Определение возможности таргетной терапии рака желудка

Рак желудка (РЖ) занимает четвертое место в мире по частоте встречаемости среди онкологических заболеваний и второе место по причинам смертельных исходов, связанных с онкологическими заболеваниями. В мире ежегодно регистрируется более миллиона случаев заболевания РЖ [14]. Увеличивается и частота выявления аденокарциномы зоны кардии и пищеводно-желудочного перехода, которая характеризуется более неблагоприятным прогнозом. Рост заболеваемости в этой группе за последние два десятилетия XX века превышает рост частоты других онкозаболеваний более чем в 3 раза [17].

РЖ гистологически чаще всего представлен аденокарциномой. Плоскоклеточная и аденоплоскоклеточная формы встречаются крайне редко. Классификация ВОЗ различает аденокарциномы (папиллярная, тубулярная, муцинозная, высоко-, умеренно-, низкодифференцированные), перстневидно-клеточный рак, железисто-плоскоклеточный рак, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак и недифференцированный рак [1]. Кроме того, применяется классификация Lauren, в которой все злокачественные опухоли желудка подразделяются на два типа: кишечный и диффузный [11]. Морфологический тип опухоли имеет различные клиническое течение и прогностическое значение. Диффузная форма РЖ — это менее дифференцированный рак, как правило, с инфильтрацией подслизистого слоя, более ранним лимфогенным метастазированием и худшим прогнозом, чем у рака кишечной формы. Эпидемиологический скрининг выявил различную частоту встречаемости по локализации опухоли — тело желудка и область пищеводно-желудочного перехода — в разных странах мира. Также отличаются их молекулярно-биологические и клинические характеристики. По данным некоторых авторов [3], диффузный РЖ наиболее распространен в Европе и России.

Основным методом лечения злокачественных опухолей желудка в настоящее время является хирургическое вмешательство, однако у большинства пациентов выявляют местно-распространенную опухоль и/или отдаленные метастазы, что требует применения дополнительных методов лечения. Значительная частота распространенных форм РЖ обусловливает необходимость поиска новых химиопрепаратов, которые были бы эффективны при этом заболевании. В настоящее время наиболее часто в химиотерапии используются схемы, включающие доцетаксел, цисплатин и 5-фторурацил. Однако использование этих препаратов не приводит к существенному увеличению общей выживаемости пациентов с распространенным РЖ и пищеводно-желудочного перехода. Результаты применения высокоэффективного препарата трастузумаб (герцептин) у больных раком молочной железы (РМЖ) вызвали всплеск исследований, посвященных изучению его воздействия на пациентов с другими видами HER2-позитивного рака, в том числе и РЖ [2]. Достоверно установлено, что у больных HER2-позитивным РМЖ (первичным или метастатическим) после лечения герцептином (представляющим собой моноклональное рекомбинантное гуманизированное анти-HER2-антитело) увеличивается выживаемость [16]. Кроме того, повышенная экспрессия HER2, как правило, ассоциируется с неблагоприятным прогнозом и устойчивостью к химиотерапевтическому лечению [12]. Для исследования эффективности применения таргетного препарата трастузумаб в 2005—2008 гг. было проведено многоцентровое рандомизированное исследование (TOGA) по применению трастузумаба в комбинации с капецитабином и 5-фторурацилом при местно-распространенном РЖ и пищеводно-желудочного перехода [3]. В исследовании участвовали 122 клинических центра из 24 стран Европы, Азии, Центральной и Южной Америки. В анализ были включены 594 пациента с HER2-позитивным статусом по результатам иммуногистохимического (ИГХ) и FISH-исследования. Пациенты были рандомизированы на равные группы, в одной из которых применялась схема химиотерапии, включающая трастузумаб, а в другой — только химиотерапия. Морфологическое исследование и определение чувствительности к препарату путем выявления наличия гиперэкспрессии белка HER-2/neu или амплификации гена HER2 проводились в централизованных лабораториях. HER2-статус анализировался с использованием иммуногистохимического метода (HercepTest, «Dako») и флюоресцентной in situ гибридизации (HER2 FISH pharmDx, «Dako»). Исследование TOGA показало, что в группе пациентов с HER2-статусом ИГХ 3+ или ИГХ 2+/FISH+, получавших химиотерапию в комбинации с трастузумабом, средняя общая выживаемость составила 16,0 мес по сравнению с 11,8 мес для пациентов, получавших только химиотерапию [2, 3]. TOGA продемонстрировало достоверное увеличение продолжительности жизни пациентов с HER2-положительным статусом и принципиальное значение адекватной оценки гиперэкспрессии/амплификации HER2 для проведения адекватного таргетного лечения распространенного РЖ и пищеводно-желудочного перехода.

Анализ результатов ряда исследований показал, что гиперэкспрессия HER-2/neu коррелирует с кишечным гистологическим типом роста опухоли по классификации Lauren, локализацией опухоли в области пищеводно-желудочного перехода, степенью дифференцировки, чувствительностью к трастузумабу и хорошим прогнозом [20].

Протоонкоген HER-2/neu, действие которого блокируется при применении трастузумаба, располагается в локусе 21 на длинном плече 17 хромосомы (CHR17) и кодирует одну из самых изученных тирозинкиназ. Этот белок имеет размер 185 кДа, относится к семейству рецепторов эпидермальных факторов роста (EGFR) и участвует в переносе сигналов, инициирующих пролиферацию клеток [15].

Для максимальной эффективности таргетного лечения герцептином необходимо точное исследование HER2-статуса больных. Для его оценки разработано несколько методов: ИГХ, который выявляет наличие гиперэкспрессии белка на мембранах клеток; FISH — флюоресцентная гибридизация in situ, которая применяется для выявления амплификации гена HER2 с использованием ДНК-зондов, меченных флюорохромами; и CISH — хромогенная гибридизация in situ, альтернативный нефлюоресцентный метод, при котором выявление гибридизированных ДНК-зондов происходит с помощью иммунопероксидазной реакции. Еще одна разновидность CISH — полностью автоматизированный метод SISH (BDISH), разработанный Ventana («Ventana Medical Systems», Inc), при котором для выявления гена HER2 используется серебряная метка, а для идентификации центромерного участка CHR17 — красный краситель Fast Red.

При проведении ИГХ-исследования рекомендуется использовать коммерческий стандартный набор HercepTest («Dako») или антитела Pathway anti-HER2, клон 4B5 («Ventana»). По сравнению с карциномой молочной железы РЖ отличается значительно большей гетерогенностью опухоли, которая проявляется не только в гистологическом строении, но и в молекулярно-биологических характеристиках. Гетерогенные опухоли желудка составляют около 30% всех случаев. С учетом этих морфологических особенностей РЖ были разработаны новые специальные критерии оценки экспрессии HER2, отличные от критериев, применяющихся для РМЖ, что нашло отражение в рекомендациях, разработанных M. Hoffman и соавт. [9] (рис. 1).

Рисунок 1. Критерии оценки HER2-статуса рака желудка и пищеводно-желудочного перехода по M. Hoffman.

Необходимо отметить, что эти критерии не только различаются для РЖ и РМЖ, но при РЖ они различны для операционного или биопсийного материала. В отличие от оценки экспрессии в РМЖ, для РЖ применяется критерий в 10% положительно окрашенных клеток опухоли. Кроме того, положительным называется не полное выраженное окрашивание клеточной мембраны, как в РМЖ, а базолатеральное или латеральное окрашивание мембран опухолевых клеток. Большая гетерогенность РЖ приводит также к тому, что при наличии в образце операционного материала участка, составляющего менее 10% ярко положительно окрашенных клеток, необходимо для адекватного ответа протестировать еще 1—2 образца из другой части опухоли. Эта биологическая особенность опухолей желудка также вызывает необходимость взятия при биопсии не одного фрагмента ткани, а нескольких — не менее 6—8. Только такой объем материала может дать возможность адекватного HER2-тестирования. Важно отметить, что для биопсийного материала в группу случаев, оцениваемых как 3+, относят только те образцы, в которых положительно окрашенные опухолевые клетки образуют кластеры и не менее чем из 5 клеток. Помимо изменения критериев оценки HER2-статуса также были внесены изменения и в алгоритм HER2-тестирования: если для РМЖ равнозначно начинать тестирование как методом ИГХ, так и методом гибридизации in situ, то тестирование РЖ следует обязательно начинать с ИГХ оценки уровня экспрессии белка, и только для случаев, оцененных как 2+, используется FISH-анализ (рис. 2).

Рисунок 2. Алгоритм HER2-тестирования при раке желудка.

Это положение основано на результатах ряда исследований, которые показали, что при РЖ в опухолях с отсутствием экспрессии белка (ИГХ 0/1+) амплификация гена выявлялась с одинаковой частотой по сравнению с образцами с ИГХ2+ (23 и 26% соответственно) [20]. В исследовании TOGA было достоверно продемонстрировано, что пациенты с такой биологической характеристикой опухоли не дают положительного ответа на лечение герцептином [9]. В образцах с ИГХ-статусом 2+ необходимо определение наличия амплификации гена HER2 методом гибридизации in situ в различных вариантах. Для оценки FISH для РЖ принято, что амплификация считается установленной, если соотношение HER2/CHR17 больше 2,0, в отличие от РМЖ, где пограничным положительным значением является соотношение, равное 2,2.

Целью нашей работы было сравнение нескольких методов HER2-тестирования (ИГХ, FISH и SISH) аденокарцином желудка и пищеводно-желудочного перехода.

В работе использовали операционный материал, полученный в отделении патологической анатомии МНИОИ им. П.А. Герцена от 40 больных с аденокарциномой желудка (недифференцированная аденокарцинома — 15, умереннодифференцированная аденокарцинома — 15, высокодифференцированная аденокарцинома — 10) и от 7 больных с аденокарциномой пищеводно-желудочного перехода (умереннодифференцированная аденокарцинома — 3 и высокодифференцированная аденокарцинома — 4). Материал фиксировали 10% нейтральным формалином в течение 24 ч, затем заливали в парафиновые блоки по стандартной методике. Для ИГХ, FISH и SISH-исследований готовили срезы толщиной 4 мкм.

ИГХ-анализ проводили с использованием наборов HercepTest («Dako», Glostrup, Дания) и Pathway anti-HER2, клон 4B5 («Ventana», США) с использованием автоматизированных иммуностейнеров, FISH — с использованием набора HER2 FISH PharmDx Kit («Dako», Glostrup, Дания). SISH выполняли на приборе Benchmark XT («Ventana Medical Systems», Tucson, AZ, США) набором INFORM HER2 DNA («Ventana») с двойной меткой — зондами для HER2 и СHR17 на одном стекле. При применении набора INFORM HER2 DNA («Ventana») использовали следующую модификацию метода: предобработка пепсином — 8 мин для зонда к HER2 и 12 мин — для зонда к центромере CHR17. Следующие этапы гибридизации выполняли соответственно протоколу производителя. После окончания программы стекла доставали из аппарата, несколько раз промывали в 1% растворе Triton X-100, дистиллированной воде, затем высушивали в термостате при 65 °С в течение 15—20 мин и помещали в заключающую среду Biomaunt. Результаты оценивали с использованием светового микроскопа Leica DMRB с объективами ×5—×40. FISH-исследование проводили с использованием гибридайзера по стандартному протоколу к набору HER2 FISH PharmDx Kit. Визуализацию флюоресцентных препаратов проводили со 100× масляно-иммерсионным объективом.

Оценку окрашивания мембран опухолевых клеток на ИГХ-препаратах проводили согласно рекомендациям M. Hoffman и др. [9] для операционного материала: 0 (отрицательный статус) — мембраны не окрашены или окрашено менее 10% клеток; 1+ (отрицательный статус) — слабое, нечеткое окрашивание >10% клеток или мембраны клеток окрашены только фрагментарно, не по всему периметру; 2+ (неопределенный статус) — базолатеральное или полное окрашивание мембран слабое или умеренное в >10% опухолевых клеток; и 3+ (положительный статус) — умеренное или сильное окрашивание мембран, полное или базолатеральное >10% опухолевых клеток (см. рис. 1).

FISH- и SISH-препараты оценивали согласно инструкциям к наборам, подсчитывая метку в 20/40 ядрах опухолевых клеток в двух участках опухоли с ×400 и ×1000, после чего вычисляли соотношение HER2/CHR17. При соотношении HER2/CHR17 <2, считали, что амплификация гена HER2 отсутствует, а при соотношении HER2/CHR17 >2 соответственно наличие амплификации считали установленным.

ИГХ-исследование

После проведения ИГХ-исследования с использованием наборов HercepTest («Dako», Glostrup, Дания) и Pathway anti-HER2, клон 4B5 («Ventana», США), оценку иммуногистохимического окрашивания мембран опухолевых клеток проводили согласно рекомендациям M. Hoffman [9]. В группе низкодифференцированных аденокарцином желудка в подавляющем большинстве образцов отсутствовала гиперэкспрессия HER2: 14 случаев — 0 баллов и только 1 — 3+. В группе умереннодифференцированных аденокарцином также большинство случаев имели отрицательный статус (8 — 0, 2 — 1+), 2 — 2+, 3 — 3+, однако увеличилось число образцов, имеющих гиперэкспрессию 3+ (3) и образцов, требующих проведения дополнительного исследования методом гибридизации in situ 2+ (2). Среди высокодифференцированных аденокарцином было обнаружено следующее распределение: 1 — 0, 4 — 2+ и 5 — 3+ случая. В группе аденокарцином пищеводно-желудочного перехода 4 случая имели статус 2+ и 3 — 0 (рис. 3, а, б, рис. 4, а, б).

Рисунок 3. Рак желудка кишечного типа. а — окраска гематоксилином и эозином. ×200; б — ИГХ-реакция с антителами к HER2 (HercepTest, «Dako»). Реакция — 3+. Гетеро генность окрашивания в различных участках опухоли. ×400.

Рисунок 4. Рак желудка диффузного типа. а — окраска гематоксилином и эозином. × 200; б — иммуногистохимическая реакция с антителами к HER2 (HercepTest, «Dako»). Реакция — 3+. ×400.

Результаты ИГХ-анализа изученных образцов приведены в табл. 1.

Необходимо отметить, что результаты исследования с использованием наборов двух производителей дали сходные результаты, хотя при использовании антител 4В5 («Ventana») в двух случаях было отмечено окрашивание мембран не только клеток аденокарциномы, но и метаплазированных неопухолевых желез.

SISH- и FISH-исследование

В данном исследовании FISH и SISH выполняли на всех образцах параллельно с ИГХ-анализом. Оценку препаратов после выполнения гибридизации in situ проводили следующим образом: на небольшом увеличении (×20 — для SISH, ×40, ×63 — для FISH) выявляли участки аденокарциномы, подлежащие оценке, — участки среза с хорошей сохранностью ткани, наличием клеток внутреннего контроля и наличием меток как гена HER2, так и CHR17: красных (центромера CHR17) и черных (ген HER2, SISH) или зеленых и красных (центромера CHR17, ген HER2, FISH соответственно). Сигналы оценивали в 20 или 40 клетках и затем вычисляли соотношение HER2/CHR17. Амплификацию гена HER2 считали установленной в случае, если соотношение HER2/CHR17 было больше 2; если же соотношение HER2/CHR17 было <2, то считали, что амплификация отсутствует. При соотношении HER2/CHR17, равном 2, подсчитывали дополнительное количество меток еще в 20 клетках. По результатам SISH 3 образца не подлежали оценке вследствие артефициального окрашивания, вызванного, скорее всего, неадекватной фиксацией материала, поступившего из других клиник.

Результаты FISH- и SISH-исследований в сравнении с результатами ИГХ-анализа представлены в табл. 2.

Во всех случаях с HER2-негативным статусом (0 и 1+) результаты FISH- и SISH-анализов были отрицательными. В наблюдениях, где была обнаружена гиперэкспрессия HER-2/neu (3+), только в 7 случаях по результатам FISH и в 6 — по результатам SISH была выявлена амплификация соответствующего гена. Еще большее расхождение в результатах FISH- и SISH-исследований наблюдалось в случаях, оцененных 2+ по ИГХ. FISH-амплификация была найдена в 20% случаев, а SISH-амплификация — только в 10% (рис. 5, а, б).

Рисунок 5. Рак желудка кишечного типа. Гибридизация *in situ*. Амплификация гена HER2. а — метод FISH. ×1000; б — метод SISH. ×1000.

Итак, по всем группам больше всего оказалось образцов с отсутствием повышенной экспрессии HER2: 26 (55%) — 0 баллов и 2 (4%) — 1+, причем наибольшее число — 14 из 15 образцов (0 баллов) оказалось в группе низкодифференцированных аденокарцином (диффузный тип РЖ по Lauren) и в группе аденокарцином пищеводно-желудочного перехода (3 из 7 образцов). Таким образом, наши данные сходны с данными других исследователей, указывающих на крайне низкую степень гиперэкспрессии белка и амплификации гена HER2 в РЖ такого типа [7, 8, 19]. Кроме того, ни в одном из образцов, оцененных нами как 0 или 1+ по ИГХ, мы не обнаружили амплификации гена HER2 ни одним из методов гибридизации, что соответствует результатам одних авторов [13, 18], а с другой стороны, не согласуется с данными других [4, 10], выявивших амплификацию в 1+ препаратах в 14 и 4% образцов соответственно. Возможно, нами не были выявлены случаи с наличием амплификации при отсутствии гиперэкспрессии белка из-за небольшого числа таких наблюдений в нашем исследовании.

Образцов с гиперэкспрессией HER2 3+ во всех группах было выявлено 9 (19%), причем большинство из них (5) — в группе высокодифференцированных, 3 — в группе умереннодифференцированных и 1 — в группе низкодифференцированных аденокарцином желудка. ИГХ оценку 2+ получили 10 образцов (21%): умереннодифференцированные (2 образца, 4%) и высокодифференцированные аденокарциномы желудка (4 образца, 9%), а также 4 образца аденокарцином пищеводно-желудочного перехода (9%). Все опухоли с вышеописанным HER2-статусом относятся к раку кишечного типа по Lauren. По данным разных групп исследователей, РЖ этого типа может быть HER2-положительными в 16—34% случаев [12]. M. Kim и соавт. [10] показали наличие гиперэкспрессии HER-2/neu в аденокарциномах желудка (2+ и 3+) на уровне 22,6%, что хорошо согласуется с нашими результатами. В группе с неопределенным HER2-статусом (2+) амплификация гена найдена в 8 (17%) случаях методом FISH и в 6 случаях (13%) методом SISH.

Нами подтверждена прямая корреляция между амплификацией гена и гиперэкспрессией белка HER-2/neu. Из 9 HER2-положительных по гиперэкспрессии образцов амплификация методом FISH была найдена в 7 (67%) случаях, а методом SISH — в 6 (56%), что согласуется с результатами одних исследователей [13], обнаруживших амплификацию гена только в 45% случаев 3+ карцином желудка, и противоречит данным других [4, 18], выявивших 100% амплификацию в 3+ препаратах.

Таким образом, мы обнаружили расхождение между результатами FISH- и SISH-анализов, что совпадает с результатами ряда авторов [6], хотя другие источники указывают на высокое сходство результатов этих двух методов [5]. Скорее всего, такое расхождение результатов, полученных разными авторами, обусловлено сложностью и новизной метода SISH, а также числом изученных наблюдений. В нашем исследовании чувствительность FISH (100%) оказалась выше, чем у SISH (92%). Следует особо отметить высокую чувствительность зависимости SISH-анализа от качества материала: в 3 образцах из 47 (6%) мы не смогли интерпретировать результаты вследствие артефициального окрашивания, обусловленного неправильной фиксацией материала.

Сравнительный анализ различных методов HER2-тестирования показал, что использование иммуногистохимических наборов HercepTest («Dako», Дания) и Pathway anti-HER2, клон 4B5 («Ventana»), дает полное совпадение результатов, но использование антител 4В5 требует учета возможности положительного окрашивания не только клеток аденокарциномы, но и метаплазированного эпителия. FISH с использованием набора HER2 FISH PharmDx Kit является «золотым стандартом» в исследованиях амплификации гена HER2. Однако SISH имеет очень важное достоинство — это полностью автоматизированный метод, позволяющий оценивать результаты изучения амплификации генов на светооптическом уровне, что существенно облегчает возможность правильного выбора участка ткани для заключения. В то же время этот метод предъявляет самые высокие требования к первичной обработке материала, т.е. неукоснительному соблюдению требований к качеству фиксатора и времени фиксации, что необходимо учитывать при применении этого метода в HER2-тестировании как РЖ, так и РМЖ.