Кобяков Д.С.

МБЛПУ «Когалымская городская больница», 628481 Когалым

Авдалян А.М.

Алтайский филиал ФГБУ "Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина" РАМН, Барнаул

Климачев В.В.

ГБОУ ВПО "Алтайский государственный медицинский университет" Минздрава РФ, Барнаул

Лазарев А.Ф.

Алтайский филиал ФГБНУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина, Барнаул, Россия; КГБУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер», Барнаул, Россия

Лушникова Е.Л.

ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН, 630117 Новосибирск

Непомнящих Л.М.

ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН, 630117 Новосибирск

Немелкоклеточный рак легкого: статус онкогена HER2

Журнал: Архив патологии. 2015;77(2): 3-9

Просмотров : 12

Загрузок : 1

Как цитировать

Кобяков Д. С., Авдалян А. М., Климачев В. В., Лазарев А. Ф., Лушникова Е. Л., Непомнящих Л. М. Немелкоклеточный рак легкого: статус онкогена HER2. Архив патологии. 2015;77(2):3-9. https://doi.org/10.17116/patol20157723-9

Авторы:

Кобяков Д.С.

МБЛПУ «Когалымская городская больница», 628481 Когалым

Все авторы (6)

Семейство онкогенов HER (erbB) часто гиперэкспрессируются при раке легкого [1]. Онкоген (erbB2) находится на длинном плече хромосомы 17 (q12-q21), продуктом этого онкогена является трансмембранный белок HER2 — рецептор с тирозинкиназной активностью к эпидермальному фактору роста. В раковых клетках гиперэкспрессия этого онкогена происходит за счет амплификации и намного реже — за счет мутации. Повышение содержания белка HER2 и амплификация гена  — частое событие в инвазивном раке молочной железы, связанное с плохим прогнозом, резистентностью к гормонотерапии и ответом опухоли на терапию HER2 моноклональными антителами трастузумаб (герцептин). Повышение содержания белка HER2 и амплификация гена найдены также и при злокачественных опухолях желудка, толстой кишки, легких [2, 3], что открывает возможность таргетной терапии опухолей этих локализаций.

Рак легкого является преобладающей формой среди злокачественных новообразований, из которых до 80% приходится на немелкоклеточный рак легкого (НМКРЛ). Как известно, на гистологическом уровне НМКРЛ характеризуется выраженной внутриопухолевой гетерогенностью. В отличие от НМКРЛ в клетках рака молочной железы гетерогенность по уровню амплификации гена не столь значительна. Имеются сообщения о выраженной гетерогенности амплификации гена при раке желудка [4] и толстой кишки [5]. Данные литературы относительно гетерогенности белка и гена при НМКРЛ малочисленны и противоречивы.

В настоящее время для оценки возможности таргетной терапии используются иммуногистохимический (ИГХ) метод определения белка HER2 и гибридизация для выявления гибридизированных ДНК-зондов к гену . Разновидностью хромогенной гибридизации является полностью автоматизированный метод SISH («Ventana»), рекомендованный FDA для такого типа исследований, в этом методе ген идентифицируется серебряной меткой, а центромерный участок хромосомы 17 (CEP17) — красителем Fast Red. Вторым преимуществом данного метода, помимо автоматизации и стандартизации, является возможность исследования результатов на светооптическом уровне. По данным литературы, от 4 до 50% НМКРЛ окрашивались ИГХ-методом на белок HER2 [1, 6—14], от 1 до 23% имели амплификацию гена [7, 9, 12—14]. В большинстве исследований НМКРЛ состояние гена определялось также методом FISH, результаты которого имеют незначительные расхождения с данными хромогенной гибридизации [2].

В настоящее время в научных исследованиях с использованием ИГХ-метода широко применяется методика тканевых матриц [15], дающая возможность исследования большого количества образцов ткани на одном стекле, в том числе из разных участков одной опухоли, предоставляя возможность анализа гетерогенности опухоли. С использованием методики тканевых матриц также унифицируется и стандартизируется результат окрашивания. Имеются сообщения о применении тканевых матриц и в методике гибридизации [3]. В доступной литературе отсутствуют работы, посвященные исследованию белка (методом ИГХ) и гена (методом SISH) в разных участках опухоли, для оценки внутриопухолевой гетерогенности при НМКРЛ.

Исходя из вышеизложенного, целью работы стало исследование белка (методом ИГХ) и гена (методом SISH) в разных участках опухоли с использованием методики тканевых матриц при НМКРЛ.

Исследованы 243 образца операционного материала от больных НМКРЛ, полученных за 2007—2009 гг. в Алтайском краевом онкологическом диспансере (случаи с М1 и множественными опухолями исключены из исследования). Средний возраст пациентов составил 59 лет (от 35 до 75), из них 209 мужчин и 34 женщины. Выполнена лобэктомия 172 (71%) пациентам и пневмонэктомия 71 (29%) пациенту. Из исследования исключены случаи с предоперационной лучевой и химиотерапией.

Из каждой опухоли забирали 3 кусочка ткани: 2 из противоположных периферических отделов и 1 из центра (всего 729 образцов). Кусочки ткани фиксировали в течение 18—24 ч в 10% нейтральном забуференном формалине. После стандартной проводки операционного материала готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, ШИК-реактивом/альциановым синим, по Крейбергу. Для уточнения гистогенеза опухоли и с дифференциально-диагностической целью ИГХ-методом определяли цитокератины 7 (клон SP52), 20 (клон SP33), High Molecular Weight (клон 34βE12), цитокератины 5/6 (клон D5 16B4) в автоматическом стейнере Ventana XT (контроль окрашивания — эпидермис кожи и слизистая оболочка желудка). Для карцином железистого генеза характерно положительное окрашивание на цитокератины 7/20 и отрицательное на цитокератины High Molecular Weight и 5/6, наоборот, для карцином плоскоклеточного генеза — положительное окрашивание на цитокератины High Molecular Weight, 5/6 и отрицательное на цитокератины 7/20.

Из парафиновых блоков брали столбики ткани иглой-панчером с внутренним диаметром 1,5 мм на основании просмотра соответствующих гистологических препаратов. Были изготовлены три тканевые матрицы по 243 тканевых столбика, в каждой из которых приготовлены гистологические срезы толщиной 4 мкм.

Три тканевые матрицы окрашены ИГХ-методом с первичными антителами к HER2 в иммуностейнере Ventana XT (диспенсер «Ventana», Pathway Confirm (клон 4В5)), согласно протоколу производителя (контроль окрашивания — HER2-положительный рак молочной железы). Оценку окрашивания проводили, согласно рекомендациям производителя, с модификацией, предложенной для рака желудка [4], ввиду того что НМКРЛ не является гормонозависимой опухолью, как рак молочной железы. 0 — нет окрашивания или мембранное окрашивание менее 10% клеток; 1+ — слабое или фрагментарное мембранное окрашивание более 10% клеток; 2+ — слабое или умеренное базолатеральное или полное мембранное окрашивание более 10% клеток; 3+ — умеренное или выраженное базолатеральное или полное окрашивание более 10% клеток. Статус опухоли определяли исходя из максимального окрашивания из трех участков опухоли и оценивали как отрицательный (0 и 1+), неопределенный (2+) и положительный (3+). Опухоли с положительным и/или неопределенным окрашиванием в одних участках и отрицательным в других считались гетерогенно окрашенными.

Все три тканевые матрицы были окрашены SISH-методом на автоматическом стейнере Ventana XT набором INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail («Ventana») с двойной меткой — зондами для HER2 и CEP17 на одном стекле соответственно протоколу производителя (независимо от степени экспрессии белка HER2). Оценку результатов реакции SISH проводили, согласно инструкции к набору: подсчитывали метку в 20/40 ядрах опухолевых клеток (×1000), вычисляли соотношение /CEP17. Оценку амплификации проводили, согласно рекомендациям производителя: при соотношении /CEP17 менее 1,8 считали, что амплификация гена отсутствует, а при соотношении /CEP17 более 2,0 отмечали наличие амплификации. При соотношении /CEP17 1,8—2,0 в счет включали дополнительный объем клеток до тех пор, пока не получали пограничного уровня. Для оценки состояния CEP17 использовали классификацию, предложенную S. Wang и соавт. [16]: уменьшение (менее 1,75 метки), норма (1,75—2,25 метки), незначительное увеличение (2,25—3,75 метки), выраженное увеличение (более 3,75 метки). В случае наличия амплификации гена или увеличения CEP17 опухоль считали гетерогенной, если хотя бы в одном из трех образцов опухоли отсутствовала соответственно амплификация гена или увеличение CEP17.

Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Statistica 6.0. При проверке статистических гипотез применяли двусторонний точный критерий Фишера для таблиц 2×2, коэффициент корреляции рангов Спирмена (). Достоверность полученных критериев оценивали при <0,05.

Пригодными для анализа оказались образцы материала, полученные от 218 (90%) больных НМКРЛ (99 случаев аденокарциномы и 119 — плоскоклеточного рака) — это случаи, в которых во всех трех образцах опухоли было адекватное для оценивания окрашивание ИГХ и SISH (см. таблицу). В 25 (10%) случаях либо отсутствовал материал в тканевых матрицах после окрашивания, либо окрашивание ИГХ и SISH было неадекватное для оценивания хотя бы в одном из трех образцов опухоли.

В исследованном нами материале НМКРЛ положительный статус опухоли выявлен в 59 (27%) случаях (см. рисунок, г, е), неопределенный — в 47 (22%) случаях (см. рисунок, в, д) и примерно в половине случаев отрицательный. Положительный статус опухоли чаще определяли в аденокарциноме по сравнению с плоскоклеточным раком (<0,001). Положительный статус опухоли чаще обнаруживали в высоко- и умереннодифференцированной аденокарциноме. Неопределенный статус опухоли с одинаковой частотой определяли в аденокарциноме и при плоскоклеточном раке, несколько чаще — при низкодифференцированном плоскоклеточном раке.

Опухоли с положительным и неопределенным статусом в 32 (30%) случаях окрашивались гетерогенно, т. е. имели отрицательное окрашивание как минимум в одном образце из трех. Опухоли с неопределенным статусом достоверно чаще имели гетерогенное окрашивание по сравнению с опухолями с положительным статусом — соответственно в 20 (43%) и 12 (20%) случаях (=0,02). Гетерогенное окрашивание с одинаковой частотой определяли в аденокарциноме и при плоскоклеточном раке; несколько чаще — в умереннодифференцированной аденокарциноме и при низкодифференцированном плоскоклеточном раке.

Хромогенная гибридизация показала, что амплификация гена была в 12 (6%) случаях (см. рисунок, ж, з), амплификация гена совместно с увеличением CEP17 — в 7 (3%) случаях (см. рисунок, и), увеличение CEP17 — в 19 (9%) случаях (см. рисунок, к). Во всех случаях увеличение CEP17 было незначительно. Уменьшение CEP17 выявлено в 6 (3%) случаях (2 случая аденокарциномы и 4 — плоскоклеточного рака). В 4 случаях аденокарциномы легкого амплификация гена (без увеличения CEP17) определялась в виде кластеров (12 копий и более) и соответствовала высокому уровню амплификации. В остальных 15 случаях амплификация гена определялась в виде отдельных множественных копий (от 4 до 8) и соответствовала низкому уровню амплификации. Во всех исследованных образцах отсутствовала внутриопухолевая гетерогенность амплификации гена . Однако в 1 из 4 случаев аденокарциномы легкого с высоким уровнем амплификации гена выявлена неоднородность амплификации гена : в участках опухоли с железисто-подобным строением отмечался низкий уровень амплификации, а в участках солидизации — высокий уровень амплификации (см. рисунок, ж). В 2 (11%) случаях увеличения CEP17 (без амплификации гена ) отмечена внутриопухолевая гетерогенность.

Из 59 образцов опухолей с положительным статусом амплификация гена определена в 10 (17%) случаях, увеличение CEP17 выявлено в 11 (19%) и амплификация гена совместно с увеличением CEP17 — в 6 (10%) случаях. Из 47 образцов опухолей с неопределенным статусом амплификация гена определена в 2 (4%) случаях, увеличение CEP17 выявлено в 8 (17%) случаях и амплификация гена совместно с увеличением CEP17 — в 1 (2%). В материале опухолей с отрицательным статусом амплификация гена и увеличение CEP17 не отмечены. Таким образом, амплификацию гена и амплификацию гена совместно с увеличением CEP17 достоверно чаще определяли в опухолях с положительным статусом по сравнению с опухолями с неопределенным статусом (<0,01). Увеличение CEP17 с одинаковой частотой отмечено в опухолях с положительным и неопределенным статусом.

Из 32 образцов опухолей с гетерогенным ИГХ-окрашиванием амплификация гена выявлена в 1 (3%), увеличение CEP17 — в 7 (22%) и амплификация гена совместно с увеличением CEP17 — в 2 (6%) случаях. Таким образом, увеличение CEP17 достоверно чаще определяли в опухолях с гетерогенным ИГХ-окрашиванием по сравнению с амплификацией гена . В то же время амплификация гена выявлена в 3 случаях с гетерогенным ИГХ-окрашиванием (2 случая амплификации гена совместно с увеличением CEP17). В этих случаях в образцах с HER2-отрицательным ИГХ-окрашиванием отмечали наличие амплификации гена , как и в образцах с HER2-положительным ИГХ-окрашиванием той же опухоли. Данный факт подтверждает возможность наличия амплификации гена в образцах с HER2-отрицательным ИГХ-окрашиванием. По-видимому, это обусловлено посттранскрипционными механизмами регуляции белка HER2 в разных участках одной опухоли, что приводит к гетерогенности ИГХ-окрашивания.

В образцах НМКРЛ амплификацию гена и гена совместно с увеличением CEP17 чаще определяли в аденокарциноме по сравнению с плоскоклеточным раком (<0,001). Увеличение CEP17 одинаково часто отмечали в аденокарциноме и при плоскоклеточном раке. Распределение случаев с амплификацией гена и увеличением CEP17 не имело достоверной связи со степенью дифференцировки НМКРЛ.

В нашем исследовании с помощью тканевых матриц пригодными для оценки оказались 90% образцов, что в большой мере связано с возможностью изучения трех образцов опухоли.

В исследовании образцов НМКРЛ почти в половине случаев было положительное и неопределенное ИГХ-окрашивание, что согласуется с данными литературы [11]. Однако в ряде исследований [6—10, 12—14] сообщается о более низких значениях (4—30%) положительного и неопределенного ИГХ-окрашивания при НМКРЛ. Высокий показатель неопределенного и положительного ИГХ-окрашивания в нашем исследовании связан с тем, что мы оценивали ИГХ-окрашивание в трех участках опухоли, исключая гетерогенность окрашивания.

Положительный статус опухоли чаще выявляли в аденокарциноме по сравнению с плоскоклеточным раком, в высоко- и умереннодифференцированной аденокарциноме. Аналогичные результаты получены в других исследованиях [1, 6, 9, 12, 14]. Однако G. Cox и соавт. [8] не нашли взаимосвязи статуса опухоли с гистогенезом и дифференцировкой.

Амплификация гена выявлена в 19 (9%) случаях НМКРЛ: в 7 (3%) — амплификация гена совместно с увеличением CEP17, в 8 (4%) — низкий уровень амплификации гена и в 4 (2%) — высокий уровень амплификация гена (все случаи представлены аденокарциномой легкого). По данным литературы [7, 10, 12—14], высокий уровень амплификации гена  — редкое явление при НМКРЛ (1—5% случаев) и чаще определяется низкий уровень амплификации гена , что соответствует нашим данным. По данным H. Nakamura и соавт. [12], низкий уровень амплификации гена при НМКРЛ взаимосвязан с увеличением CEP17, что также соответствует нашим данным.

C. Marchio и соавт. [17] показали, что из 18 случаев рака молочной железы с увеличением количества метки CEP17, по данным FISH-анализа, только в одном случае была полисомия 17-й хромосомы. При НМКРЛ в 26 (12%) случаях мы выявили увеличение CEP17, во всех случаях незначительной степени. H. Nakamura и соавт. [12] указывают на более высокие значения увеличения CEP17 при НМКРЛ — 44%. Вероятно, при НМКРЛ, как и при раке молочной железы, увеличение CEP17 связано с изменениями в центромерном участке 17-й хромосомы, а не с полисомией 17-й хромосомы. При увеличении CEP17 ИГХ-статус опухоли был положительный (17 случаев) или неопределенный (9 случаев), отрицательный отсутствовал, что может указывать на нетранскрипционную регуляцию белка HER2 в клетках.

В нашем исследовании между ИГХ-статусом и амплификацией гена выявлена умеренная корреляция (=0,38, <0,001). Наличие связи между ИГХ-статусом и амплификацией гена при НМКРЛ опубликовано в других исследованиях [8, 14]. Однако G. Pelosi и соавт. [13] не нашли такой взаимосвязи. При НМКРЛ амплификацию гена определяли чаще в аденокарциноме по сравнению с плоскоклеточным раком, что соответствует одним данным литературы [9] и противоречит другим [18].

Амплификацию гена выявляли чаще в опухолях с положительным статусом по сравнению с неопределенным и отсутствием в опухолях с отрицательным статусом. Таким образом, при НМКРЛ трех кусочков ткани достаточно для исключения гетерогенности при ИГХ-окрашивании на HER2. Однако по сравнению с данными литературы в нашем исследовании увеличение количества опухолей с положительным и неопределенным статусом привело к уменьшению вероятности обнаружения амплификации гена соответственно в 27% (16 из 59 случаев с положительным статусом) и в 6% (3 из 47 случаев с неопределенным статусом) случаев. В то же время большая частота обнаружения белка HER2 по сравнению с амплификацией гена указывает на наличие других регуляторных механизмов (посттранскрипционных), влияющих на уровень белка HER2 в клетках НМКРЛ, и гетерогенность этих механизмов в разных участках карциномы.

В НМКРЛ отмечается значительная внутриопухолевая гетерогенность ИГХ-окрашивания HER2 (30% опухолей), чаще в опухолях с неопределенным статусом по сравнению с положительным. В противоположность этому не отмечается внутриопухолевая гетерогенность амплификации гена и только в 2 случаях гетерогенность увеличения CEP17. Также ввиду гетерогенного ИГХ-окрашивания белка HER2 существует возможность обнаружения амплификации гена в образцах с HER2-отрицательным ИГХ-окрашиванием. T. Grob и соавт. [9] при НМКРЛ находили не только гетерогенность ИГХ-окрашивания, но и выраженную внутриопухолевую гетерогенность амплификации гена  — в 4 из 10 случаев с высоким уровнем амплификации гена : в 2 случаях также найден и низкий уровень амплификации гена , а в 2 — отсутствие амплификации гена. В нашем исследовании в одном случае умереннодифференцированной аденокарциномы легкого выявлен высокий уровень амплификации гена в участках опухоли с солидным строением и низкий уровень амплификации гена в участках с железисто-подобным строением.

Таким образом, при НМКРЛ отмечается повышенный уровень белка HER2 и значительно реже — изменение активности в гене (амплификация) как причина повышенного белкового синтеза. В аденогенном раке легкого по сравнению с эпидермоидным чаще наблюдается изменение HER2 (erbB2), как и EGFR (erbB1), что, вероятно, связано с коэкспрессией онкогенов семейства HER (erbB).

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.М.А., В.В.К.

Сбор и обработка материала: Д.С.К., А.М.А.

Написание текста: Д.С.К., А.М.А.

Редактирование: А.Ф.Л., Е.Л.Л., Л.М.Н.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail