Евдокименко А.Н.

ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва, Россия

Ануфриев П.Л.

ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва, Россия

Куличенкова К.Н.

ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва, Россия

Гулевская Т.С.

Танашян М.М.

ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва, Россия

Морфометрическая характеристика неоваскуляризации атеросклеротических бляшек каротидного синуса

Журнал: Архив патологии. 2018;80(2): 24-29

Просмотров : 80

Загрузок : 1

Как цитировать

Евдокименко А. Н., Ануфриев П. Л., Куличенкова К. Н., Гулевская Т. С., Танашян М. М. Морфометрическая характеристика неоваскуляризации атеросклеротических бляшек каротидного синуса. Архив патологии. 2018;80(2):24-29. https://doi.org/10.17116/patol201880224-29

Авторы:

Евдокименко А.Н.

ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва, Россия

Все авторы (5)

В развитии и прогрессировании атеросклероза ведущую роль отводят липопротеидам и макрофагам, накопление которых в интиме артерии приводит к ее утолщению с повышением потребности в кислороде и активации индуцируемого гипоксией фактора (HIF1α) в клетках. HIF в свою очередь активирует систему сосудистых эндотелиальных факторов роста и их рецепторов (VEGF/VEGFR), запускающих процессы ангиогенеза [1]. Путь HIF/VEGF является классическим механизмом адаптивного ангиогенеза в физиологических условиях. В норме при восстановлении содержания кислорода в ткани HIF1α разрушается, что приводит к снижению продукции ангиогенных молекул с одновременным повышением экспрессии ангиостатических молекул, подавляющих ангиогенез и стабилизирующих новообразованные сосуды.

Ангиогенез при атеросклерозе исходно индуцируется как защитный механизм, направленный на восстановление оксигенации и регенерацию интимы. Однако различные стимулы, например воспаление и окислительный стресс, могут поддерживать длительный ангиогенный ответ, который приобретает патологический характер в связи с отсутствием фазы разрешения и стабилизации новообразованных сосудов и приводит к разрастанию «незрелой» сосудистой сети [2]. До 80% новообразованных сосудов в атеросклеротических бляшках, по данным некоторых авторов [3], характеризуется нарушением целости эндотелиальной выстилки и межэндотелиальных контактов, отсутствием перицитов, что обусловливает их сниженную механическую прочность и склонность к разрыву, повышенную проницаемость для клеток крови и кровоизлияния в бляшку, стимулирующие воспаление, окислительный стресс и дальнейшее прогрессирование атеросклероза [3]. Тем не менее в значительном числе случаев наблюдается спонтанная стабилизация атеросклеротического процесса с резорбцией очагов атероматоза, ослаблением воспалительной реакции и фиброзом, при этом стабильные фиброзно-кальцинозные бляшки, по данным P. Moreno [4], содержат наименьшее количество сосудов, что указывает на инволюцию ангиогенеза после утилизации атероматозных масс. Кроме того, в ряде исследований на животных и у человека продемонстрировано, что ангиогенез в бляшке может играть важную роль в удалении макрофагами холестерина и продуктов распада гемоглобина из бляшки [5, 6]. С учетом изложенного, а также противоречивых данных о связи неоваскуляризации и общепризнанных маркеров нестабильной структуры бляшки каротидного синуса (атероматоз, макрофагальная реакция, кровоизлияние) вопрос о роли неоваскуляризации бляшки в прогрессировании церебрального атеросклероза остается дискутабельным и требует дальнейшего всестороннего изучения.

Цель — определение связи между степенью выраженности неоваскуляризации атеросклеротической бляшки и таких процессов в ней, как атероматоз, макрофагальная реакция, кровоизлияния и обызвествление.

Материал и методы

В исследование включены 45 пациентов (32 мужчины и 13 женщин; средний возраст 64±10 лет) с атеростенозом каротидного синуса, степень выраженности которого по данным ультразвукового дуплексного сканирования составила 50% и более (79±11%). Выполнено 48 операций каротидной эндартерэктомии (у 3 пациентов — с двух сторон) с последующим патоморфологическим исследованием атеросклеротических бляшек каротидного синуса на всем их протяжении. Бляшки в зависимости от длины разрезали на 4—9 блоков толщиной 0,3 см в плоскости, перпендикулярной оси сосуда; блоки заливали в парафин. Срезы с каждого блока окрашивали гематоксилином и эозином и по ван Гизону, после чего сканировали с помощью аппарата Aperio AT2 («Leica Biosystems», Германия) при 400-кратном увеличении изображения.

Структуру бляшек анализировали в программе Aperio ImageScope («Leica Biosystems», Германия) версии 11.2.0.780. Сосуды определяли как выстланные эндотелием структуры, имеющие просвет. Оценивали общую плотность расположения сосудов на 1 см2 бляшки (результат деления общего количества сосудов во всех срезах на сумму площадей этих срезов), локализацию в срезе (поверхностная, центральная или глубокая треть), плотность расположения сосудов определенного диаметра (<20, ≥20, ≥30, ≥40, ≥50, ≥60, ≥70, ≥80 мкм). При косом или продольном сечении сосуда его диаметр определяли как поперечный размер в наиболее широком участке. Наряду с сосудами оценивали объемную долю атероматоза (ОДА) в бляшке — сумма площадей очагов атероматоза во всех срезах, деленная на сумму площадей бляшки также во всех срезах и умноженная на 100%. Для межгруппового анализа степень выраженности атероматоза оценивали по шкале от 0 до 3 баллов, где 0 — отсутствие, 1 — ОДА менее 20%, 2 — ОДА от 20 до 40%, 3 — ОДА более 40%. Проводили полуколичественную оценку (в баллах) обызвествления, кровоизлияния и липофагов: — обызвествление — отсутствие — 0, мелкие кальцификаты или пылевидное обызвествление отдельных волокон —1, единичные крупные кальцификаты или значительное количество мелких кальцификатов/обызвествленных волокон, площадь которых в срезе составляла менее25% — 2, многочисленные кальцификаты разной величины или обширные поля пылевидного обызвествления волокон, занимающие 25—50% среза, — 3, массивные кальцификаты, занимающие более 50% среза, — 4; — кровоизлияния с разной степенью организации (при выраженной организации учитывали количество сидерофагов и гемосидерина) — отсутствие — 0, отдельные небольшие кровоизлияния — 1, значительное количество небольших кровоизлияний, занимающих менее 25% площади среза, — 2, многочисленные небольшие кровоизлияния, занимающие 25—50% среза, — 3, массивные кровоизлияния, площадь которых в срезе составляла более 50% — 4; — липофаги — отсутствие — 0, единичные клетки — 1, небольшие группы — 2, умеренное количество небольших скоплений, занимающих менее 25% площади среза, — 3, многочисленные крупные скопления, площадь которых в срезе составляла 25—50%, — 4, массивные скопления, занимающие более 50% среза, — 5.

Степень выраженности указанных компонентов в бляшке определяли как отношение суммированного показателя в баллах к количеству срезов. Статистическую обработку результатов проводили в пакете Statistica 10.0 («StatSoft», США). Для выявления статистических различий и корреляционных связей применяли соответственно непараметрический U-критерий Манна — Уитни и коэффициент корреляции Спирмена. Во всех случаях порог статистической значимости (р) составлял 0,05.

Результаты

Проведен анализ структуры 48 атеросклеротических бляшек каротидного синуса. Сосуды обнаружены во всех бляшках, при этом их диаметр и плотность расположения в 1 см2 бляшки варьировали в широких пределах, достигая 323 мкм и 1224 сосудов. Преобладали сосуды диаметром менее 20 мкм; с увеличением диаметра сосудов их количество в бляшке прогрессивно снижалось (табл. 1).

Таблица 1. Морфометрическая характеристика сосудов в атеросклеротических бляшках, медиана (квартиль 1; квартиль 3)

В большинстве бляшек сосуды были определены в поверхностной, центральной и глубокой частях; только в 3 случаях они выявлены исключительно в глубине бляшек. Сосуды, как правило, располагались в очагах скопления липофагов по периферии атероматоза, в области кровоизлияний вне зависимости от степени их организации, а также по периферии кальцификатов (см. рисунок).

Сосуды различного диаметра в атеросклеротической бляшке каротидного синуса, окраска гематоксилином и эозином. а — сосуды © диаметром до 20 мкм в области скопления липофагов (Л); б — сосуды © диаметром преимущественно более 20 мкм в фиброзной ткани (Ф) по периферии кальцификатов (Са).
При этом сосуды диаметром до 20мкм статистически значимо чаще располагались в области скопления липофагов или организующихся кровоизлияний (см. рисунок, а), чем в участках соединительной ткани (р<0,03). Напротив, сосуды диаметром более40мкм чаще располагались в участках соединительной ткани, особенно вблизи крупных кальцификатов (см. рисунок, б), и в очагах организованных кровоизлияний (р<0,008).

В результате исследования выявлена значительная вариабельность степени выраженности атероматоза, кровоизлияний, обызвествления и количества липофагов (табл. 2).

Таблица 2. Характеристика структурных компонентов в атеросклеротических бляшках Примечание. * — процент; ** — баллы.
Отмечена прямолинейная зависимость между количеством липофагов в бляшке, ОДА и степенью выраженности кровоизлияний (r>0,47; р<0,002), тогда как выраженность обызвествления имела обратную корреляцию с ОДА и количеством липофагов (r>-0,314; р<0,029).

Установлено, что степень выраженности кровоизлияний и количество липофагов не имели статистической связи с плотностью расположения сосудов, но коррелировали с их локализацией в бляшке, т. е. размер и количество кровоизлияний, а также скоплений липофагов возрастали по мере увеличения плотности сосудов в центральных и поверхностных участках бляшки (r=0,496; p=0,000342).

Не выявлено статистически значимых различий в степени выраженности васкуляризации между бляшками с очагами атероматоза и без таковых. Вместе с тем при наличии в бляшках атероматоза установлен отрицательный линейный характер зависимости между ОДА и общей плотностью расположения сосудов (r=-0,32; р=0,028). При этом с повышением выраженности атероматоза статистически значимо снижалось количество сосудов диаметром более 20 мкм в 1 см2 бляшки (r=-0,49; р=0,00042), тогда как изменение плотности более мелких сосудов было статистически незначимым (r=-0,25; р=08). Статистический анализ показал, что в бляшках с ОДА более 40% выявлялось меньше сосудов диаметром более20мкм, чем в бляшках без очагов атероматоза (р=0,01). Бляшки с ОДА до 20% не отличались по общей плотности сосудов от бляшек без атероматоза, но содержали больше сосудов диаметром более20мкм по сравнению с бляшками, в которых ОДА составляла 20—40% и более (р<0,0034). Следует отметить, что бляшки с ОДА до 20% в большинстве случаев были слабо инфильтрированы липофагами (1 балл) и имели умеренную или выраженную степень обызвествления (2—3 балла), тогда как макрофагальная реакция при ОДА 20—40% и более была, как правило, довольно выражена (2—3 балла). Обращает на себя внимание тот факт, что, несмотря на снижение плотности сосудов в бляшке по мере усиления атероматоза, пропорционально повышению ОДА увеличивалась и степень выраженности кровоизлияний в бляшку (r=0,5; р<0,003).

Бляшки с выраженным обызвествлением, включая массивные кальцификаты (3—4 балла), содержали больше сосудов диаметром более 40 мкм (р<0,038), особенно сосудов диаметром более 60 мкм (р=0,006) по сравнению с умеренно обызвествленными бляшками (2 балла) и вместе с тем они статистически значимо не отличались по степени васкуляризации от бляшек с легкой степенью обызвествления (1 балл). При этом в бляшках с выраженным обызвествлением ОДА и количество липофагов было ниже, чем в случаях с меньшей степенью обызвествления (р<0,05). В свою очередь бляшки с легкой степенью обызвествления были крайне вариабельны в отношении макрофагальной реакции, ОДА и выраженности кровоизлияний.

Обсуждение

Сопоставление степени выраженности неоваскуляризации и других основных структурных компонентов атеросклеротических бляшек каротидного синуса, удаленных при операции каротидной эндартерэктомии, показало, что плотность расположения сосудов не коррелирует со степенью выраженности кровоизлияний в бляшку и количеством липофагов, а также не различается в фиброзных/фиброзно-кальцинозных и атероматозных бляшках. Это свидетельствует об отсутствии прямой связи между неоваскуляризацией бляшки и общепризнанными маркерами ее нестабильной структуры, а именно атероматозом, макрофагальной реакцией и кровоизлиянием, степень выраженности которых отличалась сильной корреляцией. В связи с этим подвергается сомнению целесообразность использования оценки выраженности неоваскуляризации бляшки как маркера риска развития инсульта наравне с названными процессами, что активно обсуждалось в литературе до недавнего времени. Это предположение было основано на результатах экспериментальных, клинических и клинико-морфологических исследований, свидетельствующих об активации деструктивных процессов, воспаления и ангиогенеза вблизи участков атеросклеротической бляшки с признаками гипоксии [7, 8], увеличении плотности микрососудов в изъязвленных бляшках [4], неполноценной структуре новообразованных сосудов, сопряженной с повышенным риском кровоизлияний в бляшку и, следовательно, прогрессирования атеросклероза [3] и др. Вместе с тем морфологические исследования были весьма немногочисленны и основаны на анализе небольшого числа случаев с преимущественно избирательным анализом наиболее измененного, по мнению исследователя, участка бляшки, что накладывало ограничения при экстраполяции полученного результата на всю бляшку. Проведенный нами анализ продемонстрировал значительную вариабельность сочетания и степени выраженности основных структурных компонентов бляшки, в том числе неравномерное распределение липофагов и новообразованных сосудов с тенденцией к формированию скоплений различного размера, что подчеркивает необходимость анализа большой серии наблюдений с оценкой бляшки на всем ее протяжении для получения достоверных результатов.

В последние несколько лет однозначная трактовка роли неоваскуляризации как фактора риска осложненных атеросклеротических поражений (изъязвление покрышки, кровоизлияние в бляшку и атеротромбоз) подвергается сомнению, что в значительной степени связано с проведением более масштабных морфологических исследований и клинико-морфологических сопоставлений. Особое внимание в этих исследованиях уделено связи между признаками воспаления и сосудами бляшки, и эта связь оказалась весьма неоднозначной. В ряде клинических исследований показана отчетливая связь повышенного риска развития инсульта с воспалительными изменениями и отсутствие его связи со степенью неоваскуляризации бляшки [9, 10]. Некоторые авторы [11] установили слабую зависимость между воспалением и неоваскуляризацией бляшки, что противоречит данным других авторов [12]. Мы не обнаружили связи между выраженностью неоваскуляризации и количеством липофагов в бляшках, что соответствует результатам наиболее крупного в настоящее время клинико-морфологического сопоставления, в котором оценена степень выраженности различных структурных компонентов в 30 бляшках каротидного синуса, включая новообразованные сосуды [9]. Отсутствие прямой связи между неоваскуляризацией и воспалением может быть обусловлено неоднородностью популяции макрофагов в бляшке, в которой сосуществуют клетки как с проатерогенными (фенотипы М1 и Мох), так и с атеропротективными (фенотипы М2 и Mhem) свойствами [13—17]. При этом относительный избыток атеропротективных макрофагов, по данным некоторых авторов [13], является более надежным, чем общее число макрофагов, индикатором стабильной структуры бляшки. Следует подчеркнуть, что эти популяции макрофагов не статичны, и при изменении микроокружения могут поменять свой фенотип с провоспалительного (М1) на противовоспалительный (М2) [18]. В связи с этим в исследованиях, направленных на изучение характера связи между воспалением и неоваскуляризацией бляшки, представляется целесообразным учитывать фенотипические особенности макрофагов.

Установлено, что макрофаги фенотипа Mhem обладают противовоспалительными свойствами, не формируют пенистых клеток и считаются атеропротективными. Кроме того, J. Boyle и соавт. [16, 17] отметили, что кровоизлияние в бляшку индуцирует образование макрофагов фенотипа Mhem, которые вовлечены в клиренс гемоглобина; позднее это подтвердили А. Finn и соавт. [19]. Эти данные свидетельствуют, что кровоизлияние в бляшку не обязательно связано с дестабилизацией ее структуры. В то же время ранее была показана связь геморрагии с быстрым прогрессированием атеросклероза, в том числе в результате увеличения объема «липидного ядра» [20], что с учетом выявленной прямой зависимости между степенью выраженности кровоизлияний и атероматоза также нашло косвенное подтверждение в настоящем исследовании. Мы не выявили зависимости между степенью выраженности кровоизлияний и количеством новообразованных сосудов в бляшке, это согласуется с результатами исследований других авторов [9] и может указывать на то, что в патогенезе кровоизлияний первоочередную роль играет, вероятно, не количество сосудов, а повышение их проницаемости, связанное с повышением экспрессии VEGF макрофагами при воспалительной реакции в бляшках [21]. В свою очередь ослабление воспалительного ответа с изменением цитокинового профиля может привести к восстановлению равновесия между ангиогенными и ангиостатическими факторами с формированием развитой зрелой сосудистой сети, которая может принимать активное участие в репаративных процессах.

По данным некоторых авторов [22, 23], появление М2-подобных макрофагов (Mhem) связано не только с кровоизлиянием в бляшку, но и с ее обызвествлением. F. Demeure и соавт. [9] выявили обратную зависимость между выраженностью обызвествления и воспаления в бляшке, а также отсутствие корреляции между степенью обызвествления и количеством сосудов в бляшке, что полностью подтверждено в настоящем исследовании и согласуется с обсуждаемой в литературе гипотезой о связи выраженного обызвествления преимущественно со стабилизацией атеросклеротического процесса, а не с активным воспалением. С учетом этой гипотезы, выявленное статистически значимое увеличение количества сосудов диаметром более 40 мкм и особенно более 60 мкм, возникающее при повышении степени обызвествления, а также преимущественная локализация таких сосудов вне очагов активной макрофагальной реакции позволяют утверждать, что сосуды крупного калибра могут выступать в качестве индикаторов стабилизации атеросклеротического процесса или запуска репаративных процессов в бляшке. Косвенным подтверждением такого предположения может служить снижение количества сосудов диаметром более 20 мкм при повышении количества атероматозных масс, т. е. с усилением одного из наиболее значимых деструктивных процессов в бляшках. Количество мелких сосудов (диаметром до 20 мкм), расположенных преимущественно в очагах скопления макрофагов по периферии атероматоза или организующихся кровоизлияний, уменьшается с усилением обызвествления, в связи с чем такие сосуды, вероятно, могут рассматриваться в качестве индикаторов повышения активности процесса.

При оценке активности атеросклероза определенное значение может иметь не только калибр новообразованных сосудов, но и особенности их локализации в бляшке, поскольку, как показало исследование, увеличение плотности сосудов в более поверхностных отделах бляшки может быть маркером повышенного риска кровоизлияний и активации макрофагальной реакции. Полученные нами результаты могут иметь важное значение в уточнении протокола исследования и критериев оценки неоваскуляризации ультразвуковым методом с контрастным усилением, возможности которого активно обсуждаются в последние годы.

Заключение

В исследовании установлено отсутствие четкой прямолинейной зависимости между степенью выраженности неоваскуляризации атеросклеротической бляшки и таких процессов в ней, как атероматоз, макрофагальная реакция, кровоизлияния и обызвествление. Полученные результаты позволяют предположить, что совокупность характеристик неоваскуляризации атеросклеротической бляшки каротидного синуса (количество, диаметр и расположение сосудов) является динамическим отражением происходящих в ней деструктивных и репаративных процессов, и повышение количества сосудов более крупного калибра (более 40 мкм и особенно более 60 мкм) может иметь прогностическое значение как индикатор активации репаративных процессов и соответственно более благоприятного течения атеросклероза. Локализация сосудов преимущественно в поверхностных участках бляшки в свою очередь может служить предиктором активации атеросклероза в виде усиления макрофагальной реакции и развития кровоизлияний.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Н.Е.

Сбор и обработка материала — А.Н.Е.

Статистическая обработка — А.Н.Е.

Написание текста — А.Н.Е., П.Л.А., К.Н.К.

Редактирование — Т.С.Г., М.М.Т.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Евдокименко Анна Николаевна — к.м.н., ученый секретарь, научный сотрудник лаборатории патологической анатомии; e-mail: annevdokimenko@gmail.com; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-2880-0547

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail