Амплификация генов - один из механизмов активации онкогенов в процессе развития опухоли, известный в том числе и при раке молочной железы (РМЖ) [1]. В литературе в различных РМЖ описаны амплификации таких генов, как HER2/neu, EGFR, MYC, CCND1, AIB1, FGFR1, S6K, TOP2A, EMS1, FGF3, AKT2 и PIP4K2 [2]. При этом в большинстве случаев амплификация является неуникальным событием для одного гена и затрагивает целые фрагменты хромосом, однако без пропорционального увеличения остального генетического материала клетки [3]. Предполагают, что амплификация того или иного локуса дает малигнизированной клетке селективное преимущество и во многом обеспечивает прогрессию опухоли. Например, амплификация гена HER2/neu приводит к усиленной пролиферации, метастазированию и в целом ассоциирована с плохим прогнозом: более быстрым рецидивированием и меньшей общей выживаемостью [4, 5]. С другой стороны, продукт амплифицированного гена может быть мишенью для таргетной терапии (так, моноклональное антитело к рецептору HER2/neu назначается больным РМЖ или раком желудка с установленным фактом наличия амплификации гена HER2/neu) [6, 7].

Несмотря на то что как клинически значимый HER2/neu-позитивный фенотип был описан более 20 лет назад, механизм амплификации гена HER2/neu в частности, как и механизмы амплификации в целом, остается неизученным.

В настоящее время общепринятой моделью амплификации для опухолей разного типа, в том числе и для РМЖ, является так называемая BFB (breakage-fusion-bridge)-модель. Суть ее в том, что интрахромосомная амплификация возникает путем двуцепочечного разрыва ДНК с последующим «слипанием» концов сестринских хроматид и образованием характерного «мостика», четко выявляемого на цитогенетических препаратах. В результате образуется нестабильная дицентрическая хромосома, в которой во время анафазы происходит следующий двуцепочечный разрыв. Итогом повторяющихся BFB-циклов служат инвертированные повторы, иногда длиной более мегабазы [1].

Однако вышеописанная модель амплификации не дает ответа на вопрос о причинах и закономерностях возникновения двуцепочечных разрывов. Случайный это процесс или селективное событие? Почему амплификация возникает в определенных локусах на хромосоме? Очевидно, выяснение механизма амплификации в целом и его особенностей при РМЖ в частности может быть полезным в понимании этиологии возникновения различных молекулярно-генетических подгрупп РМЖ, а также послужить основой для разработки новых таргетных препаратов антираковой терапии.

17-я хромосома является одной из самых богатых генами хромосом у человека, а потому хорошо подходит для изучения механизмов амплификации. К тому же на q-плече 17-й хромосомы расположены многие гены, аберрации которых описаны при РМЖ. Известно, например, что амплификации затрагивают в первую очередь два локуса - 17q12 и 17q21, где локализованы гены HER2/neu и TOP2A соответственно [7-10]. Амплификации HER2/neu встречаются в двух молекулярно-генетических подтипах РМЖ - люминальном В и HER2/neu-положительном [5, 11]. TOP2A локализован дистальнее гена HER2/neu и кодирует белок, который играет ключевую роль в делении клеток, модифицируя топологический статус ДНК [12]. Амплификация TOP2A, впрочем, как и делеция, часто встречается в HER2/neu-положительных РМЖ - в 8-37% случаев [13].

17-я хромосома демонстрирует крайне сложный характер амплификаций - вплоть до амплификации центромерного региона, явления, которое ранее именовалось «полисомия» (в настоящее время термин устарел). Сопоставление характера амплификаций и коамплификаций на одной и той же хромосоме в различных молекулярно-генетических подтипах, по нашему мнению, способно пролить свет на особенности и детали этого процесса.

Целью настоящего исследования явилось установление особенностей механизма амплификации генов на длинном плече 17-й хромосомы в различных молекулярно-генетических подтипах РМЖ.

Материалом для исследования послужили образцы опухолей от 272 пациентов, возраст которых колебался от 26 до 78 лет (в среднем - 62 года), с установленным гистологическим диагнозом инфильтрирующей карциномы молочной железы. Флюоресцентную гибридизацию in situ (FISH) проводили по стандартной методике с использованием наборов HER2 FISH pharm Dx Kit и TOP2A FISH pharm Dx Kit («Dako»). Результаты оценивали с помощью флюоресцентного микроскопа Leica DM RXA при ув. 1000. В случае определения статуса HER2 оценку наличия/отсутствия амплификации проводили, подсчитывая соотношение красных и зеленых меток (соответствующих меченым участкам гена HER2 и CEP17) в 20 ядрах опухолевых клеток. При соотношении красных и зеленых меток 2 и более, а также при наличии более 6 красных сигналов в ядре, даже если соотношение красных и зеленых сигналов менее 2, HER2-статус считали положительным [14].

В случае оценки статуса гена TOP2A оценивали соотношение красных и зеленых сигналов (соответствующих меченым участкам гена TOP2A и CEP17) в 60 ядрах опухолевых клеток. Случаями с амплификацией TOP2A считали те, в которых соотношение TOP2A и CEP17 было 2 и более, случаями с делецией - те, где соотношение составило 0,8 и менее [8]. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Сравнение качественных переменных в независимых группах проводили с помощью непараметрического критерия &khgr;2 или точного критерия Фишера. Критическое значение уровня достоверности принималось равным 0,05.

Из 272 исследованных образцов результаты FISH были получены для 265. 7 образцов оказались неинформативными из-за отсутствия инвазивного компонента опухоли на срезах, а также плохого качества фиксации и проводки и как следствие артефициальных реакций. Эти образцы были исключены из дальнейшего анализа. На основании имеющихся данных об экспрессии таких маркеров, как рецептор эстрогена (ER), рецептор прогестерона (PR), Ki-67 и HER2/neu, оставшиеся образцы были отнесены к одной из четырех молекулярно-генетических подгрупп - люминальным А, люминальным В, HER2(+) и трижды-негативным РМЖ (ТНРМЖ). При этом особо отмечалось увеличение количества центромерных сигналов 17-й хромосомы (CEP17), выявляемое при FISH-анализе (таблица)

Как видно из таблицы, амплификации в гене HER2/neu выявлены в 18,5% случаев. Это немного меньше общепринятых значений в 20-30% [6, 15], хотя есть многочисленные данные о том, что уровень амплификаций HER2/neu в популяции может колебаться в пределах 15-20% [9, 16].

Примерно с такой же частотой, как амплификация HER2/neu, наблюдалось увеличение количества центромерных сигналов при FISH. В нашей выборке 25% образцов (67 из 265) имело количество CEP17 более 3 на ядро. Это согласуется с данными других исследователей, приводящих цифры от 9 до 50% случаев с увеличением CEP17.

В отличие от амплификации HER2/neu, увеличение CEP17 встречается во всех молекулярно-генетических подтипах, что наталкивает на мысль об отсутствии связи между этими двумя признаками. Действительно, различия в частоте встречаемости увеличенного количества CEP17 и амплификации HER2/neu статистически недостоверны (p>0,05). Наши данные согласуются с данными L. Dal Lago и соавт. [17], которые не обнаружили увеличения экспрессии мРНК HER2 методом реал-тайм ПЦР в опухолях с увеличенным количеством центромерных сигналов, тем самым продемонстрировав, что амплификация HER2/neu независима от центромерных аберраций при РМЖ. Вместе с тем из таблицы наглядно видно, что в люминальных А опухолях доля случаев с увеличенным содержанием CEP17 наименьшая (13 (11,9%) из 109, а в люминальных В с амплификацией HER2/neu - наибольшая 9 (53%) из 17.

Амплификации при РМЖ часто множественные. Сообщается, например, что 41% опухолей с амплификацией HER2/neu несут коамплификации с другими генами, локализованными на q-плече 17-й хромосомы [2]. В связи с этим мы проанализировали частоту встречаемости коамплификаций HER2/neu и CEP17 при РМЖ. Наблюдаемая частота коамплификаций (в абсолютных цифрах) составила 16, теоретическая - 13,1; RR - 1,22; p>=0512.

Хотя различия теоретических и наблюдаемых частот, вычисленных на основе частоты амплификации каждого локуса по отдельности, оказались статистически недостоверными (p>0,05), относительный риск RR более 1 означает, что коамплификации встречаются как минимум не реже ожидаемого. Это свидетельствует о том, что в опухолях с уровнем генетической нестабильности, достаточным для развития одной амплификации, возникают и коамплификации, причем этот процесс не имеет отрицательной регуляции, т.е. опухолевая клетка не обладает механизмами, сдерживающими уровень коамплификаций.

Коамплификации HER2 и CEP17 обнаруживаются и в HER2/neu-положительном подтипе РМЖ, и в люминальном В с амплификацией HER2/neu. Однако в последних вероятность возникновения коамплификации в 2,47 раза выше (р<0,05).

Известно, что в РМЖ с амплификацией HER2/neu часто происходят коамплификации генов региона 17q21, в частности TOP2A [18]. Мы обнаружили, что они встречаются исключительно в люминальном В-подтипе РМЖ. Вероятность возникновения коамплификаций TOP2A и HER2/neu в люминальном подтипе В в 5,4 раза больше ожидаемой (р<0,001).

Наблюдаемая частота коамплификаций (в абсолютных числах) составила 9, теоретическая - 1,66; RR - 5,42.

Величина относительного риска RR, значительно превышающая 1, свидетельствует о том, что амплификация TOP2A высокозначимо ассоциирована с HER2/neu-положительными РМЖ. Это соответствует данным других авторов [10, 18], показавших, что амплификации TOP2A очень редки в отсутствие амплификации HER2/neu. Следует подчеркнуть, что среди всех HER2/neu-положительных РМЖ амплификация TOP2A обнаруживается нами исключительно в люминальных В опухолях.

Таким образом, люминальный В РМЖ характеризуется повышенной вероятностью возникновения коамплификаций (CEP17 и HER2/neu, HER2/neu и TOP2A) на 17-й хромосоме. Оценивая статус гена TOP2A методом FISH, мы обнаружили амплификацию TOP2A в 9 образцах из 17 люминальных В РМЖ с амплификацией HER2/neu. Из них в 3 случаях было выявлено также увеличение количества CEP17. Делеция TOP2A была выявлена в 5 случаях, и все они демонстрировали увеличение количества центромерных сигналов. Статистический расчет с использованием точного критерия Фишера показывает, что в опухолях с амплификацией HER2/neu и увеличенным количеством CEP17 делеция гена TOP2A происходит чаще, чем амплификация (р<=0,031).

Амплификация сразу трех локусов на одной хромосоме - редкое событие и встречается в 17% люминальных В РМЖ (или 1,1% всех случаев РМЖ). Амплификация HER2/neu в сочетании с увеличенным количеством CEP17 статистически значимо чаще сопровождается делецией, а не амплификацией TOP2A. Об этом уже сообщалось ранее [19]. Именно этот факт дает нам возможность предположить существование отличий механизма инициации амплификации в различных молекулярно-генетических подтипах РМЖ.

Процесс начинается с двуцепочечного разрыва на 17-й хромосоме, возникающего случайным образом, либо дистальнее гена TOP2A (редко), либо между HER2/neu и TOP2A (в значительной части опухолей). Образующиеся в результате «липкие» концы сестринских хроматид сливаются с образованием дицентрической хромосомы. Такие хромосомы крайне нестабильны, и во время анафазы митоза происходит еще один двуцепочечный разрыв. Паттерн результирующей амплификации во многом будет зависеть именно от локализации этого разрыва. Он может произойти проксимальнее гена HER2/neu, при этом не затрагивая центромеру (рис. 1)

Заключение

Паттерн внутрихромосомных амплификаций на q-плече 17-ой хромосомы во многом зависит от точек локализации инициирующего и последующих двуцепочечных разрывов ДНК. Несомненно, что возникновение двуцепочечных разрывов напрямую связано с дефектами функционирования системы контроля целостности генома. Поиск причин, приводящих к сбою в ее работе, поможет лучше понять природу различий процесса инициации амплификации в разных молекулярно-генетических подтипах РМЖ.