Расстригина И.М.

Лаборатория патологии женской репродуктивной системы ФГБУ "НИИ морфологии человека" РАМН, Москва

Милованов А.П.

Лаборатория патологии женской репродуктивной системы НИИ морфологии человека РАМН, Москва

Фокина Т.В.

Лаборатория патологии женской репродуктивной системы ФГБУ "НИИ морфологии человека" РАМН, Москва

Кадыров М.

Медицинский факультет Института анатомии и клеточной биологии г. Аахена

Интенсивность экспрессии металлопротеиназ 2-го и 9-го типов клетками инвазивного трофобласта при неосложненной беременности и преэклампсии

Журнал: Архив патологии. 2014;76(3): 24-29

Просмотров : 8

Загрузок :

Как цитировать

Расстригина И. М., Милованов А. П., Фокина Т. В., Кадыров М. Интенсивность экспрессии металлопротеиназ 2-го и 9-го типов клетками инвазивного трофобласта при неосложненной беременности и преэклампсии. Архив патологии. 2014;76(3):24-29.

Авторы:

Расстригина И.М.

Лаборатория патологии женской репродуктивной системы ФГБУ "НИИ морфологии человека" РАМН, Москва

Все авторы (4)

Преэклампсия - тяжелая форма позднего гестоза беременности, угрожающая жизни и здоровью женщины и будущего ребенка. Кроме клинических проявлений (гипертензия, протеинурия, отеки) это заболевание имеет и морфологические эквиваленты - нарушение гестационной перестройки спиральных артерий матки, которые приводят к неадекватно низкому кровоснабжению плаценты и соответственно плода [1]. Этот сложный процесс осуществляется за счет миграции клеток плаценты вглубь материнской ткани - цитотрофобластической инвазии (ЦТИ), которая осуществляется тремя типами клеток: интерстициальным цитотрофобластом (ИЦ), многоядерными гигантскими клетками (МГК) и эндоваскулярным цитотрофобластом (ЭВЦ). Механизм перестройки связан с расплавлением стенки спиральных и радиальных маточных артерий специфичными цинкзависимыми ферментами металлопротеиназами [2], что в итоге приводит к увеличению просветов маточно-плацентарных артерий [3]. Особого внимания заслуживают желатиназы (А и В), именуемые ММР-2 (желатиназа А) и ММР-9 (желатиназа В), денатурирующие коллаген до низкомолекулярных соединений в стенках сосудов; они могут инактивироваться тканевыми ингибиторами TIMPs. Желатиназы включены в процесс деградации других компонентов экстрацеллюлярного матрикса, таких как протеогликаны, эластин, гликопротеины.

В настоящее время ведущей причиной неполной перестройки стенок маточных артерий при преэклампсии считается недостаточное количество инвазирующих клеток или отсутствие/инактивация необходимых лизирующих ферментов. Поэтому изменение концентрации металлопротеиназ в различных тканях - предмет пристального внимания ученых. Опубликовано много работ, основанных на оценке образцов крови беременных с использованием методов зимографии и ELISA. Одни показывают присутствие в субстрате неактивных проферментов, т.е. не позволяют судить об активности той или иной металлопротеиназы [4]. Их результаты таковы: при преэклампсии уровень ММР-9 в сыворотке крови по сравнению с нормой повышен [5-8]. Уровень ММР-2 в крови женщин при преэклампсии также повышен [5, 8, 10-12]. Вместе с тем при исследовании экстрактов тканей и биоптатов картина может быть несколько иная, более полно отражающая именно активность ферментов. По некоторым данным [4, 9], при преэклампсии происходит инактивация металлопротеиназ, отсутствие действия которых заметно на морфологическом уровне.

Исследований, посвященных иммуногистохимии плацент и маточно-плацентарной области (МПО), к сожалению, мало. По некоторым данным [13], экспрессии ММР-9 при преэклампсии может вообще не быть или она слабая. Исследования цитотрофобласта при преэклампсии [14] c помощью ПЦР и вестерн-блоттинга показывают, что уровень экспрессии мРНК ММР-9 в гомогенатах клеток цитотрофобласта в группе преэклампсии значительно ниже, чем при нормальной беременности.

Целью настоящего исследования является оценка интенсивности экспрессии металлопротеиназ 2-го и 9-го типов в трех основных видах клеток ЦТИ (ЭВЦ, ИЦ и МГК) на разных сроках условно нормальной беременности и у женщин с преэклампсией.

Материал и методы

Для решения поставленных задач были подобраны следующие группы женщин в зависимости от срока беременности: 1-я группа (n=5) - медицинские аборты, проведенные по желанию здоровых пациенток с 7-й по 8-ю неделю гестации (после оплодотворения - п.о.). 2-я группа (n=12) - ампутированные матки с 9-й по 12-ю неделю гестации (п.о.) по поводу артифициальных повреждений во время криминальных абортов. 3-я группа - поздние медицинские аборты с 18-й по 24-ю неделю (постменструальный срок - п.м.) с помощью внутривенного введения энзапроста (n=5); клиническим обоснованием служили психические заболевания матери и социальные причины, ампутированные матки (n=5) при крупных миоматозных узлах (25-я неделя п.м.). 4-я группа (n=7) - ампутированные матки при условно нормальной беременности по поводу крупных миоматозных узлов, несостоятельных рубцов на матке и при биопсии плацентарного ложа, взятые во время кесарева сечения по поводу узкого таза (38-40-я неделя п.м.). В следующие две группы вошли биопсии, взятые при оперативном родоразрешении женщин, по поводу преэклампсии: 5-я группа (n=11) - биопсии при сроке 28-33 нед и 6-я группа (n=4) - биопсии при сроке 34-38 нед. Всего обследовано 49 женщин.

Материал был фиксирован в формалине, в каждом случае отобрано не менее 6 фрагментов. Они обработаны по стандартной схеме и залиты в парафин. Все препараты окрашены гематоксилином и эозином, из них отобраны препараты, содержащие МПО (микроскоп Leica DM2500). После депарафинизации на серийных срезах проведена иммуногистохимическая оценка с использованием антител (матриксная металлопротеиназа 2-го типа, фирма «Novocastra», клон 17B11; ММР-9, «Novocastra», клон 15W2). Параллельно выполнялось иммуногистохимическое окрашивание серийных срезов для контроля исследуемых инвазивных клеток (цитокератин-8, «Novocastra», клон TS1). Во всех случаях использована единая система детекции (Thermo Scientific Ultravision Detection System Anti-Polyvalent, HRP/DAB).

С помощью данных маркеров визуализированы 3 инвазивных элемента: 1) ИЦ - отдельные клетки округлой или вытянутой формы среди желез, децидуальной оболочки и прилежащих пучков миоцитов; 2) МГК - имеют более трех ядер с общим ободком иммуноэкспрессии цитокератина; 3) ЭВЦ - клетки на уровне эндотелия или в просветах артерий. Срезы оценивали при увеличении в 200 раз на полуколичественном уровне по интенсивности иммуноэкспрессии. Для ММР-2 за негативный (0 баллов) был принят уровень окраски окружающих децидуальных клеток, 1 балл - слабая, 2 балла - средняя, 3 балла - максимальная.

Для ММР-9 уровень окраски окружающих децидуальных клеток был принят за 1 балл, так как известно, что эти клетки слабо положительны по этому маркеру [1]. Соответственно, 0 баллов - негативная окраска, 2 балла - средняя интенсивность экспрессии, 3 балла - максимальная интенсивность экспрессии. В каждом наблюдении было оценено по 10 клеток конкретного инвазивного типа. Статистическую обработку проводили с помощью общестатистического метода (критерий Стьюдента) и непараметрического метода Манна-Уитни для сроков 7-8 нед и 9-12 нед гестации. Сравнение других групп было нецелесообразно из-за неоднородности материала и разных интервалов гестации.

Результаты

Интенсивность иммуногистохимической экспрессии ММР-2 в компонентах ЦТИ на разных сроках условно неосложненной беременности отражена в табл. 1.

Из нее видно, что ведущим элементом инвазии по активности является ЭВЦ и в меньшей степени - ИЦ. На протяжении всей беременности интенсивность иммуноэкспрессии металлопротеиназы 2-го типа в ЭВЦ близка к максимальной (см. рисунок, а, в).
Рисунок 1. Иммуноэкспрессия металлопротеиназ 2-го и 9-го типов при неосложненной беременности и преэклампсии. а - нормальная перестройка артерии на сроке 12 нед. Иммуноэкспрессия MMP-2 в ИЦ. ×200.
Рисунок 1. Рисунок 1. Иммуноэкспрессия металлопротеиназ 2-го и 9-го типов при неосложненной беременности и преэклампсии. в - широкий просвет артерии и единичный ЭВЦ на сроке 25 нед. Иммуноэкспрессия MMP-2. ×200.
Показатель для ИЦ ниже, с 7-й по 25-ю неделю гестации он держится приблизительно на одном уровне. К моменту родов экспрессия этого фермента сильно снижается. Интенсивность экспрессии в МГК ниже, чем в клетках ИЦ, но динамика приблизительно такая же: с 7-й по 25-ю неделю гестации экспрессия этого фермента осуществляется приблизительно на одном уровне, незначительно возрастая, к моменту родов она снижается. Оценка интенсивности иммуноэкспрессии ММР-9 всех инвазивных элементов на разных сроках условно неосложненной беременности отражена в табл. 2.
Из нее следует, что ведущим элементом инвазии по активности является ЭВЦ, поскольку на всех сроках гестации в нем интенсивность иммуноэкспрессии ММР-9 близка к максимальной (см. рисунок, б, г).
Рисунок 1. Иммуноэкспрессия металлопротеиназ 2-го и 9-го типов при неосложненной беременности и преэклампсии. б - нормальная перестройка артерии на сроке 12 нед. Иммуноэкспрессия MMP-9 в ЭВЦ. ×200.
Рисунок 1. Иммуноэкспрессия металлопротеиназ 2-го и 9-го типов при неосложненной беременности и преэклампсии. г - перестройка артерии на сроке 25 нед. Иммуноэкспрессия ММР-9 в ИЦ, ЭВЦ и МГК. ×200.
На рисунке, б хорошо заметно, что в начале беременности спиральные артерии имеют узкий просвет и относительно толстую стенку, в составе которой присутствуют эластомышечные элементы. Через нее инвазивные клетки, активно экспрессирующие ММР-9, продвигаются в сторону просвета сосуда, лизируя все элементы стенок и замещая их фибриноидом. На рисунке, г можно оценить результат этого процесса: в конце инвазии просвет сосуда становится шире, стенка сосудов тонкая. Показатель активности ИЦ ниже, но он непрерывно возрастает, начиная с 7-й недели гестации (1 балл) и достигая к 25-й неделе беременности интенсивности 2,31 балла.

К моменту родов выработка этого фермента ослабевает, по-видимому, от того, что процесс перестройки сосудов при нормальной беременности к этому моменту уже завершен. Интересно отметить роль МГК. В I триместре они малоактивны и лишь к 18-25-й неделе гестации интенсивность экспрессии в них начинает возрастать (см. табл. 2). Однако к концу беременности она не ослабевает, а становится сравнимой с ИЦ. Возможно, это необходимо для нормального отторжения плаценты.

Данные по полуколичественной оценке интенсивности иммуногистохимической экспрессии ММР-2 и ММР-9 клетками, участвующими в ЦТИ у женщин, чья беременность была осложнена преэклампсией, отражены в табл. 3 и 4.

Оценка клеток ЭВЦ в этих случаях затруднена, так как в большинстве сосудов ЭВЦ отсутствует. Интенсивность экспрессии ферментов по сравнению с нормой низкая как для ММР-2, так и для ММР-9. К моменту родов она не снижается, держится на том же уровне, может даже немного возрасти в клетках МГК (см. рисунок, д, е).
Рисунок 1. Иммуноэкспрессия металлопротеиназ 2-го и 9-го типов при неосложненной беременности и преэклампсии. д - отсутствие перестройки артерии при преэклампсии на сроке 30 нед гестации, единичные клетки с иммуноэкспрессией ММР-2. ×200.
Рисунок 1. Иммуноэкспрессия металлопротеиназ 2-го и 9-го типов при неосложненной беременности и преэклампсии. е - отсутствие перестройки артерии при преэклампсии на сроке 30 нед гестации. Слабая иммуноэкспрессия ММР-9. ×200.
На рисунке, д видно, что интенсивность экспрессии ММР-2 при преэклампсии низкая. Вместе с тем процесс инвазии не принес желаемых результатов: стенка артерии недостаточно перестроена. На рисунке, е представлен серийный срез этого сосуда, окрашенный с применением маркера к ММР-9. Инвазивные элементы уже малоактивны и перестройка спиральной артерии не произошла.

Заключение

Впервые с помощью иммуногистохимического метода удалось оценить интенсивность экспрессии желатиназ не только в клетках ИЦ, но и в ЭВЦ, а также в МГК. Исходя из полученных результатов, металлопротеиназа 2-го типа является основным ферментом инвазии, он интенсивно и непрерывно экспрессируется во всех инвазивных клетках до 25-й недели гестации с максимумом в ЭВЦ, несколько слабее в ИЦ, еще слабее в МГК. Это соотносится с данными, полученными J. Li и соавт. [5] с помощью метода иммуногистохимии с применением стрептавидин-биотинового комплекса на материале доношенных плацент, и данными, полученными A. Weiss и соавт. [1] при выявлении ММР в амниотической жидкости и плодных оболочках, о роли металлопротеиназ в процессе ЦТИ. К концу беременности интенсивность экспрессии ММР-2 снижается, в этой связи особо подчеркивается возрастающая роль ММР-9. В I триместре данный фермент экспрессируется на высоком уровне только в клетках ЭВЦ.

В этих клетках с небольшими колебаниями он экспрессируется на протяжении всей беременности. Однако остальные инвазивные элементы до 18-й недели малоактивны, и только в III триместре интенсивность экспрессии возрастает, причем МГК не менее активны, чем одноядерные интерстициальные. Некоторыми исследователями [15] отмечено, что экспрессия цитотрофобластом ММР-2 у макак-резусов начинается гораздо раньше, чем ММР-9. По нашим данным, тенденция к более позднему началу интенсивной экспрессии ММР-9 имеет место и у человека. Увеличение экспрессии ММР-2 клетками ИЦ и в меньшей степени МГК отмечено уже после 7-8 нед гестации, а экспрессия ММР-9 этими клетками усиливается только после 9-12 нед гестации. В отношении ЭВЦ можно отметить, что эти клетки активно экспрессируют ММР-2 во всех исследованных нами сроках, а экспрессия ММР-9 непрерывно усиливается, начиная с 7-й недели гестации и достигая своего максимума к концу беременности. По данным других исследователей [16], металлопротеиназа 9-го типа - ведущий фермент, задействованный в процессе родов. Возможно, это проясняет роль многоядерных гигантских клеток, количество которых, по данным наших предыдущих исследований [17], возрастает к концу беременности. Настоящее исследование показывает, что экспрессия ММР-9 в этих клетках к доношенному сроку также возрастает, что может быть важным звеном в подготовке и механизме родов.

В случаях преэклампсии процесс инвазии сильно нарушен, она недостаточно интенсивная и неэффективная: не происходит перестройки сосудов в достаточном объеме (см. рисунок, д, е); лишь единичные клетки цитотрофобласта встраиваются в стенку сосуда. Изменить ее ригидность они не в состоянии и объем крови, поступающей к плоду, существенно не увеличивается. Наши исследования показывают, что клетки ЭВЦ при преэклампсии обнаруживаются редко. Интенсивность экспрессии необходимых ферментов в инвазивных элементах при этом заболевании низкая по сравнению с нормой и существенной динамики изменений показателей не наблюдается (см. табл. 3 и 4). Эти данные соотносятся с теми, что получены методами ПЦР и вестерн-блоттинга при исследовании биоптатов плацент [13, 14]. Они дают более полное представление о механизмах развития преэклампсии, что может быть полезным для разработки методов лечения данного заболевания.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.П.М.

Сбор и обработка материала: И.М.Р., Т.В.Ф., М.К.

Написание текста: А.П.М

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail