Хронический гастрит - заболевание, не имеющее выраженных клинических проявлений, существующее десятилетиями, завершается атрофией слизистой оболочки. Независимо от этиологии хронический атрофический гастрит является стартовой площадкой рака желудка кишечного типа, риск развития которого нарастает по мере прогрессирования атрофических изменений. При атрофическом пангастрите риск рака желудка в 5-6 раз превышает аналогичный показатель в популяции [1]. Именно поэтому детекции атрофии слизистой оболочки в современных классификациях придают решающее значение, обозначая ее как стадию заболевания [2]. Проблема однозначной интерпретации гистологической картины гастробиоптатов была во многом решена введением понятия «метапластическая атрофия» - изменение фенотипа желудочного эпителия на кишечный, при котором железы, целиком или частично построенные из эпителия кишечного типа, утрачивают (снижают) свою функцию и, следовательно, подвергаются атрофии [3]. Понятие «метапластическая атрофия» не заменяет, а дополняет понятие абсолютной атрофии, обусловленной уменьшением объема и числа желез. Классификация хронического атрофического гастрита, основанная на идентификации только метапластической атрофии, получила согласие экспертов при ее использовании по критерию близкому к 1,0 [4].

Однако проблемы детекции атрофии в гастробиоптатах и предикации рака желудка по-прежнему сохраняются. Дело в том, что современные классификации хронического гастрита: модифицированная Сиднейская система, OLGA-system (и ее Российский пересмотр), OLGIM требуют для оценки атрофии на уровне органа выполнения четкого алгоритма взятия биоптатов из 5 точек [2, 3, 5], что нарушается при выполнении подавляющего числа фиброгастроскопий. Исследования, проведенные в России и США, показали, что требованиям современных классификаций в отношении соблюдения алгоритма забора материала, ориентировки фрагментов слизистой оболочки желудка при гистологической обработке отвечают не более 4% биопсийных исследований [6, 7]. Решение проблемы представляется возможным при помощи иммуногистохимической идентификации хорошо изученных ключевых молекул, отражающих изменения биологии эпителия слизистой оболочки желудка, при кишечной метаплазии [3, 8].

Экспрессия гена CDX-2, определяющего кишечную дифференцировку эпителия, возникает в ответ на повышение pH желудочного содержимого, вторым мощным индуцирующим фактором являются цитокины, вырабатываемые клетками воспалительного инфильтрата [9, 10]. Продукция белка CDX-2 определяется даже в мукоцитах с неизмененным фенотипом [11], т.е. это достаточно диффузный процесс в противовес очагам фенотипически определяемой кишечной метаплазии. Наконец, идентификация маркера всегда предпочтительна именно в связи с простой альтернативой - есть/нет.

Цель исследования - оценить параметры валидности признаков метапластической атрофии слизистой оболочки желудка для разработки маркерного принципа детекции атрофического гастрита.

В рамках пилотного исследования отобрано 200 диагностических случаев с морфологическим заключением «хронический гастрит». Из исследования исключены случаи неопределенной атрофии, очаговой фовеолярной гиперплазии, полипов, интраэпителиальной дисплазии/неоплазии, аденомы, инвазивной карциномы, эрозивно-язвенных дефектов. Единственным условием для возможности проведения оценки уровня атрофии слизистой оболочки желудка являлось наличие достаточного количества исследуемого материала при эндоскопическом заборе (не менее 4-5 фрагментов). Оценка атрофии слизистой оболочки желудка проведена тремя экспертами по достаточно искусственно заданному условию отбора: выбраковывали любой гистологический препарат, по поводу которого хотя бы у одного эксперта было сомнение о наличии атрофии. Из оставшихся образцов (гистологический препарат - парафиновый блок) методом рандомизации были выбраны 50 блоков. Из этих блоков приготовили серийные срезы, в которых и была проведена детекция маркерных признаков.

Аналогичным методом были отобраны 50 образцов слизистой оболочки желудка, в которых отсутствовала атрофия слизистой оболочки.

В качестве маркеров метапластической атрофии были выбраны гистологические и иммуногистохимические признаки/маркеры, отражающие дефицит желез (гиперплазия гладкомышечных клеток, аргирофильных и эластических волокон), а также изменение клеточного фенотипа (метаплазия кишечная и пилорическая): CDX-2 - белок мукоцита, вставшего на путь кишечной дифференцировки, белок Shh - условный признак желудочной дифференцировки эпителия, белки (виллин, мембраноассоциированная пептидаза - CD10), ассоциированные со щеточной каемкой, а также кислый муцин кишечного типа MUC2 и нейтральный муцин поверхностных отделов желудка MUC5AC, выполняющий протективную функцию.

Для определения профиля муцинов и типирования очагов кишечной метаплазии в клетках слизистой оболочки желудка использовали реакции с 1% алциановым синим при pH 2,5 (кислые сиаломуцины), ШИК-реакцию на основе стандартной методики с основным фуксином, а также комбинацию методов: алциановый синий (pH 2,5) + ШИК. Детекцию сульфомуцинов с помощью диамина железа дополняли окраской алциановым синим при pH 2,5 [12].

Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах. Демаскировку антигена проводили в цитратном буфере (pH 6,0) при кипячении на водяной бане.

В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к перечисленным белкам производства «Novocastra», Великобритания; «Cell Mark», США; «Spring», США; «DAKO», Дания. Биотинилированные антитела второго слоя и стрептавидин, меченный пероксидазой, входили в систему визуализации KP-500 («Diagnostic Biosystems», США). В качестве хромогена использовали 3,3-диаминобензидина тетрахлорид. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера.

Оценку иммуногистохимически определяемого биомолекулярного маркера проводили по принципу его отсутствия или наличия в исследуемом материале. Для белка желудочной дифференцировки Shh (sonic hedgehog) рассчитывали показатель интенсивности окрашивания цитоплазмы: 1 - слабая, 2 - умеренная, 3 - выраженная, а также вычисляли процент позитивно окрашенных клеток от общего числа эпителиоцитов (≥1000 клеток) с подразделением на 5 градаций (0 - до 5%, 1 - 26-50%, 3 - 51-75%, 4 - 75% и более) позитивно меченых клеток. Оценку индекса экспрессии Shh вычисляли путем умножения показателя интенсивности окрашивания (1-3) на полуколичественно оцененную градацию (0-4) [13].

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе Axioskop 40 с использованием камеры AxioVision Rel. 4.7.2 («Carl Zeiss», Германия).

Определение валидности признаков метапластической атрофии слизистой оболочки желудка проводили в соответствии с рекомендациями A.M. Marchevsky, M.R. Wick [14] путем расчета чувствительности и специфичности иммуногистохимических маркеров метапластической атрофии, а также связанных с ними показателей: прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов, отношение правдоподобия для положительного и отрицательного результатов.

Чувствительность - доля (%) гистологических препаратов, в которых иммуногистохимически обнаружен искомый маркер среди всех гистологических препаратов выборки с атрофией. Специфичность - доля (%) гистологических препаратов, в которых не обнаружен иммуногистохимически маркер метапластической атрофии среди всех гистологических препаратов выборки без атрофии слизистой оболочки желудка. Прогностическая ценность положительного результата - доля гистологических препаратов с наличием атрофии слизистой оболочки желудка среди всех гистологических препаратов с положительным результатом определения маркера метапластической атрофии. Прогностическая ценность отрицательного результата - доля гистологических препаратов с отсутствием атрофии слизистой оболочки желудка среди всех гистологических препаратов с отрицательным результатом определения маркера метапластической атрофии. Отношение правдоподобия для положительного результата указывает на значимость маркера метапластической атрофии слизистой оболочки желудка для повышения уверенности относительно выявления атрофии: чувствительность/(1 - специфичность). Отношение правдоподобия для отрицательного результата указывает на значимость маркера метапластической атрофии для повышения уверенности относительно отсутствия атрофии: (1 - чувствительность)/специфичность. Для каждой характеристики признака (чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов) рассчитывали доверительный интервал. Расчет параметров валидности методов детекции метапластической атрофии выполнен с использованием программы MedCalc 10.4.0.0.

Абсолютные атрофические изменения в биоптатах слизистой оболочки желудка характеризовались наличием зон ее истончения с уменьшением объемной плотности желез в сочетании с разрастанием соединительнотканных волокон в собственной пластинке слизистой оболочки, в частности, аргирофильных ретикулярных волокон (рис. 1, а).

Продукция муцинов MUC5AC и MUC2 в участках кишечной метаплазии имела следующие характеристики: в очагах полной кишечной метаплазии MUC2 обнаружен во всех бокаловидных клетках (рис. 1, б и лишь в единичных регистрировалась экспрессия MUC5AC, зато этот желудочный муцин достаточно регулярно (в 100% случаев) встречался в цилиндрических муцинпродуцирующих клетках, расположенных между бокаловидными. Продукция муцина MUC5AC в желудочном эпителии слизистой оболочки желудка вне зон метаплазии обнаружена преимущественно в клетках покровно-ямочного эпителия (рис. 1, в)

Продукция CDX-2 при всех типах кишечной метаплазии была выявлена во всех цилиндрических и бокаловидных клетках. Ядерная метка CDX-2 встречалась и вне связи с очагами кишечной метаплазии в эпителии, имеющем желудочный фенотип, располагающемся, как правило, на уровне ямочно-шеечного отдела желез (рис. 1, г), а также в препаратах, где не было очагов кишечной метаплазии. Интересно, что при изготовлении дополнительных срезов с таких блоков почти всегда удавалось обнаружить сформировавшийся кишечный фенотип, что вполне понятно: продукция кишечного фактора транскрипции CDX-2 предшествует реализации фенотипических изменений. Более того, существуют представления о том, что устранение локальной продукции цитокинов (например, проведение эрадикации H. pylori) приводит к репрессии гена CDX-2, исчезновению продукции CDX-2, но не очагов кишечной метаплазии [11].

Shh выявлялся в виде цитоплазматической метки различной интенсивности (в широком диапазоне градации от 3 до 8) в покровно-ямочном эпителии слизистой оболочки антрального отдела и тела желудка (рис. 1, д). При неполной кишечной метаплазии выявляли повышенную экспрессию Shh бокаловидными и муцинпродуцирующими клетками по сравнению с желудочным эпителием.

Цилиндрические клетки со щеточной каемкой, хорошо выявляемой также при проведении иммуногистохимических реакций с использованием моноклональных антител к виллину и CD10, встречались исключительно при полной кишечной метаплазии (рис. 1, е).

При расчете параметров валидности перечисленных биомаркеров метапластической атрофии в слизистой оболочке желудка получены результаты, нуждающиеся в некоторых комментариях (таблица)

В выборе высоковалидных маркеров метапластической атрофии предпочтение было отдано параметру чувствительности, как более важному с точки зрения организации скрининговых исследований для формирования контингента пациентов с хроническим атрофическим гастритом, у которых существует риск развития рака желудка кишечного типа.

Высокие показатели чувствительности и специфичности белка CDX-2 являются ожидаемыми. Действительно, не было выявлено ни одного наблюдения метапластической атрофии слизистой оболочки желудка, где бы этот маркер отсутствовал, что подтверждено и данными литературы [9]. Вместе с тем феномен выработки CDX-2-клетками, имеющими желудочный фенотип, неоднократно описан в литературе [10, 11], а также отмечен и в нашем исследовании. Интересно, что после выполнения серийных срезов с блоков, в которых была представлена продукция CDX-2 желудочным эпителием, в 2 случаях гистологически и гистохимически было выявлено наличие участков кишечной метаплазии. Вполне понятно, что экспрессия CDX-2 предшествует формированию кишечного фенотипа. Детекция данного белка в гастробиоптатах может являться методом прогноза появления кишечной метаплазии, то есть метапластической атрофии. Это следует, вероятно, использовать при нарушенной ориентировке кусочка для детекции метапластической атрофии, что позволит оценить стадию хронического гастрита в препаратах, которые по требованиям современных классификаций атрофического гастрита OLGA-system и OLGIM считаются неинформативными.

Существуют и другие механизмы инициации экспрессии гена CDX-2. Так, длительное действие соляной кислоты на кератиноциты слизистой оболочки пищевода вызывает появление экспрессии CDX-2, и это оценивают как один из механизмов морфогенеза пищевода Барретта [9]. Есть убедительные данные о том, что в двенадцатиперстной кишке снижение pH вызывает потерю экспрессии CDX-2 энтероцитами и появление желудочной метаплазии [10]. CDX-2 так же как и его аналог CDX-1 регулируется in vitro фактором некроза опухоли-α (TNF-α) через фактор транскрипции NF-kB [10]. Отсюда понятно, что гены CDX-1 и CDX-2 регулируют экспрессию друг друга. Работа этих генов приводит к появлению собственных промоторов, поддерживающих длительную экспрессию и фактически «закрепляющих» кишечный клеточный фенотип. Остается неясным, насколько устойчив этот новый клеточный фенотип (кишечная метаплазия), насколько он независим от природы первоначального триггера. Понимание этого механизма могло бы способствовать ответу на вопрос об обратимости кишечной метаплазии и, следовательно, метапластической атрофии слизистой оболочки желудка.

Оценка валидности белка Shh не соответствует категории диагностического маркера ни по одному из заранее заданных уровней (см. таблицу), поскольку Shh не является однозначно трактуемым маркером только желудочной дифференцировки. Интенсивная и распространенная экспрессия Shh (специфичность 86% для полуколичественной градации 8 и более) в нашем исследовании была, в основном, ассоциирована с выраженной атрофией желез: абсолютной и метапластической (неполная метаплазия - типы II и III) атрофией.

Такой уровень экспрессии, вероятно, отражает появление клеточной линии интенсивно регенерирующего эпителия с высоким индексом пролиферации [3]. Отмечено, что определение гена SHH и белка Shh в качестве факторов, обеспечивающих именно желудочную дифференцировку, является понятием, справедливым лишь для эмбриогенеза. Повышенная экспрессия SHH может быть ассоциирована с развитием предраковых изменений в виде эпителиальной дисплазии/неоплазии слизистой оболочки желудка, так как она значительно увеличена в опухолевых клетках при раке желудка кишечного типа [13], т.е. является отражением нового продукта транскрипции и не более.

Виллин и молекула CD10 обладают высокими показателями чувствительности и специфичности (см. таблицу), однако как маркеры они пригодны только лишь для определения полной кишечной метаплазии. Если же оценивать чувствительность признака изолированно для детекции кишечной метаплазии только типа I, то она составляет 100%. При таком типе метаплазии изменение желудочного дифферона включает все типы кишечных клеток, в том числе каемчатые, а виллин и CD10 - маркеры именно микроворсинок. Совпадение параметров валидности виллина и CD10 позволило нам для дальнейших рассуждений использовать один маркер - CD10. С позиций практического использования трактовка признака может быть расширена - в участках распространенной неполной кишечной метаплазии часто обнаруживаются отдельные железы и группы желез, сохраняющие фенотип полной тонкокишечной метаплазии, т.е. каемчатые клетки. Таким образом, маркер даже одного типа кишечной метаплазии может быть универсальным маркером метапластической атрофии.

MUC2 представляет собой экскрет бокаловидных клеток, характерный для любого типа кишечной метаплазии, что позволяет отнести его к маркерам метапластической атрофии с высоким уровнем текущей критериальной валидности (см. таблицу).

Крайне низкая специфичность маркера MUC5AC не позволяет считать его валидным маркером атрофии. Хотя, возможно, столь низкие показатели (см. таблицу) обусловлены принятой нами бинарной схемой оценки признака (есть/нет). В нескольких работах удалось показать ассоциацию изменения уровня экспрессии этого муцина, оцененного полуколичественно, с разными факторами [3, 4, 7].

Хотя в авторитетных руководствах по биопсийной диагностике в гастроэнтерологии замещение желез гладкомышечными клетками и/или волокнистыми структурами соединительной ткани, особенно аргирофильными ретикулярными волокнами, принято считать надежным признаком атрофии слизистой оболочки, при оценке валидности обнаружены сравнительно низкие значения этого критерия (см. таблицу). Это можно объяснить прежде всего сложностью разработки и практической оценки собственно самих критериев гиперплазии тех или иных волокон, невозможностью качественного диагностического процесса, основанного на бинарном разделении признака (есть гиперплазия волокон = есть атрофия/нет гиперплазии волокон = нет атрофии). В данной ситуации полезным может оказаться внедрение специально разработанных морфометрических методов оценки гиперплазии гладкомышечных клеток и/или соединительнотканных волокон после адекватно и всегда стандартно проведенного элективного окрашивания гистологического среза. И такие подходы применительно к оценке объемной плотности волокон в совершенно различном тканевом материале существуют. Однако подобная постановка задачи противоречит позициям выбранного нами маркерного принципа диагностики, предусматривающего прежде всего практическое использование однозначно интерпретируемых результатов при низком уровне зависимости от особенностей забора биопсийного материала и пробоподготовки.

Таким образом, маркеры, отражающие иммуногистохимически определяемую муцинпродуцирующую способность клеток, показали свою валидность в отношении метапластической атрофии.

Вариантом технического решения проблемы является применение маркерного принципа детекции метапластической атрофии слизистой оболочки желудка. Иммуногистохимическая детекция трех выделенных высоковалидных биомолекул, отражающих наличие метапластической атрофии, может позволить использовать для диагностики атрофического гастрита материал, полученный не из точек, определенных международными протоколами эндоскопического исследования желудка, при малых объемах ткани, при неправильно залитом фрагменте - на тангенциальных срезах.

Последовательность действий при интерпретации результата иммуногистохимического исследования гастробиоптата можно свести к следующему алгоритму (рис. 2)

При положительном результате (неважно, продукция CDX-2 в зоне кишечной метаплазии или в эпителии желудочного фенотипа) целесообразно определение CD10 и MUC2. Сочетание экспрессии CDX-2 и CD10 характерно для метапластической атрофии типа I, что может отражать атрофический антрум-гастрит или мультифокальный гастрит. Обнаружение в сочетании с продукцией CDX-2 MUC2, вероятнее всего, означает наличие неполной кишечной метаплазии/метапластической атрофии, характерной для атрофического мультифокального гастрита или атрофического пангастрита.

При наличии только белка CDX-2 целесообразно делать дополнительные срезы, в которых с большой вероятностью можно обнаружить кишечный фенотип, следовательно, кишечную метаплазию.

Наиболее валидными биомолекулярными маркерами (высокая чувствительность и специфичность) метапластической атрофии слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите являются кишечный фактор транскрипции - белок CDX-2, мембраносвязанный муцин щеточной каемки CD10 и муцин кишечного типа MUC2. Алгоритм последовательной иммуногистохимической идентификации перечисленных маркеров позволяет вероятностно оценить атрофию слизистой оболочки желудка (форму хронического гастрита) даже в гистологических препаратах, приготовленных из биоптатов малоинформативных для стандартной детекции атрофического гастрита, основанной на интерпретации гистоархитектоники слизистой оболочки. Предлагаемое техническое решение верификации атрофического гастрита с помощью метода биомаркеров не является альтернативным, но дополняющим гистологическое исследование, выполненное по репрезентативному объему и числу гастробиоптатов и остающееся золотым стандартом диагностики хронического атрофического гастрита.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.В.К.

Сбор и обработка материала: А.Г.Ш., А.Н.Н.

Статистическая обработка данных: А.Г.Ш., С.И.М.

Написание текста: Р.К.Г., А.Н.Н.

Редактирование: А.В.К., С.И.М.