Семейство онкогенов HER (erbB) часто гиперэкспрессируются при раке легкого [1]. Онкоген (erbB2) находится на длинном плече хромосомы 17 (q12-q21), продуктом этого онкогена является трансмембранный белок HER2 — рецептор с тирозинкиназной активностью к эпидермальному фактору роста. В раковых клетках гиперэкспрессия этого онкогена происходит за счет амплификации и намного реже — за счет мутации. Повышение содержания белка HER2 и амплификация гена  — частое событие в инвазивном раке молочной железы, связанное с плохим прогнозом, резистентностью к гормонотерапии и ответом опухоли на терапию HER2 моноклональными антителами трастузумаб (герцептин). Повышение содержания белка HER2 и амплификация гена найдены также и при злокачественных опухолях желудка, толстой кишки, легких [2, 3], что открывает возможность таргетной терапии опухолей этих локализаций.

Рак легкого является преобладающей формой среди злокачественных новообразований, из которых до 80% приходится на немелкоклеточный рак легкого (НМКРЛ). Как известно, на гистологическом уровне НМКРЛ характеризуется выраженной внутриопухолевой гетерогенностью. В отличие от НМКРЛ в клетках рака молочной железы гетерогенность по уровню амплификации гена не столь значительна. Имеются сообщения о выраженной гетерогенности амплификации гена при раке желудка [4] и толстой кишки [5]. Данные литературы относительно гетерогенности белка и гена при НМКРЛ малочисленны и противоречивы.

В настоящее время для оценки возможности таргетной терапии используются иммуногистохимический (ИГХ) метод определения белка HER2 и гибридизация для выявления гибридизированных ДНК-зондов к гену . Разновидностью хромогенной гибридизации является полностью автоматизированный метод SISH («Ventana»), рекомендованный FDA для такого типа исследований, в этом методе ген идентифицируется серебряной меткой, а центромерный участок хромосомы 17 (CEP17) — красителем Fast Red. Вторым преимуществом данного метода, помимо автоматизации и стандартизации, является возможность исследования результатов на светооптическом уровне. По данным литературы, от 4 до 50% НМКРЛ окрашивались ИГХ-методом на белок HER2 [1, 6—14], от 1 до 23% имели амплификацию гена [7, 9, 12—14]. В большинстве исследований НМКРЛ состояние гена определялось также методом FISH, результаты которого имеют незначительные расхождения с данными хромогенной гибридизации [2].

В настоящее время в научных исследованиях с использованием ИГХ-метода широко применяется методика тканевых матриц [15], дающая возможность исследования большого количества образцов ткани на одном стекле, в том числе из разных участков одной опухоли, предоставляя возможность анализа гетерогенности опухоли. С использованием методики тканевых матриц также унифицируется и стандартизируется результат окрашивания. Имеются сообщения о применении тканевых матриц и в методике гибридизации [3]. В доступной литературе отсутствуют работы, посвященные исследованию белка (методом ИГХ) и гена (методом SISH) в разных участках опухоли, для оценки внутриопухолевой гетерогенности при НМКРЛ.

Исходя из вышеизложенного, целью работы стало исследование белка (методом ИГХ) и гена (методом SISH) в разных участках опухоли с использованием методики тканевых матриц при НМКРЛ.

Исследованы 243 образца операционного материала от больных НМКРЛ, полученных за 2007—2009 гг. в Алтайском краевом онкологическом диспансере (случаи с М1 и множественными опухолями исключены из исследования). Средний возраст пациентов составил 59 лет (от 35 до 75), из них 209 мужчин и 34 женщины. Выполнена лобэктомия 172 (71%) пациентам и пневмонэктомия 71 (29%) пациенту. Из исследования исключены случаи с предоперационной лучевой и химиотерапией.

Из каждой опухоли забирали 3 кусочка ткани: 2 из противоположных периферических отделов и 1 из центра (всего 729 образцов). Кусочки ткани фиксировали в течение 18—24 ч в 10% нейтральном забуференном формалине. После стандартной проводки операционного материала готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, ШИК-реактивом/альциановым синим, по Крейбергу. Для уточнения гистогенеза опухоли и с дифференциально-диагностической целью ИГХ-методом определяли цитокератины 7 (клон SP52), 20 (клон SP33), High Molecular Weight (клон 34βE12), цитокератины 5/6 (клон D5 16B4) в автоматическом стейнере Ventana XT (контроль окрашивания — эпидермис кожи и слизистая оболочка желудка). Для карцином железистого генеза характерно положительное окрашивание на цитокератины 7/20 и отрицательное на цитокератины High Molecular Weight и 5/6, наоборот, для карцином плоскоклеточного генеза — положительное окрашивание на цитокератины High Molecular Weight, 5/6 и отрицательное на цитокератины 7/20.

Из парафиновых блоков брали столбики ткани иглой-панчером с внутренним диаметром 1,5 мм на основании просмотра соответствующих гистологических препаратов. Были изготовлены три тканевые матрицы по 243 тканевых столбика, в каждой из которых приготовлены гистологические срезы толщиной 4 мкм.

Три тканевые матрицы окрашены ИГХ-методом с первичными антителами к HER2 в иммуностейнере Ventana XT (диспенсер «Ventana», Pathway Confirm (клон 4В5)), согласно протоколу производителя (контроль окрашивания — HER2-положительный рак молочной железы). Оценку окрашивания проводили, согласно рекомендациям производителя, с модификацией, предложенной для рака желудка [4], ввиду того что НМКРЛ не является гормонозависимой опухолью, как рак молочной железы. 0 — нет окрашивания или мембранное окрашивание менее 10% клеток; 1+ — слабое или фрагментарное мембранное окрашивание более 10% клеток; 2+ — слабое или умеренное базолатеральное или полное мембранное окрашивание более 10% клеток; 3+ — умеренное или выраженное базолатеральное или полное окрашивание более 10% клеток. Статус опухоли определяли исходя из максимального окрашивания из трех участков опухоли и оценивали как отрицательный (0 и 1+), неопределенный (2+) и положительный (3+). Опухоли с положительным и/или неопределенным окрашиванием в одних участках и отрицательным в других считались гетерогенно окрашенными.

Все три тканевые матрицы были окрашены SISH-методом на автоматическом стейнере Ventana XT набором INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail («Ventana») с двойной меткой — зондами для HER2 и CEP17 на одном стекле соответственно протоколу производителя (независимо от степени экспрессии белка HER2). Оценку результатов реакции SISH проводили, согласно инструкции к набору: подсчитывали метку в 20/40 ядрах опухолевых клеток (×1000), вычисляли соотношение /CEP17. Оценку амплификации проводили, согласно рекомендациям производителя: при соотношении /CEP17 менее 1,8 считали, что амплификация гена отсутствует, а при соотношении /CEP17 более 2,0 отмечали наличие амплификации. При соотношении /CEP17 1,8—2,0 в счет включали дополнительный объем клеток до тех пор, пока не получали пограничного уровня. Для оценки состояния CEP17 использовали классификацию, предложенную S. Wang и соавт. [16]: уменьшение (менее 1,75 метки), норма (1,75—2,25 метки), незначительное увеличение (2,25—3,75 метки), выраженное увеличение (более 3,75 метки). В случае наличия амплификации гена или увеличения CEP17 опухоль считали гетерогенной, если хотя бы в одном из трех образцов опухоли отсутствовала соответственно амплификация гена или увеличение CEP17.

Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Statistica 6.0. При проверке статистических гипотез применяли двусторонний точный критерий Фишера для таблиц 2×2, коэффициент корреляции рангов Спирмена (). Достоверность полученных критериев оценивали при <0,05.

Пригодными для анализа оказались образцы материала, полученные от 218 (90%) больных НМКРЛ (99 случаев аденокарциномы и 119 — плоскоклеточного рака) — это случаи, в которых во всех трех образцах опухоли было адекватное для оценивания окрашивание ИГХ и SISH (см. таблицу). В 25 (10%) случаях либо отсутствовал материал в тканевых матрицах после окрашивания, либо окрашивание ИГХ и SISH было неадекватное для оценивания хотя бы в одном из трех образцов опухоли.

В исследованном нами материале НМКРЛ положительный статус опухоли выявлен в 59 (27%) случаях (см. рисунок, г, е), неопределенный — в 47 (22%) случаях (см. рисунок, в, д) и примерно в половине случаев отрицательный. Положительный статус опухоли чаще определяли в аденокарциноме по сравнению с плоскоклеточным раком (<0,001). Положительный статус опухоли чаще обнаруживали в высоко- и умереннодифференцированной аденокарциноме. Неопределенный статус опухоли с одинаковой частотой определяли в аденокарциноме и при плоскоклеточном раке, несколько чаще — при низкодифференцированном плоскоклеточном раке.

Опухоли с положительным и неопределенным статусом в 32 (30%) случаях окрашивались гетерогенно, т. е. имели отрицательное окрашивание как минимум в одном образце из трех. Опухоли с неопределенным статусом достоверно чаще имели гетерогенное окрашивание по сравнению с опухолями с положительным статусом — соответственно в 20 (43%) и 12 (20%) случаях (=0,02). Гетерогенное окрашивание с одинаковой частотой определяли в аденокарциноме и при плоскоклеточном раке; несколько чаще — в умереннодифференцированной аденокарциноме и при низкодифференцированном плоскоклеточном раке.

Хромогенная гибридизация показала, что амплификация гена была в 12 (6%) случаях (см. рисунок, ж, з), амплификация гена совместно с увеличением CEP17 — в 7 (3%) случаях (см. рисунок, и), увеличение CEP17 — в 19 (9%) случаях (см. рисунок, к). Во всех случаях увеличение CEP17 было незначительно. Уменьшение CEP17 выявлено в 6 (3%) случаях (2 случая аденокарциномы и 4 — плоскоклеточного рака). В 4 случаях аденокарциномы легкого амплификация гена (без увеличения CEP17) определялась в виде кластеров (12 копий и более) и соответствовала высокому уровню амплификации. В остальных 15 случаях амплификация гена определялась в виде отдельных множественных копий (от 4 до 8) и соответствовала низкому уровню амплификации. Во всех исследованных образцах отсутствовала внутриопухолевая гетерогенность амплификации гена . Однако в 1 из 4 случаев аденокарциномы легкого с высоким уровнем амплификации гена выявлена неоднородность амплификации гена : в участках опухоли с железисто-подобным строением отмечался низкий уровень амплификации, а в участках солидизации — высокий уровень амплификации (см. рисунок, ж). В 2 (11%) случаях увеличения CEP17 (без амплификации гена ) отмечена внутриопухолевая гетерогенность.

Из 59 образцов опухолей с положительным статусом амплификация гена определена в 10 (17%) случаях, увеличение CEP17 выявлено в 11 (19%) и амплификация гена совместно с увеличением CEP17 — в 6 (10%) случаях. Из 47 образцов опухолей с неопределенным статусом амплификация гена определена в 2 (4%) случаях, увеличение CEP17 выявлено в 8 (17%) случаях и амплификация гена совместно с увеличением CEP17 — в 1 (2%). В материале опухолей с отрицательным статусом амплификация гена и увеличение CEP17 не отмечены. Таким образом, амплификацию гена и амплификацию гена совместно с увеличением CEP17 достоверно чаще определяли в опухолях с положительным статусом по сравнению с опухолями с неопределенным статусом (<0,01). Увеличение CEP17 с одинаковой частотой отмечено в опухолях с положительным и неопределенным статусом.

Из 32 образцов опухолей с гетерогенным ИГХ-окрашиванием амплификация гена выявлена в 1 (3%), увеличение CEP17 — в 7 (22%) и амплификация гена совместно с увеличением CEP17 — в 2 (6%) случаях. Таким образом, увеличение CEP17 достоверно чаще определяли в опухолях с гетерогенным ИГХ-окрашиванием по сравнению с амплификацией гена . В то же время амплификация гена выявлена в 3 случаях с гетерогенным ИГХ-окрашиванием (2 случая амплификации гена совместно с увеличением CEP17). В этих случаях в образцах с HER2-отрицательным ИГХ-окрашиванием отмечали наличие амплификации гена , как и в образцах с HER2-положительным ИГХ-окрашиванием той же опухоли. Данный факт подтверждает возможность наличия амплификации гена в образцах с HER2-отрицательным ИГХ-окрашиванием. По-видимому, это обусловлено посттранскрипционными механизмами регуляции белка HER2 в разных участках одной опухоли, что приводит к гетерогенности ИГХ-окрашивания.

В образцах НМКРЛ амплификацию гена и гена совместно с увеличением CEP17 чаще определяли в аденокарциноме по сравнению с плоскоклеточным раком (<0,001). Увеличение CEP17 одинаково часто отмечали в аденокарциноме и при плоскоклеточном раке. Распределение случаев с амплификацией гена и увеличением CEP17 не имело достоверной связи со степенью дифференцировки НМКРЛ.

В нашем исследовании с помощью тканевых матриц пригодными для оценки оказались 90% образцов, что в большой мере связано с возможностью изучения трех образцов опухоли.

В исследовании образцов НМКРЛ почти в половине случаев было положительное и неопределенное ИГХ-окрашивание, что согласуется с данными литературы [11]. Однако в ряде исследований [6—10, 12—14] сообщается о более низких значениях (4—30%) положительного и неопределенного ИГХ-окрашивания при НМКРЛ. Высокий показатель неопределенного и положительного ИГХ-окрашивания в нашем исследовании связан с тем, что мы оценивали ИГХ-окрашивание в трех участках опухоли, исключая гетерогенность окрашивания.

Положительный статус опухоли чаще выявляли в аденокарциноме по сравнению с плоскоклеточным раком, в высоко- и умереннодифференцированной аденокарциноме. Аналогичные результаты получены в других исследованиях [1, 6, 9, 12, 14]. Однако G. Cox и соавт. [8] не нашли взаимосвязи статуса опухоли с гистогенезом и дифференцировкой.

Амплификация гена выявлена в 19 (9%) случаях НМКРЛ: в 7 (3%) — амплификация гена совместно с увеличением CEP17, в 8 (4%) — низкий уровень амплификации гена и в 4 (2%) — высокий уровень амплификация гена (все случаи представлены аденокарциномой легкого). По данным литературы [7, 10, 12—14], высокий уровень амплификации гена  — редкое явление при НМКРЛ (1—5% случаев) и чаще определяется низкий уровень амплификации гена , что соответствует нашим данным. По данным H. Nakamura и соавт. [12], низкий уровень амплификации гена при НМКРЛ взаимосвязан с увеличением CEP17, что также соответствует нашим данным.

C. Marchio и соавт. [17] показали, что из 18 случаев рака молочной железы с увеличением количества метки CEP17, по данным FISH-анализа, только в одном случае была полисомия 17-й хромосомы. При НМКРЛ в 26 (12%) случаях мы выявили увеличение CEP17, во всех случаях незначительной степени. H. Nakamura и соавт. [12] указывают на более высокие значения увеличения CEP17 при НМКРЛ — 44%. Вероятно, при НМКРЛ, как и при раке молочной железы, увеличение CEP17 связано с изменениями в центромерном участке 17-й хромосомы, а не с полисомией 17-й хромосомы. При увеличении CEP17 ИГХ-статус опухоли был положительный (17 случаев) или неопределенный (9 случаев), отрицательный отсутствовал, что может указывать на нетранскрипционную регуляцию белка HER2 в клетках.

В нашем исследовании между ИГХ-статусом и амплификацией гена выявлена умеренная корреляция (=0,38, <0,001). Наличие связи между ИГХ-статусом и амплификацией гена при НМКРЛ опубликовано в других исследованиях [8, 14]. Однако G. Pelosi и соавт. [13] не нашли такой взаимосвязи. При НМКРЛ амплификацию гена определяли чаще в аденокарциноме по сравнению с плоскоклеточным раком, что соответствует одним данным литературы [9] и противоречит другим [18].

Амплификацию гена выявляли чаще в опухолях с положительным статусом по сравнению с неопределенным и отсутствием в опухолях с отрицательным статусом. Таким образом, при НМКРЛ трех кусочков ткани достаточно для исключения гетерогенности при ИГХ-окрашивании на HER2. Однако по сравнению с данными литературы в нашем исследовании увеличение количества опухолей с положительным и неопределенным статусом привело к уменьшению вероятности обнаружения амплификации гена соответственно в 27% (16 из 59 случаев с положительным статусом) и в 6% (3 из 47 случаев с неопределенным статусом) случаев. В то же время большая частота обнаружения белка HER2 по сравнению с амплификацией гена указывает на наличие других регуляторных механизмов (посттранскрипционных), влияющих на уровень белка HER2 в клетках НМКРЛ, и гетерогенность этих механизмов в разных участках карциномы.

В НМКРЛ отмечается значительная внутриопухолевая гетерогенность ИГХ-окрашивания HER2 (30% опухолей), чаще в опухолях с неопределенным статусом по сравнению с положительным. В противоположность этому не отмечается внутриопухолевая гетерогенность амплификации гена и только в 2 случаях гетерогенность увеличения CEP17. Также ввиду гетерогенного ИГХ-окрашивания белка HER2 существует возможность обнаружения амплификации гена в образцах с HER2-отрицательным ИГХ-окрашиванием. T. Grob и соавт. [9] при НМКРЛ находили не только гетерогенность ИГХ-окрашивания, но и выраженную внутриопухолевую гетерогенность амплификации гена  — в 4 из 10 случаев с высоким уровнем амплификации гена : в 2 случаях также найден и низкий уровень амплификации гена , а в 2 — отсутствие амплификации гена. В нашем исследовании в одном случае умереннодифференцированной аденокарциномы легкого выявлен высокий уровень амплификации гена в участках опухоли с солидным строением и низкий уровень амплификации гена в участках с железисто-подобным строением.

Таким образом, при НМКРЛ отмечается повышенный уровень белка HER2 и значительно реже — изменение активности в гене (амплификация) как причина повышенного белкового синтеза. В аденогенном раке легкого по сравнению с эпидермоидным чаще наблюдается изменение HER2 (erbB2), как и EGFR (erbB1), что, вероятно, связано с коэкспрессией онкогенов семейства HER (erbB).

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.М.А., В.В.К.

Сбор и обработка материала: Д.С.К., А.М.А.

Написание текста: Д.С.К., А.М.А.

Редактирование: А.Ф.Л., Е.Л.Л., Л.М.Н.