Завалишина Л.Э.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздравсоцразвития России

Данилова Н.В.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздрава РФ; ГБОУ ДПО "Российская медицинская академия последипломного образования", Москва

Мационис А.Э.

ГБУ Ростовской области "Патологоанатомическое бюро", Ростов-на-Дону

Павленко И.А.

ГБУ Ростовской области "Патологоанатомическое бюро", Ростов-на-Дону

Особенности амплификации генов на длинном плече 17-й хромосомы в различных молекулярно-генетических подтипах рака молочной железы

Журнал: Архив патологии. 2014;76(2): 8-12

Просмотров : 24

Загрузок :

Как цитировать

Завалишина Л. Э., Данилова Н. В., Мационис А. Э., Павленко И. А. Особенности амплификации генов на длинном плече 17-й хромосомы в различных молекулярно-генетических подтипах рака молочной железы. Архив патологии. 2014;76(2):8-12.

Авторы:

Завалишина Л.Э.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздравсоцразвития России

Все авторы (4)

Амплификация генов - один из механизмов активации онкогенов в процессе развития опухоли, известный в том числе и при раке молочной железы (РМЖ) [1]. В литературе в различных РМЖ описаны амплификации таких генов, как HER2/neu, EGFR, MYC, CCND1, AIB1, FGFR1, S6K, TOP2A, EMS1, FGF3, AKT2 и PIP4K2 [2]. При этом в большинстве случаев амплификация является неуникальным событием для одного гена и затрагивает целые фрагменты хромосом, однако без пропорционального увеличения остального генетического материала клетки [3]. Предполагают, что амплификация того или иного локуса дает малигнизированной клетке селективное преимущество и во многом обеспечивает прогрессию опухоли. Например, амплификация гена HER2/neu приводит к усиленной пролиферации, метастазированию и в целом ассоциирована с плохим прогнозом: более быстрым рецидивированием и меньшей общей выживаемостью [4, 5]. С другой стороны, продукт амплифицированного гена может быть мишенью для таргетной терапии (так, моноклональное антитело к рецептору HER2/neu назначается больным РМЖ или раком желудка с установленным фактом наличия амплификации гена HER2/neu) [6, 7].

Несмотря на то что как клинически значимый HER2/neu-позитивный фенотип был описан более 20 лет назад, механизм амплификации гена HER2/neu в частности, как и механизмы амплификации в целом, остается неизученным.

В настоящее время общепринятой моделью амплификации для опухолей разного типа, в том числе и для РМЖ, является так называемая BFB (breakage-fusion-bridge)-модель. Суть ее в том, что интрахромосомная амплификация возникает путем двуцепочечного разрыва ДНК с последующим «слипанием» концов сестринских хроматид и образованием характерного «мостика», четко выявляемого на цитогенетических препаратах. В результате образуется нестабильная дицентрическая хромосома, в которой во время анафазы происходит следующий двуцепочечный разрыв. Итогом повторяющихся BFB-циклов служат инвертированные повторы, иногда длиной более мегабазы [1].

Однако вышеописанная модель амплификации не дает ответа на вопрос о причинах и закономерностях возникновения двуцепочечных разрывов. Случайный это процесс или селективное событие? Почему амплификация возникает в определенных локусах на хромосоме? Очевидно, выяснение механизма амплификации в целом и его особенностей при РМЖ в частности может быть полезным в понимании этиологии возникновения различных молекулярно-генетических подгрупп РМЖ, а также послужить основой для разработки новых таргетных препаратов антираковой терапии.

17-я хромосома является одной из самых богатых генами хромосом у человека, а потому хорошо подходит для изучения механизмов амплификации. К тому же на q-плече 17-й хромосомы расположены многие гены, аберрации которых описаны при РМЖ. Известно, например, что амплификации затрагивают в первую очередь два локуса - 17q12 и 17q21, где локализованы гены HER2/neu и TOP2A соответственно [7-10]. Амплификации HER2/neu встречаются в двух молекулярно-генетических подтипах РМЖ - люминальном В и HER2/neu-положительном [5, 11]. TOP2A локализован дистальнее гена HER2/neu и кодирует белок, который играет ключевую роль в делении клеток, модифицируя топологический статус ДНК [12]. Амплификация TOP2A, впрочем, как и делеция, часто встречается в HER2/neu-положительных РМЖ - в 8-37% случаев [13].

17-я хромосома демонстрирует крайне сложный характер амплификаций - вплоть до амплификации центромерного региона, явления, которое ранее именовалось «полисомия» (в настоящее время термин устарел). Сопоставление характера амплификаций и коамплификаций на одной и той же хромосоме в различных молекулярно-генетических подтипах, по нашему мнению, способно пролить свет на особенности и детали этого процесса.

Целью настоящего исследования явилось установление особенностей механизма амплификации генов на длинном плече 17-й хромосомы в различных молекулярно-генетических подтипах РМЖ.

Материал и методы

Материалом для исследования послужили образцы опухолей от 272 пациентов, возраст которых колебался от 26 до 78 лет (в среднем - 62 года), с установленным гистологическим диагнозом инфильтрирующей карциномы молочной железы. Флюоресцентную гибридизацию in situ (FISH) проводили по стандартной методике с использованием наборов HER2 FISH pharm Dx Kit и TOP2A FISH pharm Dx Kit («Dako»). Результаты оценивали с помощью флюоресцентного микроскопа Leica DM RXA при ув. 1000. В случае определения статуса HER2 оценку наличия/отсутствия амплификации проводили, подсчитывая соотношение красных и зеленых меток (соответствующих меченым участкам гена HER2 и CEP17) в 20 ядрах опухолевых клеток. При соотношении красных и зеленых меток 2 и более, а также при наличии более 6 красных сигналов в ядре, даже если соотношение красных и зеленых сигналов менее 2, HER2-статус считали положительным [14].

В случае оценки статуса гена TOP2A оценивали соотношение красных и зеленых сигналов (соответствующих меченым участкам гена TOP2A и CEP17) в 60 ядрах опухолевых клеток. Случаями с амплификацией TOP2A считали те, в которых соотношение TOP2A и CEP17 было 2 и более, случаями с делецией - те, где соотношение составило 0,8 и менее [8]. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Сравнение качественных переменных в независимых группах проводили с помощью непараметрического критерия &khgr;2 или точного критерия Фишера. Критическое значение уровня достоверности принималось равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Из 272 исследованных образцов результаты FISH были получены для 265. 7 образцов оказались неинформативными из-за отсутствия инвазивного компонента опухоли на срезах, а также плохого качества фиксации и проводки и как следствие артефициальных реакций. Эти образцы были исключены из дальнейшего анализа. На основании имеющихся данных об экспрессии таких маркеров, как рецептор эстрогена (ER), рецептор прогестерона (PR), Ki-67 и HER2/neu, оставшиеся образцы были отнесены к одной из четырех молекулярно-генетических подгрупп - люминальным А, люминальным В, HER2(+) и трижды-негативным РМЖ (ТНРМЖ). При этом особо отмечалось увеличение количества центромерных сигналов 17-й хромосомы (CEP17), выявляемое при FISH-анализе (таблица)

.

Как видно из таблицы, амплификации в гене HER2/neu выявлены в 18,5% случаев. Это немного меньше общепринятых значений в 20-30% [6, 15], хотя есть многочисленные данные о том, что уровень амплификаций HER2/neu в популяции может колебаться в пределах 15-20% [9, 16].

Примерно с такой же частотой, как амплификация HER2/neu, наблюдалось увеличение количества центромерных сигналов при FISH. В нашей выборке 25% образцов (67 из 265) имело количество CEP17 более 3 на ядро. Это согласуется с данными других исследователей, приводящих цифры от 9 до 50% случаев с увеличением CEP17.

В отличие от амплификации HER2/neu, увеличение CEP17 встречается во всех молекулярно-генетических подтипах, что наталкивает на мысль об отсутствии связи между этими двумя признаками. Действительно, различия в частоте встречаемости увеличенного количества CEP17 и амплификации HER2/neu статистически недостоверны (p>0,05). Наши данные согласуются с данными L. Dal Lago и соавт. [17], которые не обнаружили увеличения экспрессии мРНК HER2 методом реал-тайм ПЦР в опухолях с увеличенным количеством центромерных сигналов, тем самым продемонстрировав, что амплификация HER2/neu независима от центромерных аберраций при РМЖ. Вместе с тем из таблицы наглядно видно, что в люминальных А опухолях доля случаев с увеличенным содержанием CEP17 наименьшая (13 (11,9%) из 109, а в люминальных В с амплификацией HER2/neu - наибольшая 9 (53%) из 17.

Амплификации при РМЖ часто множественные. Сообщается, например, что 41% опухолей с амплификацией HER2/neu несут коамплификации с другими генами, локализованными на q-плече 17-й хромосомы [2]. В связи с этим мы проанализировали частоту встречаемости коамплификаций HER2/neu и CEP17 при РМЖ. Наблюдаемая частота коамплификаций (в абсолютных цифрах) составила 16, теоретическая - 13,1; RR - 1,22; p>=0512.

Хотя различия теоретических и наблюдаемых частот, вычисленных на основе частоты амплификации каждого локуса по отдельности, оказались статистически недостоверными (p>0,05), относительный риск RR более 1 означает, что коамплификации встречаются как минимум не реже ожидаемого. Это свидетельствует о том, что в опухолях с уровнем генетической нестабильности, достаточным для развития одной амплификации, возникают и коамплификации, причем этот процесс не имеет отрицательной регуляции, т.е. опухолевая клетка не обладает механизмами, сдерживающими уровень коамплификаций.

Коамплификации HER2 и CEP17 обнаруживаются и в HER2/neu-положительном подтипе РМЖ, и в люминальном В с амплификацией HER2/neu. Однако в последних вероятность возникновения коамплификации в 2,47 раза выше (р<0,05).

Известно, что в РМЖ с амплификацией HER2/neu часто происходят коамплификации генов региона 17q21, в частности TOP2A [18]. Мы обнаружили, что они встречаются исключительно в люминальном В-подтипе РМЖ. Вероятность возникновения коамплификаций TOP2A и HER2/neu в люминальном подтипе В в 5,4 раза больше ожидаемой (р<0,001).

Наблюдаемая частота коамплификаций (в абсолютных числах) составила 9, теоретическая - 1,66; RR - 5,42.

Величина относительного риска RR, значительно превышающая 1, свидетельствует о том, что амплификация TOP2A высокозначимо ассоциирована с HER2/neu-положительными РМЖ. Это соответствует данным других авторов [10, 18], показавших, что амплификации TOP2A очень редки в отсутствие амплификации HER2/neu. Следует подчеркнуть, что среди всех HER2/neu-положительных РМЖ амплификация TOP2A обнаруживается нами исключительно в люминальных В опухолях.

Таким образом, люминальный В РМЖ характеризуется повышенной вероятностью возникновения коамплификаций (CEP17 и HER2/neu, HER2/neu и TOP2A) на 17-й хромосоме. Оценивая статус гена TOP2A методом FISH, мы обнаружили амплификацию TOP2A в 9 образцах из 17 люминальных В РМЖ с амплификацией HER2/neu. Из них в 3 случаях было выявлено также увеличение количества CEP17. Делеция TOP2A была выявлена в 5 случаях, и все они демонстрировали увеличение количества центромерных сигналов. Статистический расчет с использованием точного критерия Фишера показывает, что в опухолях с амплификацией HER2/neu и увеличенным количеством CEP17 делеция гена TOP2A происходит чаще, чем амплификация (р<=0,031).

Амплификация сразу трех локусов на одной хромосоме - редкое событие и встречается в 17% люминальных В РМЖ (или 1,1% всех случаев РМЖ). Амплификация HER2/neu в сочетании с увеличенным количеством CEP17 статистически значимо чаще сопровождается делецией, а не амплификацией TOP2A. Об этом уже сообщалось ранее [19]. Именно этот факт дает нам возможность предположить существование отличий механизма инициации амплификации в различных молекулярно-генетических подтипах РМЖ.

Процесс начинается с двуцепочечного разрыва на 17-й хромосоме, возникающего случайным образом, либо дистальнее гена TOP2A (редко), либо между HER2/neu и TOP2A (в значительной части опухолей). Образующиеся в результате «липкие» концы сестринских хроматид сливаются с образованием дицентрической хромосомы. Такие хромосомы крайне нестабильны, и во время анафазы митоза происходит еще один двуцепочечный разрыв. Паттерн результирующей амплификации во многом будет зависеть именно от локализации этого разрыва. Он может произойти проксимальнее гена HER2/neu, при этом не затрагивая центромеру (рис. 1)

Рисунок 1. Предполагаемая последовательность событий, ведущая к возникновению амплификаций HER2/neu без увеличения числа центромерных сигналов 17-й хромосомы при РМЖ. Здесь и на рис. 2
Рисунок 2. Предполагаемая последовательность событий, ведущая к возникновению амплификаций HER2/neu и увеличению числа центромерных сигналов 17-й хромосомы при РМЖ.
: зеленым цветом обозначены перицентромерные локусы на хромосоме, красным — локус 17q12, где локализован ген HER2/neu. а — двуцепочечный разрыв на 17-й хромосоме (с потерей дистально расположенного генетического материала); б — соединение концов сестринских хроматид; в — второй двуцепочечный разрыв нестабильной дицентрической хромосомы в анафазе митоза; г — соединение концов сестринских хроматид; д — двуцепочечный разрыв. Микрофотография иллюстрирует результат повторных BFB-циклов (FISH, ?100).
. Результатом будет «классическая» амплификация с множеством копий гена HER2/neu и нормальным количеством CEP17. Такой паттерн амплификации характерен для большинства HER2/neu(+) - 78% - и половины люминальных В опухолей с амплификацией HER2/neu. Если же второй двуцепочечный разрыв произойдет в перицентромерном регионе, то на FISH мы увидим увеличенное число центромерных сигналов, а также меток к гену HER2/neu (рис. 2). Этот паттерн амплификации наблюдался нами в 7 из 32 случаев HER2/neu-положительных РМЖ и в 9 из 17 люминальных В опухолей с амплификацией HER2/neu. Наконец, если первоначальный разрыв локализуется дистальнее TOP2A (вероятность такого события невелика и характерна для люминальных В опухолей), а второй двуцепочечный разрыв произойдет достаточно далеко от центромеры, результатом такого события будет коамплификация генов HER2/neu и TOP2A. По нашим данным, такая коамплификация наблюдается в 18,3% случаев люминальных В РМЖ с наличием амплификации HER2/neu. В литературе количество TOP2A-позитивных опухолей варьирует от 8 до 41% [8], однако наши данные полностью укладываются в этот диапазон. Коамплификация сразу трех локусов - TOP2A, HER2/neu и CEP17 - исключительно редкое событие при РМЖ и происходит в том случае, если первый двуцепочечный разрыв локализовался дистальнее гена TOP2A, а второй - в районе центромеры.Необходимо особо подчеркнуть, что данные варианты предполагаемой последовательности событий при амплификации различных локусов на длинном плече 17-й хромосомы касаются лишь амплификации в виде так называемых гомогенно-окрашенных последовательностей (homogenously stained regions - HSR). Помимо этих внутрихромосомных амплификаций, в литературе описано существование экстрахромосомных ампликонов - так называемых двойных микрохромосом (double minutes - DM) [1]. Происходит при амплификации различных локусов на 17q образование двойных микрохромосом или нет, установить на наших образцах невозможно. Для этого нужны модельные системы (клеточные культуры), где можно анализировать характер амплификаций в метафазных пластинках, а не интерфазных ядрах.

Заключение

Паттерн внутрихромосомных амплификаций на q-плече 17-ой хромосомы во многом зависит от точек локализации инициирующего и последующих двуцепочечных разрывов ДНК. Несомненно, что возникновение двуцепочечных разрывов напрямую связано с дефектами функционирования системы контроля целостности генома. Поиск причин, приводящих к сбою в ее работе, поможет лучше понять природу различий процесса инициации амплификации в разных молекулярно-генетических подтипах РМЖ.

Литература

  1. Albertson D.G. Gene amplification in cancer. Trends Genet. 2006; 22: 447-55.
  2. Staaf J., Jönsson G., Ringnér M. et al. Landscape of somatic allelic imbalances and copy number alterations in HER2-amplified breast cancer. Breast Cancer Res. 2011; 13 (6): R129.
  3. Hastings P.J., Lupski J.R., Rosenberg S.M., Ira G. Mechanisms of change in gene copy number. Nat. Rev. Genet. 2009; 10: 551-64.
  4. Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Рязанцева А.А., Франк Г.А. Исследование HER2-статуса рака молочной железы. Методические аспекты. Архив патологии. 2011; 73 (1): 51-4.
  5. Parker J.S., Mullins M., Cheang M.C. et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J. Clin. Oncol. 2009; 27 (8): 1160-7.
  6. Chia S., Norris B., Speers C. et al. Human epidermal growth factor receptor 2 overexpression as a prognostic factor in a large tissue microarray series of node-negative breast cancers. J. Clin. Oncol. 2008; 26: 5697-704.
  7. Guiu S., Liegard M., Favier L., van Praagh I., Largillier R., Weber B., Coeffic D., Moreau L., Priou F., Campone M. et al. Long-term follow-up of Her2-overexpressing stage II or III breast cancer treated by anthracycline-free neoadjuvant chemotherapy. Ann. Oncol. 2011; 22: 321-8.
  8. Kim A., Hyung Chan Shin., Young K.B. Multiplication of chromosome 17 centromere is associated with prognosis in patients with invasive breast cancers exhibiting normal HER2 and TOP2A status. J. Breast Cancer. 2012; 15 (1): 24-33.
  9. Marla S., Roxburgh P., Burton P., Stallard S., Mallon E., Canney P., Cooke T. HER2 positive early breast cancers: tumour demographics and trastuzumab therapy in the real-world. Cancer Res. 2009; 69 (2, Suppl. 1): abstr. 3159.
  10. Nielsen K.V., Müller S., Møller S. et al. Aberrations of ERBB2 and TOP2A genes in breast cancer. Mol. Oncol. 2010; 4: 161-8.
  11. Кулигина Е.Ш. Эпидемиологические и молекулярные аспекты рака молочной железы. Практическая онкология. 2010; 11 (4): 203-16.
  12. Berger J.M., Gamblin S.J., Harrison S.C., Wang J.C. Structure and mechanism of DNA topoisomerase II. Nature. 1996; 379: 225-32.
  13. Reinholz M.M., Bruzek A.K., Visscher D.W. et al. Breast cancer and aneusomy 17: implications for carcinogenesis and tHERapeutic response. Lancet Oncol. 2009; 10 (3): 267-77.
  14. Wolff A.C., Hammond M.E., Hicks D.G. et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: american society of clinical oncology/college of american pathologists clinical practice guideline update. J. Clin. Oncol. 2013; 31 (31): 3997-4013
  15. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G. et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987; 235: 177-82.
  16. Wedad M.H., Ruschoff J., Bilous M. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod. Pathol. 2013. doi: 10.1038/modpathol.2013.103.
  17. Dal Lago L., Durbecq V., Desmedt C. et al. Correction for chromosome-17 is critical for the determination of true HER-2/neu gene amplification status in breast cancer. Mol. Cancer Ther. 2006; 5 (10): 2572-9.
  18. Sircoulomb F., Bekhouche I., Finetti P. et al. Genome profiling of ERBB2-amplified breast cancers. BMC Cancer. 2010; 10: 539-67.
  19. Beser A.R., Tuzlali S., Guzey D. et al. HER-2, TOP2A and chromosome 17 alterations in breast cancer. Pathol. Oncol. Res. 2007; 13 (3): 180-5.
!!

Литература

  1. Albertson D.G. Gene amplification in cancer. Trends Genet. 2006; 22: 447-55.
  2. Staaf J., Jönsson G., Ringnér M. et al. Landscape of somatic allelic imbalances and copy number alterations in HER2-amplified breast cancer. Breast Cancer Res. 2011; 13 (6): R129.
  3. Hastings P.J., Lupski J.R., Rosenberg S.M., Ira G. Mechanisms of change in gene copy number. Nat. Rev. Genet. 2009; 10: 551-64.
  4. Zavalishina L.E., Andreeva Yu.Yu., Ryazantseva A.A., Frank G.A. Research of breast cancer HER2-status. Methodical aspects. Arkhiv patologii. 2011; 73 (1): 51-54. (In Russ.)
  5. Parker J.S., Mullins M., Cheang M.C. et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J. Clin. Oncol. 2009; 27 (8): 1160-7.
  6. Chia S., Norris B., Speers C. et al. Human epidermal growth factor receptor 2 overexpression as a prognostic factor in a large tissue microarray series of node-negative breast cancers. J. Clin. Oncol. 2008; 26: 5697-704.
  7. Guiu S., Liegard M., Favier L., van Praagh I., Largillier R., Weber B., Coeffic D., Moreau L., Priou F., Campone M. et al. Long-term follow-up of Her2-overexpressing stage II or III breast cancer treated by anthracycline-free neoadjuvant chemotherapy. Ann. Oncol. 2011; 22: 321-8.
  8. Kim A., Hyung Chan Shin., Young K.B. Multiplication of chromosome 17 centromere is associated with prognosis in patients with invasive breast cancers exhibiting normal HER2 and TOP2A status. J. Breast Cancer. 2012; 15 (1): 24-33.
  9. Marla S., Roxburgh P., Burton P., Stallard S., Mallon E., Canney P., Cooke T. HER2 positive early breast cancers: tumour demographics and trastuzumab therapy in the real-world. Cancer Res. 2009; 69 (2, Suppl. 1): abstr. 3159.
  10. Nielsen K.V., Müller S., Møller S. et al. Aberrations of ERBB2 and TOP2A genes in breast cancer. Mol. Oncol. 2010; 4: 161-8.
  11. Kuligina E.Sh. Epidemiological and molecular aspects of breast cancer. Prakticheskaya onkologiya. 2010; 11 (4): 203-216. (In Russ.)
  12. Berger J.M., Gamblin S.J., Harrison S.C., Wang J.C. Structure and mechanism of DNA topoisomerase II. Nature. 1996; 379: 225-32.
  13. Reinholz M.M., Bruzek A.K., Visscher D.W. et al. Breast cancer and aneusomy 17: implications for carcinogenesis and tHERapeutic response. Lancet Oncol. 2009; 10 (3): 267-77.
  14. Wolff A.C., Hammond M.E., Hicks D.G. et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: american society of clinical oncology/college of american pathologists clinical practice guideline update. J. Clin. Oncol. 2013; 31 (31): 3997-4013
  15. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G. et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987; 235: 177-82.
  16. Wedad M.H., Ruschoff J., Bilous M. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod. Pathol. 2013. doi: 10.1038/modpathol.2013.103.
  17. Dal Lago L., Durbecq V., Desmedt C. et al. Correction for chromosome-17 is critical for the determination of true HER-2/neu gene amplification status in breast cancer. Mol. Cancer Ther. 2006; 5 (10): 2572-9.
  18. Sircoulomb F., Bekhouche I., Finetti P. et al. Genome profiling of ERBB2-amplified breast cancers. BMC Cancer. 2010; 10: 539-67.
  19. Beser A.R., Tuzlali S., Guzey D. et al. HER-2, TOP2A and chromosome 17 alterations in breast cancer. Pathol. Oncol. Res. 2007; 13 (3): 180-5.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail