Шикеева А.А.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздрава России

Кекеева Т.В.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздрава России

Завалишина Л.Э.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздравсоцразвития России

Андреева Ю.Ю.

ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России

Залетаев Д.В.

Лаборатория молекулярной генетики человека НИИ молекулярной медицины Первого московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова

Франк Г.А.

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий, Москва

Экспрессия микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухолевой и смежной морфологически нормальной ткани у пациентов немелкоклеточным раком легкого

Журнал: Архив патологии. 2016;78(3): 3-10

Просмотров : 61

Загрузок :

Как цитировать

Шикеева А. А., Кекеева Т. В., Завалишина Л. Э., Андреева Ю. Ю., Залетаев Д. В., Франк Г. А. Экспрессия микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухолевой и смежной морфологически нормальной ткани у пациентов немелкоклеточным раком легкого. Архив патологии. 2016;78(3):3-10. https://doi.org/10.17116/patol20167833-10

Авторы:

Шикеева А.А.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздрава России

Все авторы (6)

Эпигенетические изменения играют не менее важную роль в канцерогенезе, чем структурные нарушения генома. К эпигенетическим относят все нарушения, которые не связаны с изменениями структуры ДНК, но приводят к изменениям уровня экспрессии генов, таким как метилирование регуляторных районов генов (промоторов), нарушения в структуре хроматина, РНК-интерференция, альтернативный сплайсинг, изменение уровня экспрессии микроРНК.

МикроРНК (miRNA) — класс некодирующих одноцепочечных РНК, имеющих длину 18—22 нуклеотида. Эти РНК играют важную роль в регуляции трансляции и деградации матричной РНК (мРНК). Регуляция осуществляется путем комплементарного связывания микроРНК с частично комплементарными сайтами в нетранслируемых участках мРНК («мишенями»). МикроРНК тканеспецифичны и играют важную роль в процессах развития и дифференцировки тканей и органов. Показано, что при различных заболеваниях, в том числе онкологических, происходят изменения уровня экспрессии микроРНК [1]. Из-за их фундаментальной роли в развитии и дифференцировке клеток, их причастности к биологическим механизмам, лежащим в основе канцерогенеза, а также их простого строения, стабильности и доступности обнаружения они представляют собой многообещающий класс биомаркеров рака.

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) является одним из самых распространенных онкологических заболеваний и одной из основных причин летального исхода у онкологических больных. Показано, что при НМРЛ различные уровни экспрессии микроРНК могут быть предиктивными и прогностическими маркерами, специфичными для определенного гистологического типа НМРЛ. Например, микроРНК miR-126, miR-31, miR-519c, let-7a, miR-133B, miR-15a, miR-16 и miR-183 участвуют в регуляции пролиферации, миграции и инвазии клеток при НМРЛ, воздействуя на специфические гены-мишени: Crk, EGFL7, VEGF, LATS2, PPP2R2A, HIF-1a, NIRF, MCL-1, BCL2L2, циклины D1, D2, E1 и Ezrin [2—4]. Согласно данным литературы, экспрессия микроРНК Has-miR-205 является специфическим маркером плоскоклеточного рака легкого [5]. Считается, что гиперэкспрессия miR-21, miR-146b, miR-155 в опухоли является неблагоприятным прогностическим маркером, ассоциированным с низкой выживаемостью пациентов НМРЛ [6]. Другие исследования показали, что снижение уровня экспрессии микроРНК let-7a и miR-34 и гиперэкспрессия miR-221, miR-137, miR-372 и miR-182 ассоциированы с рецидивом заболевания у пациентов НМРЛ [7]. Выявлено наличие микроРНК в образцах плазмы и сыворотки крови у онкологических пациентов и показано, что эти молекулы довольно стабильны даже при многократном замораживании и размораживании [8]. Циркулирующие микроРНК могут быть перспективными маркерами рака, что подтверждается большим числом исследований в этом направлении.

Согласно теории «полей канцеризации», влияние на формирование и прогрессирование опухоли имеют не только нарушения, происходящие непосредственно в потенциально злокачественных клетках-предшественницах или опухолевых клетках, но также большое значение имеют изменения в опухолевой строме и смежных нормальных тканях, так называемых полях канцеризации. С клинической точки зрения важное значение имеет тот факт, что поля канцеризации могут служить основой рецидива заболевания при локальном лечении. Следовательно, знание границ распространения морфологических и молекулярно-генетических изменений в смежной с опухолью условно нормальной ткани позволит правильно определить истинные размеры опухолевого поля в каждом конкретном случае. В нашем исследовании выявлено гиперметилирование промотора генов RASSF1A, FHIT, CDH1, CD44, TIMP3 в смежной с опухолью условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухолевого очага. Показано, что эти нарушения ассоциированы с неблагоприятным прогнозом и метастазированием [9].

Настоящее исследование посвящено определению уровня экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в НМРЛ и смежных с опухолью условно-нормальных тканях на расстоянии 2 и 5 см с целью оценки этих изменений в качестве потенциальных прогностических маркеров у пациентов с НМРЛ.

Материал и методы

Исследование экспрессии микроРНК проводили на 57 образцах операционного материала (парафиновые блоки), полученных от 19 пациентов НМРЛ: 7 пациентов с плоскоклеточным раком легкого (ПКРЛ), 7 — с аденокарциномой легкого (АК) и 5 — с аденоплоскоклеточным раком легкого (АПКРЛ). От каждого пациента получено 3 типа ткани: опухолевая ткань, смежная условно-нормальная ткань на расстоянии 2 см и смежная условно-нормальная ткань на расстоянии 5 см от опухоли.

Для количественной оценки уровня экспрессии микроРНК использовали метод относительных определений количественных значений 2ΔΔCt. В качестве эндогенного контроля принимали значения экспрессии малой ядерной РНК RNU6. Количественное определение экспрессии микроРНК в исследуемых тканях проводили относительно уровня экспрессии этих микроРНК в калибраторе, который был выбран экспериментальным путем. В качестве калибратора изначально использовали следующие образцы: смежную условно нормальную ткань на расстоянии 5 см от опухоли, морфологически неизмененную ткань легкого пациентов с другими онкологическими заболеваниями, морфологически неизмененную ткань легкого пациентов с неспецифическими хроническими заболеваниями легких (НХЗЛ). Лучшая воспроизводимость и робастность результатов показана для группы пациентов с НХЗЛ. Таким образом, в нашем исследовании в качестве калибратора использовали образцы морфологически нормальной ткани, полученной от пациентов с НХЗЛ. Для оценки воспроизводимости полученных результатов каждый образец исследовали в трех параллелях. Всего в каждой группе исследовали 15 образцов.

Выделение микроРНК проводили с помощью колонок с абсорбирующей мембраной по протоколам коммерческого набора miRNeasy FFPE Kit («Qiagen», Германия).

Обратную транскрипцию микроРНК проводили c помощью полиаденилирования 3’-конца микроРНК и последующего праймирования олиго-dT праймерами, которые на своем 3’-конце имеют дегенеративный анкер, а на 5’-конце — универсальную концевую последовательность по протоколам коммерческого набора miScript II RT Kit («Qiagen», Германия).

Определение экспрессии «зрелых» микроРНК проводили с помощью микроРНК-специфичных праймеров miScript Primer Assay по протоколам коммерческого набора miScript SYBR Green PCR Kit на приборе Rotor-Gene Q 5plex HRM («Qiagen», Германия).

Обсчет полученных результатов проводили следующим образом. Для каждой пробы вычисляли значение Log2 2–ΔΔCt. После этого высчитывали среднее значение и стандартную ошибку. Для статистической обработки результатов применяли одноконцевой парный и непарный тесты Стьюдента. За статистически достоверный результат принимали значение критерия p<0,05. Для выявления статистически значимых ассоциаций полученных результатов экспрессии микроРНК с клинико-морфологическими параметрами пациентов последних делили на группы по возрасту, стадии процесса, гистологическому типу и степени дифференцировки опухоли. Средний возраст пациентов составил 63 года.

Результаты и обсуждение

Проведен анализ экспрессии микроРНК: let-7a, miR-155, miR-205 у пациентов НМРЛ в опухолевой ткани и смежной с опухолью нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от очага с помощью ПЦР в режиме реального времени.

На рис. 1 представлены значения уровней экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухолевой ткани, в опухоли экспрессия let-7a снижена у большинства пациентов. Однако для двух других микроРНК (miR-155, miR-205) изменение уровня экспрессии не столь очевидно, поэтому вычисляли среднее значение экспрессии со стандартной ошибкой для каждой микроРНК в исследуемых типах ткани.

Рис. 1. Экспрессия микроРНК у пациентов НМРЛ. Представлены значения уровней экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухолевой ткани. По оси абсцисс: цифры — номер пациента в исследовании; Т — опухолевая ткань.

Анализ экспрессии трех микроРНК во всех исследуемых образцах показал, что уровень экспрессии микроРНК let-7a значительно снижен в опухоли по сравнению с условно нормальной тканью как на расстоянии 2 см (р=0,025), так и на расстоянии 5 см (p=0,012) от опухоли (рис. 2). Статистически достоверных изменений уровня экспрессии miR-155, miR-205 в опухоли относительно смежной условно-нормальной ткани не выявлено.

Рис. 2. Экспрессия микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в исследуемых тканях. * — p<0,05; представлены средние значения экспрессии микроРНК со стандартной ошибкой, указанной на гистограмме опухоли и смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см.

По гистологическому типу опухоли выделяли 3 группы НМРЛ: ПКРЛ (рис. 3, а), АК (см. рис. 3, б) и АПКРЛ.

Рис. 3. Гистологические препараты. а — плоскоклеточный рак легкого; б — аденокарцинома легкого. Окраска гематоксилином и эозином. ×200.

В выделенных группах сравнивали средние значения экспрессии исследуемых микроРНК в опухолевой ткани и смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии. Статистически значимых различий между экспрессией микроРНК в разных гистологических типах не выявлено.

При разделении пациентов по возрасту получены 2 группы: пациенты моложе 63 лет и старше 63 лет. Анализ экспрессии микроРНК в группе пациентов старше 63 лет не показал различий в уровне экспрессии исследуемых микроРНК между опухолью и смежной условно-нормальной тканью, в то время как в группе пациентов моложе 63 выявлены достоверные различия. В группе пациентов моложе 63 лет в опухолевой ткани экспрессия микроРНК let-7a и miR-155 значительно снижена (p=0,015; p=0,048 соответственно) по сравнению со смежной условно нормальной тканью (рис. 4).

Рис. 4. Экспрессия микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 у пациентов НМРЛ моложе 63 лет. * — p<0,05; представлены средние значения уровней экспрессии микроРНК у пациентов моложе 63 лет в опухоли и смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см.

Одним из критериев злокачественности новообразования является стадия опухолевого процесса. По стадии опухолевого процесса выделено 2 группы: пациенты с НМРЛ I—II стадии и III—IV стадии заболевания. Выявлено снижение уровня экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 (p=0,03; p=0,023 соответственно) в опухолевой ткани относительно смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см в группе пациентов при III—IV стадии заболевания (рис. 5). При I—II стадии заболевания достоверных изменений уровня экспрессии исследуемых микроРНК не обнаружено.

Рис. 5. Экспрессия исследуемых микроРНК у пациентов НМРЛ III—IV стадии НМРЛ. * — p<0,05; представлены средние значения экспрессии микроРНК в let-7a, miR-155, miR-205 в опухоли и смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см.

При разделении пациентов по степени дифференцировки опухоли выделено 2 группы: дифференцированные (высоко- и умереннодифференцированные) и низкодифференцированные опухоли. В выделенных группах проводили анализ экспрессии исследуемых микроРНК во всех образцах тканей (опухолевой и смежной условно нормальной). В группе дифференцированных опухолей не выявлено статистически значимых изменений экспрессии исследуемых микроРНК.

Показано, что уровень экспрессии микроРНК let-7a в низкодифференцированных опухолях снижен значительно сильнее (p=0,013) по сравнению со смежной условно-нормальной тканью на расстоянии 5 см (рис. 6). Снижение экспрессии микроРНК let-7a относительно смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 2 см статистически незначимо, однако наблюдается явная тенденция (p=0,06) и, вероятно, при увеличении выборки возможно появление достоверных различий. Для miR-155 и miR-205 достоверной разницы экспрессии в опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани в выделенной группе не выявлено.

Рис. 6. Экспрессия микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в низкодифференцированных опухолях у пациентов НМРЛ. * — p<0,05; представлены средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухоли и смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см.

Для оценки изменения уровня экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в зависимости от статуса курения выделены 2 группы: курящие и некурящие пациенты. Проводили сравнительный анализ данных экспрессии микроРНК в образцах опухоли и образцах смежной условно нормальной ткани в выделенных группах. В группе курящих пациентов не выявлено статистически значимых различий экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в опухоли и смежной ткани.

В группе некурящих пациентов экспрессия микроРНК let-7a значительно снижена (p=0,044) в опухолевой ткани относительно смежной нормальной ткани (рис. 7). В этой группе не выявлено достоверных различий экспрессии микроРНК miR-155, miR-205.

Рис. 7. Средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухолях у некурящих пациентов. * — p<0,05; представлены средние значения экспрессии исследуемых микроРНК со стандартной ошибкой в опухоли и смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см.

Определение уровня экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в смежной с опухолью условно-нормальной ткани на различном расстоянии

Проведен сравнительный анализ экспрессии исследуемых микроРНК в образцах смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли. Выявлено, что для микроРНК let-7a и miR-155 в ряду опухоль — смежная с опухолью ткань на расстоянии 2 см — смежная с опухолью ткань на расстоянии 5 см происходит увеличение среднего значения экспрессии (рис. 8).

Рис. 8. Среднее значение экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 во всех исследуемых образцах. Tumor — опухолевая ткань; 2 и 5 см — смежная условно-нормальная ткань на расстоянии 2 и 5 см соответственно; круги — уровень экспрессии.

Сравнивали также и средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в образцах смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли во всех выделенных клинико-морфологических группах пациентов: по гистологическому типу (АК, ПКРЛ, АПКРЛ), возрасту (моложе и старше 63 лет), стадии заболевания (I—II стадия и III—IV стадия), статусу курения (курящие и некурящие пациенты), степени дифференцировки опухоли (дифференцированные и низкодифференцированные).

Выявлены достоверные различия экспрессии исследуемых микроРНК в смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли в зависимости от степени дифференцировки опухоли и статуса курения. В остальных группах статистически значимых различий экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 не выявлено.

На рис. 9 представлены средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли в группах курящих и некурящих пациентов. На рис. 9 видно, что экспрессия let-7a достоверно ниже (p=0,038) в смежной нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли у курящих пациентов.

Рис. 9. Средние значения экспрессии микроРНК в смежной ткани на расстоянии 5 см в группах курящих и некурящих пациентов. * — p<0,05.

Разница средних значений экспрессии для miR-155 в смежной нормальной ткани в группах курящих/некурящих пациентов недостоверна, однако определенно существует тенденция к статистической значимости подобных различий (p=0,07). Для miR-205 статистически достоверные различия в экспрессии не выявлены.

На рис. 10 представлены средние значения экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в смежной условно-нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли в группах пациентов с дифференцированными и низкодифференцированными опухолями.

Рис. 10. Средние значения экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в смежной ткани на расстоянии 5 см в дифференцированных и низкодифференцированных опухолях. * — p<0,05.

Анализ показал, что смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см в группах пациентов с дифференцированными и низкодифференцированными опухолями имеет противоположные профили экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 (см. рис. 10). У пациентов с дифференцированными опухолями уровень экспрессии исследуемых микроРНК снижен, а в группе пациентов с низкодифференцированным уровень экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205, наоборот, повышен. Статистически значимыми оказались различия в значениях экспрессии miR-155 (p=0,046) и miR-205 (p=0,043) в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли между выделенными группами пациентов.

МикроРНК let-7a — микроРНК, кодирующая последовательность, которая располагается в регионе 9q22.32, принадлежащая к группе микроРНК let-7. Впервые экспрессия этой микроРНК выявлена у Caenorhabditis elegans в качестве регулятора клеточного цикла [10]. Let-7 является негативным регулятором многочисленных онкогенов, таких как RAS, MYC, HMGA2, и регуляторов клеточного цикла CDC25A, CDK6 и циклин D2 [11, 12]. В работах по исследованию функций let-7 у человека показано, что микроРНК этой группы имеет функции супрессора опухоли. При раке легкого выявлены частые повреждения хромосомных регионов, где располагаются кодирующие последовательности микроРНК этой группы [13]. В работах на клеточных линиях НМРЛ показано, что экспрессия let-7a ассоциирована с ингибированием пролиферации и инвазии опухолевых клеток путем регуляции трансляции таких генов, как KRAS и HMGA2 [14]. В работе C. Johnson и соавт. [12] показано, что гиперэкспрессия let-7a ингибирует рост клеток и тормозит клеточный цикл, а интраназальное применение let-7 на ксенографтных мышиных моделях подавляет рост аденокарциномы легкого [15]. Показано, что при НМРЛ экспрессия let-7а снижена [16]. Кроме того, уменьшение экспрессии let-7a у пациентов с НМРЛ ассоциировано с неблагоприятным прогнозом [6]. В нашей работе экспрессия микроРНК let-7a в опухолевой ткани снижена по сравнению со смежной с опухолью нормальной тканью на расстоянии 2 и 5 см.

МикроРНК MiR-155 — микроРНК, которая кодируется геном домашнего хозяйства mir155 и располагается в районе 21q21.3. mir155, впервые обнаружена в B-клеточных лимфомах [17]. Показано, что в норме miR-155 экспрессируется в активированных B- и T-лимфоцитах, а также в моноцитах/макрофагах [18]. В настоящее время miR-155 является одной из самых изученных микроРНК в молекулярной биологии, и результаты последних исследований показывают, что miR-155 играет важную роль в многочисленных физиологических и патологических процессах, таких как гемопоэтическая дифференцировка клеток, иммунный ответ, воспаление, онкологические и сердечно-сосудистые заболевания, синдром Дауна [18]. Выявлено, что мишенями miR-155 являются около 140 генов, среди них гены, участвующие в процессах гемопоэза (AICDA, ETS1, JARID2, SPI1), воспаления (BACH1, FADD, IKBKE, INPP5D, MYD88, RIPK1, SPI1, SOCS) и гены-супрессоры опухолевого роста (CEBPβ, IL17RB, PCCD4, TCF12, ZNF652, TP53INP1) [19]. Показано, что НМРЛ характеризуется гиперэкспрессией микроРНК miR-155 [6]. В исследовании N. Yanaihara и соавт. [6] выявлено, что высокий уровень экспрессии miR-155 и низкий уровень экспрессии let-7a коррелируют со снижением средней выживаемости пациентов с аденокарциномой легкого. Показано, что гиперэкспрессия miR-155 и miR-146 ассоциирована со снижением выживаемости при плоскоклеточном НМРЛ. В нашем исследовании наблюдается снижение экспрессии микроРНК miR-155 в опухоли по сравнению со смежной с опухолью условно-нормальной тканью.

Кодирующая последовательность микроРНК miR-205 находится в хромосомном локусе 1q32.2. Впервые экспрессия этой микроРНК выявлена у рыб и мышей. Показано, что miR-205 участвует в процессах клеточной дифференцировки, пролиферации и апоптозе. Мишенями miR-205 являются такие гены, как PTEN, ERBB3, E2F1, E2F5, ZEB1, ZEB2, VEGF-A, IL24, IL32. Гиперэкспрессия miR-205 показана для клеточных линий опухолей головы и шеи по сравнению с опухолями легкого, молочной железы, простаты и колоректального рака [20]. У пациентов с НМРЛ выявлена гиперэкспрессия miR-205. В ряде работ показано, что гиперэкспрессия miR-205 характерна для плоскоклеточного НМРЛ с чувствительностью и специфичностью 96 и 90% соответственно [5]. В нашей работе экспрессия микроРНК miR-205 увеличена по сравнению со смежной с опухолью морфологически нормальной тканью, однако статистически достоверных различий не выявлено так же, как и возможных ассоциаций с клинико-морфологическими параметрами пациентов.

Мы не нашли работ, характеризующих профили экспрессии микроРНК в смежных с опухолью условно-нормальных тканях при НМРЛ. Следовательно, сравнить полученные результаты по экспрессии исследуемых микроРНК в смежной с опухолью нормальной ткани на расстоянии 5 см не представляется возможным.

Заключение

Проведенное исследование показало, что, во-первых, экспрессия let-7a снижена в опухолевой ткани относительно смежной условно-нормальной ткани. Во-вторых, снижение уровня экспрессии let-7a и miR-155 в опухоли характерно для относительно молодых (моложе 63 лет), не курящих пациентов, поздней стадии опухолевого процесса, низкодифференцированных опухолей. В-третьих, уровни экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в смежных с опухолью условно-нормальных тканях на расстоянии 5 см различны в группах курящих и некурящих пациентов, пациентов с различной дифференцировкой опухоли. Показано, что у относительно молодых пациентов онкологические заболевания обычно протекают более агрессивно, чем у пациентов старшего возраста. Это явление может объяснить тот факт, что в нашем исследовании снижение уровня экспрессии микроРНК, выполняющих функции супрессоров опухоли, let-7a и miR155 в опухолевой ткани ассоциировано с молодым возрастом, III—IV стадией заболевания и низкой степенью дифференцировки. Результаты нашего исследования показывают обратную корреляцию между уровнем экспрессии двух микроРНК (в большей степени let-7a, в меньшей — miR-155) и злокачественностью опухолевого процесса. Этот факт позволяет предположить использование микроРНК let-7a и miR-155 в перспективе в качестве прогностических маркеров опухоли, вероятно, свидетельствующих о неблагоприятном прогнозе.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Г. А.Ф., Д.В.З., А.А.Ш., Т.В.К.

Сбор и обработка материала: А.А.Ш., Т.В.К., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Статистическая обработка: А.А.Ш., Т.В.К.

Написание текста: А.А.Ш., Т.В.К.

Редактирование: Г. А.Ф., Д.В.З., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail