Современные подходы к терапии рака молочной железы (РМЖ) предусматривают индивидуальный подход к каждой пациентке с учетом стадии и распространенности процесса, молекулярно-биологического подтипа опухоли [1, 2]. В последние годы разрабатываются альтернативные методы лечения злокачественных новообразований, в том числе дифференцирующая терапия, которая вместо «уничтожения» опухолевых клеток направлена на их «созревание», повышая дифференцировку и снижая злокачественность [3], что может значительно уменьшить побочные эффекты и улучшить качество жизни пациенток [4]. Дополнительным преимуществом дифференцирующей терапии является ее способнось преодолевать резистентность опухолевых клеток, снижая их агрессивность и делая опухоль более чувствительной к классической противоопухолевой терапии [5].

Одним из таких дифференцирующих агентов является белок HLDF, который индуцирует не только дифференцировку клеток линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека в фенотипически зрелые гранулоциты, но и апоптоз, а также подавляет синтез ДНК в культуре этих клеток [6]. Было показано, что HLDF способствует повышению степени дифференцировки клеток инвазивной протоковой карциномы молочной железы, что позволяет рассматривать этот фактор в качестве кандидата для дифференцирующей терапии злокачественных новообразований [7]. Однако полноразмерный HLDF обладает низкой устойчивостью в организме — его период полужизни в плазме крови крысы составляет всего 2 мин. Для защиты от гидролиза была синтезирована ацетиламидная форма пептида HLDF-6, обладающая более длительным периодом полужизни по сравнению с нативной формой [8], при этом действие HLDF-6 на опухолевый процесс в молочной железе остается неизвестным. В связи с чем цель исследования — сравнительная оценка влияния ацетиламидного синтетического пептида HLDF-6 на дифференцировку клеток при различных молекулярно-биологических подтипах РМЖ.

Материал и методы

Изучены биоптаты 33 женщин с РМЖ в возрасте от 33 до 77 лет (средний возраст 62 года), находившихся на лечении в маммологическом отделении Городской клинической больницы №1 Новосибирска. Критерии включения: РМЖ, гистологический тип — инвазивная протоковая карцинома неспецифицированная, размер опухоли T1 и T2, степень дифференцировки опухоли G2, отсутствие неоадъювантной терапии до взятия материала на исследование и онкологических заболеваний другой локализации, а также очагов отдаленного метастазирования. Все исследования проводили в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации. Все пациентки прочитали и подписали информированное согласие на проведение исследований, одобренное этическим комитетом НИИМББ ФИЦ ФТМ.

Полученные от пациенток биоптаты объемом 8 мм³ помещали в 2 флакона и инкубировали при 37°C в течение 72 ч: в первом флаконе был биоптат с 1 мл среды DMEM-F12 (клетки без инкубации), во втором биоптат инкубировали в 1 мл среды DMEM-F12 с добавлением 20 мкг HLDF-6 (клетки, инкубированные с HLDF-6).

Для проведения патогистологического исследования в соответствии со стандартной методикой гистологические срезы толщиной 4—5 мкм подготавливали и окрашивали гематоксилином и эозином. Для оценки относительного содержания опухолевых клеток различной степени дифференцировки в образцах определяли такие цитоморфологические критерии, как степень выраженности ядерного полиморфизма, ядерной атипии и величины ядерно-цитоплазматического отношения с учетом Ноттингемской градирующей системы [9], что представлено на рис. 1.

Рис. 1. Критерии оценки степени дифференцировки опухолевых клеток.

Статистическую обработку проводили с использованием SPSS 22. Для сравнения независимых групп использовали U-критерий Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Результаты исследования представлены как медиана (Me) и интерквартильный размах (Q₁—Q₃).

Результаты и обсуждение

Пациенток с РМЖ разделили на 3 группы согласно молекулярно-биологическому подтипу [10], данные представлены в таблице, ввиду малого количества пациенток с люминальным B HER2-положительным и HER2-положительным подтипами эти пациентки не вошли в исследование.

Молекулярно-биологические подтипы пациенток с РМЖ

Примечание. ER — рецептор эстрогена; PR — рецептор прогестерона; HER2 — 2-й рецептор эпидермального фактора роста человека; Ki-67 — антиген, определяющийся в делящихся клетках.

Исследование показало, что синтетический пептид HLDF-6 оказывает значительное влияние на клетки пациенток с люминальным B HER2-отрицательным подтипом, увеличивая относительное содержание дифференцированных клеток (рис. 2, а, рис. 3, в) и снижая относительное содержание низкодифференцированных клеток (см. рис. 2, б, рис. 3, г). При этом HLDF-6 не оказывает существенного влияния на клетки пациенток с люминальным A и базальноподобным молекулярным подтипами (см. рис. 2, 3).

Рис. 2. Относительное содержание клеток до и после инкубации с HLDF-6 у пациенток с тремя молекулярными подтипами РМЖ.

а — дифференцированные клетки; б — низкодифференцированные клетки. Cell — клетки без инкубации с HLDF-6; Cell+HLDF-6 — клетки, инкубированные с HLDF-6.

Рис. 3. Морфология биоптатов РМЖ до и после влияния HLDF-6.

а — опухоль без воздействия HLDF-6 (Люм A); б — опухоль, инкубированная с HLDF-6 (Люм A); в — опухоль без воздействия HLDF-6 (Люм B); г — опухоль, инкубированная с HLDF-6 (Люм B); д — опухоль без воздействия HLDF-6 (Баз); е — опухоль, инкубированная с HLDF-6 (Баз), ×400.

По данным нашего исследования, базальноподобный подтип РМЖ характеризуется высоким относительным содержанием низкодифференцированных клеток как до, так и после воздействия HLDF-6. Возможной причиной отсутствия эффекта пептида может быть генетическая нестабильность этой группы опухолей, которая отличается наиболее агрессивным течением и наихудшим прогнозом [11].

В противоположность этому люминальный A подтип изначально ассоциируется с низкой степенью злокачественности опухоли. Наше исследование подтверждает высокое относительное содержание дифференцированных клеток в образцах опухоли люминального A подтипа как до, так и после воздействия HLDF-6. Хотя статистически значимого эффекта воздействия пептида не было зафиксировано, тем не менее наблюдалась положительная тенденция к снижению низкодифференцированных клеток.

Люминальный B HER2-отрицательный подтип связан с более агрессивным течением заболевания, частой резистентностью к системной терапии и худшими исходами по сравнению с люминальным A подтипом [12]. Следует отметить, что уровень экспрессии Ki-67 является основным индикатором, используемым для дифференциации люминального A и люминального B (HER2-отрицательного) подтипов, которые требуют различных подходов к лечению [13]. Результаты нашего исследования показывают статистически значимый эффект воздействия HLDF-6 на опухолевые клетки пациенток с люминальным B HER2-отрицательным подтипом, что схематично представлено на рис. 4 и, возможно, связано с комплексным влиянием пептида на экспрессию маркера пролиферации Ki-67.

Рис. 4. Влияние HLDF-6 на клетки пациенток с люминальным B HER2-отрицательным подтипом РМЖ.

Представлено схематическое отображение влияния ацетиламидной формы HLDF-6 на клетки при люминальном B HER2-отрицательном подтипе: снижение содержания низкодифференцированных клеток и повышение дифференцированных.

Заключение

Актуальность дифференцирующей терапии РМЖ обусловлена ее способностью обеспечить персонализированное, менее токсичное и эффективное лечение, особенно для пациенток с устойчивыми формами рака [3—5]. Разработка и внедрение новых дифференцирующих агентов представляют собой перспективное направление в современной онкологии, способное значительно улучшить исходы лечения и качество жизни пациенток с РМЖ. Настоящее исследование показало, что применение HLDF-6 приводит к значительному увеличению относительного содержания дифференцированных клеток при люминальном B подтипе РМЖ, что свидетельствует о снижении злокачественности этого подтипа и позволяет рассматривать синтетический фактор дифференцировки HLDF-6 как перспективное средство для дифференцирующей терапии у пациенток с люминальным B подтипом РМЖ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Студеникина А.А., Аутеншлюс А.И.

Сбор и обработка материала — Мангазеева Е.Д., Богачук А.П., Липкин В.М.

Статистическая обработка — Студеникина А.А.

Написание текста — Студеникина А.А., Мангазеева Е.Д.

Редактирование — Аутеншлюс А.И.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.