено определению уровня экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в НМРЛ и смежных с опухолью условно-нормальных тканях на расстоянии 2 и 5 см с целью оценки этих изменений в качестве потенциальных прогностических маркеров у пациентов с НМРЛ.

Исследование экспрессии микроРНК проводили на 57 образцах операционного материала (парафиновые блоки), полученных от 19 пациентов НМРЛ: 7 пациентов с плоскоклеточным раком легкого (ПКРЛ), 7 — с аденокарциномой легкого (АК) и 5 — с аденоплоскоклеточным раком легкого (АПКРЛ). От каждого пациента получено 3 типа ткани: опухолевая ткань, смежная условно-нормальная ткань на расстоянии 2 см и смежная условно-нормальная ткань на расстоянии 5 см от опухоли.

Для количественной оценки уровня экспрессии микроРНК использовали метод относительных определений количественных значений 2^–ΔΔCt. В качестве эндогенного контроля принимали значения экспрессии малой ядерной РНК RNU6. Количественное определение экспрессии микроРНК в исследуемых тканях проводили относительно уровня экспрессии этих микроРНК в калибраторе, который был выбран экспериментальным путем. В качестве калибратора изначально использовали следующие образцы: смежную условно нормальную ткань на расстоянии 5 см от опухоли, морфологически неизмененную ткань легкого пациентов с другими онкологическими заболеваниями, морфологически неизмененную ткань легкого пациентов с неспецифическими хроническими заболеваниями легких (НХЗЛ). Лучшая воспроизводимость и робастность результатов показана для группы пациентов с НХЗЛ. Таким образом, в нашем исследовании в качестве калибратора использовали образцы морфологически нормальной ткани, полученной от пациентов с НХЗЛ. Для оценки воспроизводимости полученных результатов каждый образец исследовали в трех параллелях. Всего в каждой группе исследовали 15 образцов.

Выделение микроРНК проводили с помощью колонок с абсорбирующей мембраной по протоколам коммерческого набора miRNeasy FFPE Kit («Qiagen», Германия).

Обратную транскрипцию микроРНК проводили c помощью полиаденилирования 3’-конца микроРНК и последующего праймирования олиго-dT праймерами, которые на своем 3’-конце имеют дегенеративный анкер, а на 5’-конце — универсальную концевую последовательность по протоколам коммерческого набора miScript II RT Kit («Qiagen», Германия).

Определение экспрессии «зрелых» микроРНК проводили с помощью микроРНК-специфичных праймеров miScript Primer Assay по протоколам коммерческого набора miScript SYBR Green PCR Kit на приборе Rotor-Gene Q 5plex HRM («Qiagen», Германия).

Обсчет полученных результатов проводили следующим образом. Для каждой пробы вычисляли значение Log2 2^–ΔΔCt. После этого высчитывали среднее значение и стандартную ошибку. Для статистической обработки результатов применяли одноконцевой парный и непарный тесты Стьюдента. За статистически достоверный результат принимали значение критерия p<0,05. Для выявления статистически значимых ассоциаций полученных результатов экспрессии микроРНК с клинико-морфологическими параметрами пациентов последних делили на группы по возрасту, стадии процесса, гистологическому типу и степени дифференцировки опухоли. Средний возраст пациентов составил 63 года.

Проведен анализ экспрессии микроРНК: let-7a, miR-155, miR-205 у пациентов НМРЛ в опухолевой ткани и смежной с опухолью нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от очага с помощью ПЦР в режиме реального времени.

На рис. 1 представлены значения уровней экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухолевой ткани, в опухоли экспрессия let-7a снижена у большинства пациентов. Однако для двух других микроРНК (miR-155, miR-205) изменение уровня экспрессии не столь очевидно, поэтому вычисляли среднее значение экспрессии со стандартной ошибкой для каждой микроРНК в исследуемых типах ткани.

Анализ экспрессии трех микроРНК во всех исследуемых образцах показал, что уровень экспрессии микроРНК let-7a значительно снижен в опухоли по сравнению с условно нормальной тканью как на расстоянии 2 см (р=0,025), так и на расстоянии 5 см (p=0,012) от опухоли (рис. 2). Статистически достоверных изменений уровня экспрессии miR-155, miR-205 в опухоли относительно смежной условно-нормальной ткани не выявлено.

По гистологическому типу опухоли выделяли 3 группы НМРЛ: ПКРЛ (рис. 3, а), АК (см. рис. 3, б) и АПКРЛ.

В выделенных группах сравнивали средние значения экспрессии исследуемых микроРНК в опухолевой ткани и смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии. Статистически значимых различий между экспрессией микроРНК в разных гистологических типах не выявлено.

При разделении пациентов по возрасту получены 2 группы: пациенты моложе 63 лет и старше 63 лет. Анализ экспрессии микроРНК в группе пациентов старше 63 лет не показал различий в уровне экспрессии исследуемых микроРНК между опухолью и смежной условно-нормальной тканью, в то время как в группе пациентов моложе 63 выявлены достоверные различия. В группе пациентов моложе 63 лет в опухолевой ткани экспрессия микроРНК let-7a и miR-155 значительно снижена (p=0,015; p=0,048 соответственно) по сравнению со смежной условно нормальной тканью (рис. 4).

Одним из критериев злокачественности новообразования является стадия опухолевого процесса. По стадии опухолевого процесса выделено 2 группы: пациенты с НМРЛ I—II стадии и III—IV стадии заболевания. Выявлено снижение уровня экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 (p=0,03; p=0,023 соответственно) в опухолевой ткани относительно смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см в группе пациентов при III—IV стадии заболевания (рис. 5). При I—II стадии заболевания достоверных изменений уровня экспрессии исследуемых микроРНК не обнаружено.

При разделении пациентов по степени дифференцировки опухоли выделено 2 группы: дифференцированные (высоко- и умереннодифференцированные) и низкодифференцированные опухоли. В выделенных группах проводили анализ экспрессии исследуемых микроРНК во всех образцах тканей (опухолевой и смежной условно нормальной). В группе дифференцированных опухолей не выявлено статистически значимых изменений экспрессии исследуемых микроРНК.

Показано, что уровень экспрессии микроРНК let-7a в низкодифференцированных опухолях снижен значительно сильнее (p=0,013) по сравнению со смежной условно-нормальной тканью на расстоянии 5 см (рис. 6). Снижение экспрессии микроРНК let-7a относительно смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 2 см статистически незначимо, однако наблюдается явная тенденция (p=0,06) и, вероятно, при увеличении выборки возможно появление достоверных различий. Для miR-155 и miR-205 достоверной разницы экспрессии в опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани в выделенной группе не выявлено.

Для оценки изменения уровня экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в зависимости от статуса курения выделены 2 группы: курящие и некурящие пациенты. Проводили сравнительный анализ данных экспрессии микроРНК в образцах опухоли и образцах смежной условно нормальной ткани в выделенных группах. В группе курящих пациентов не выявлено статистически значимых различий экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в опухоли и смежной ткани.

В группе некурящих пациентов экспрессия микроРНК let-7a значительно снижена (p=0,044) в опухолевой ткани относительно смежной нормальной ткани (рис. 7). В этой группе не выявлено достоверных различий экспрессии микроРНК miR-155, miR-205.

Проведен сравнительный анализ экспрессии исследуемых микроРНК в образцах смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли. Выявлено, что для микроРНК let-7a и miR-155 в ряду опухоль — смежная с опухолью ткань на расстоянии 2 см — смежная с опухолью ткань на расстоянии 5 см происходит увеличение среднего значения экспрессии (рис. 8).

Сравнивали также и средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в образцах смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли во всех выделенных клинико-морфологических группах пациентов: по гистологическому типу (АК, ПКРЛ, АПКРЛ), возрасту (моложе и старше 63 лет), стадии заболевания (I—II стадия и III—IV стадия), статусу курения (курящие и некурящие пациенты), степени дифференцировки опухоли (дифференцированные и низкодифференцированные).

Выявлены достоверные различия экспрессии исследуемых микроРНК в смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли в зависимости от степени дифференцировки опухоли и статуса курения. В остальных группах статистически значимых различий экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 не выявлено.

На рис. 9 представлены средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли в группах курящих и некурящих пациентов. На рис. 9 видно, что экспрессия let-7a достоверно ниже (p=0,038) в смежной нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли у курящих пациентов.

Разница средних значений экспрессии для miR-155 в смежной нормальной ткани в группах курящих/некурящих пациентов недостоверна, однако определенно существует тенденция к статистической значимости подобных различий (p=0,07). Для miR-205 статистически достоверные различия в экспрессии не выявлены.

На рис. 10 представлены средние значения экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли в группах пациентов с дифференцированными и низкодифференцированными опухолями.

Анализ показал, что смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см в группах пациентов с дифференцированными и низкодифференцированными опухолями имеет противоположные профили экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 (см. рис. 10). У пациентов с дифференцированными опухолями уровень экспрессии исследуемых микроРНК снижен, а в группе пациентов с низкодифференцированным уровень экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205, наоборот, повышен. Статистически значимыми оказались различия в значениях экспрессии miR-155 (p=0,046) и miR-205 (p=0,043) в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли между выделенными группами пациентов.

МикроРНК let-7a — микроРНК, кодирующая последовательность, которая располагается в регионе 9q22.32, принадлежащая к группе микроРНК let-7. Впервые экспрессия этой микроРНК выявлена у Caenorhabditis elegans в качестве регулятора клеточного цикла [10]. Let-7 является негативным регулятором многочисленных онкогенов, таких как RAS, MYC, HMGA2, и регуляторов клеточного цикла CDC25A, CDK6 и циклин D2 [11, 12]. В работах по исследованию функций let-7 у человека показано, что микроРНК этой группы имеет функции супрессора опухоли. При раке легкого выявлены частые повреждения хромосомных регионов, где располагаются кодирующие последовательности микроРНК этой группы [13]. В работах на клеточных линиях НМРЛ показано, что экспрессия let-7a ассоциирована с ингибированием пролиферации и инвазии опухолевых клеток путем регуляции трансляции таких генов, как KRAS и HMGA2 [14]. В работе C. Johnson и соавт. [12] показано, что гиперэкспрессия let-7a ингибирует рост клеток и тормозит клеточный цикл, а интраназальное применение let-7 на ксенографтных мышиных моделях подавляет рост аденокарциномы легкого [15]. Показано, что при НМРЛ экспрессия let-7а снижена [16]. Кроме того, уменьшение экспрессии let-7a у пациентов с НМРЛ ассоциировано с неблагоприятным прогнозом [6]. В нашей работе экспрессия микроРНК let-7a в опухолевой ткани снижена по сравнению со смежной с опухолью нормальной тканью на расстоянии 2 и 5 см.

МикроРНК MiR-155 — микроРНК, которая кодируется геном домашнего хозяйства mir155 и располагается в районе 21q21.3. mir155, впервые обнаружена в B-клеточных лимфомах [17]. Показано, что в норме miR-155 экспрессируется в активированных B- и T-лимфоцитах, а также в моноцитах/макрофагах [18]. В настоящее время miR-155 является одной из самых изученных микроРНК в молекулярной биологии, и результаты последних исследований показывают, что miR-155 играет важную роль в многочисленных физиологических и патологических процессах, таких как гемопоэтическая дифференцировка клеток, иммунный ответ, воспаление, онкологические и сердечно-сосудистые заболевания, синдром Дауна [18]. Выявлено, что мишенями miR-155 являются около 140 генов, среди них гены, участвующие в процессах гемопоэза (AICDA, ETS1, JARID2, SPI1), воспаления (BACH1, FADD, IKBKE, INPP5D, MYD88, RIPK1, SPI1, SOCS) и гены-супрессоры опухолевого роста (CEBPβ, IL17RB, PCCD4, TCF12, ZNF652, TP53INP1) [19]. Показано, что НМРЛ характеризуется гиперэкспрессией микроРНК miR-155 [6]. В исследовании N. Yanaihara и соавт. [6] выявлено, что высокий уровень экспрессии miR-155 и низкий уровень экспрессии let-7a коррелируют со снижением средней выживаемости пациентов с аденокарциномой легкого. Показано, что гиперэкспрессия miR-155 и miR-146 ассоциирована со снижением выживаемости при плоскоклеточном НМРЛ. В нашем исследовании наблюдается снижение экспрессии микроРНК miR-155 в опухоли по сравнению со смежной с опухолью условно-нормальной тканью.

Кодирующая последовательность микроРНК miR-205 находится в хромосомном локусе 1q32.2. Впервые экспрессия этой микроРНК выявлена у рыб и мышей. Показано, что miR-205 участвует в процессах клеточной дифференцировки, пролиферации и апоптозе. Мишенями miR-205 являются такие гены, как PTEN, ERBB3, E2F1, E2F5, ZEB1, ZEB2, VEGF-A, IL24, IL32. Гиперэкспрессия miR-205 показана для клеточных линий опухолей головы и шеи по сравнению с опухолями легкого, молочной железы, простаты и колоректального рака [20]. У пациентов с НМРЛ выявлена гиперэкспрессия miR-205. В ряде работ показано, что гиперэкспрессия miR-205 характерна для плоскоклеточного НМРЛ с чувствительностью и специфичностью 96 и 90% соответственно [5]. В нашей работе экспрессия микроРНК miR-205 увеличена по сравнению со смежной с опухолью морфологически нормальной тканью, однако статистически достоверных различий не выявлено так же, как и возможных ассоциаций с клинико-морфологическими параметрами пациентов.

Мы не нашли работ, характеризующих профили экспрессии микроРНК в смежных с опухолью условно-нормальных тканях при НМРЛ. Следовательно, сравнить полученные результаты по экспрессии исследуемых микроРНК в смежной с опухолью нормальной ткани на расстоянии 5 см не представляется возможным.

Проведенное исследование показало, что, во-первых, экспрессия let-7a снижена в опухолевой ткани относительно смежной условно-нормальной ткани. Во-вторых, снижение уровня экспрессии let-7a и miR-155 в опухоли характерно для относительно молодых (моложе 63 лет), не курящих пациентов, поздней стадии опухолевого процесса, низкодифференцированных опухолей. В-третьих, уровни экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в смежных с опухолью условно-нормальных тканях на расстоянии 5 см различны в группах курящих и некурящих пациентов, пациентов с различной дифференцировкой опухоли. Показано, что у относительно молодых пациентов онкологические заболевания обычно протекают более агрессивно, чем у пациентов старшего возраста. Это явление может объяснить тот факт, что в нашем исследовании снижение уровня экспрессии микроРНК, выполняющих функции супрессоров опухоли, let-7a и miR155 в опухолевой ткани ассоциировано с молодым возрастом, III—IV стадией заболевания и низкой степенью дифференцировки. Результаты нашего исследования показывают обратную корреляцию между уровнем экспрессии двух микроРНК (в большей степени let-7a, в меньшей — miR-155) и злокачественностью опухолевого процесса. Этот факт позволяет предположить использование микроРНК let-7a и miR-155 в перспективе в качестве прогностических маркеров опухоли, вероятно, свидетельствующих о неблагоприятном прогнозе.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Г. А.Ф., Д.В.З., А.А.Ш., Т.В.К.

Сбор и обработка материала: А.А.Ш., Т.В.К., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Статистическая обработка: А.А.Ш., Т.В.К.

Написание текста: А.А.Ш., Т.В.К.

Редактирование: Г. А.Ф., Д.В.З., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Конфликт интересов отсутствует.