Биомаркеры острого церебрального повреждения в комплексной диагностике сепсис-ассоциированной энцефалопатии

Сепсис является одной из основных причин смерти пациентов, находящихся в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) в критическом состоянии. Ежегодно в мире заболевают сепсисом около 49 млн человек, что приводит к 11 млн случаев летальных исходов — 20% всех случаев летальных исходов в мире [1]. Сепсис-ассоциированная энцефалопатия (САЭ) представляет собой острую дисфункцию головного мозга, которая возникает при отсутствии первичного очага инфекции в центральной нервной системе (ЦНС) [2]. Поскольку патофизиологические механизмы развития САЭ достаточно изучены, назрела необходимость разработки персонализированных клинических подходов в лечении острого церебрального повреждения при сепсисе. В связи с этим весьма актуальна ранняя диагностика острой церебральной дисфункции на основе клинических, лабораторных и инструментальных методов исследования, из которых на первый план выходит поиск значимого биомаркера с целью установления диагноза САЭ и прогнозирования исходов церебрального повреждения.

Биомаркеры — объективные показатели, используемые для оценки физиологического или патологического состояния, а также для суждения о возникновении, развитии и прогнозе заболеваний. Они способны отражать характерные изменения, которые можно измерить именно при взаимодействии организма с окружающей средой [3]. Можно идентифицировать, прогнозировать или разрабатывать новые стратегии лечения САЭ, используя биомаркер или панель биомаркеров. Многие исследователи пытались выявить специфичный маркер острого церебрального повреждения при САЭ, но результаты различались [4]. Между тем при отсутствии высокоточных диагностических инструментов врачи — анестезиологи-реаниматологи полагаются на свои собственные клинические навыки и опыт для диагностики САЭ. Комбинация нескольких биомаркеров может обеспечить более объективный и надежный способ диагностики и прогноза САЭ.

Цель исследования — выявить диагностическую и прогностическую значимость трех церебральных биомаркеров: астроглиального белка S100B, нейронспецифической енолазы (NSE), антител к NR2-субъединице NMDA-рецептора глутамата (NR2AT) у пациентов с сепсисом, а также провести оценку их изменений и сопоставить с клиническими проявлениями САЭ.

В рамках выполнения государственного задания «Изучение механизмов развития и разработка подходов к терапии сепсис-ассоциированной энцефалопатии на основе омиксных технологий» №122041900090-4 в ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России проведено одноцентровое проспективное контролируемое клиническое исследование в период с апреля 2022 г. по декабрь 2023 г. Включены 33 пациента (основная группа) с подтвержденным диагнозом сепсиса согласно международному консенсусу определения сепсиса и септического шока Sepsis-3 (The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock, 2016) и 33 добровольца (контрольная группа), сопоставимых по возрасту, полу и сопутствующим заболеваниям с пациентами основной группы.

Критерии невключения в исследование: инфекционный процесс в ЦНС, хроническая интоксикация (алкоголь, наркотики) в анамнезе, вирусный гепатит B, C, ВИЧ-инфекция, текущая беременность.

Критерии исключения: развитие острого нарушения мозгового кровообращения и очаговой инфекции в ЦНС в процессе лечения пациента, включенного в исследование.

Блок-схема исследования и отбора включенных пациентов основной и контрольной групп представлена на рис. 1.

Рис. 1. Блок-схема исследования. Отбор пациентов для основной и контрольной групп.

Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России (выписка №0204-22 из протокола заседания №04-22 от 18.04.2022). Все пациенты дали письменное информированное добровольное согласие до начала участия в исследовании.

Первичным очагом инфекционного процесса были: внутрибольничная пневмония — 42%, вторичный перитонит — 34%, инфекция мягких тканей — 12%, инфекционный эндокардит — 4%, инфекция мочевыводящих путей — 8% (табл. 1). Для всех включенных в проводимое исследование пациентов регистрировали продолжительность пребывания в ОРИТ и количество койко-дней пребывания в стационаре. Учитывали госпитальную летальность.

Контрольная группа набрана с помощью программы МИС qMS. Поиск осуществлен по полу, возрасту, сопутствующим заболеваниям, что являлось критериями включения в эту группу. Для сравнительного анализа данных характеристика контрольная группа сопоставлена с базовыми характеристиками основной группы, чтобы показать независимость влияния данных анамнеза на лабораторные показатели.

Таблица 1. Характеристика пациентов основной и контрольной групп

Примечание. Данные представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей (Me [Q₁; Q₃]), а также в виде абсолютных и относительных частот; * — различия показателей статистически значимы (p<0,05). ИМТ — индекс массы тела; ГБ — гипертоническая болезнь; ИБС — ишемическая болезнь сердца.

Диагностика САЭ включала неврологическое обследование с оценкой по шкале оценки спутанности сознания CAM-ICU (Confusion Assessment Method-Intensive Care Unit), шкале возбуждения-седации Ричмонда RASS (Richmond Agitation-Sedation Scale), шкале комы FOUR (Full Outline of UnResponsiveness), шкале динамической оценки органной недостаточности SOFA (Sequential Organ Failure Assessment), шкале оценки физиологических расстройств SAPS II (New Simplified Acute Physiology Score).

Пациенты основной группы разделены на 2 подгруппы в зависимости от клинических проявлений и неврологической симптоматики. В подгруппу A включены пациенты с делирием (тест CAM-ICU положительный), подгруппа B представлена пациентами без делирия с оглушением, сопором или комой (тест CAM-ICU отрицательный, по шкале RASS — 1 балл и менее). При ведении пациентов основной группы с САЭ применяли лечебную тактику седации: у больных с гиперактивным делирием, смешанной формой делирия использовали галоперидол+дексмедетомидин; у пациентов с угнетением сознания до комы, с вегетативной нестабильностью — многокомпонентную нейровегетативную стабилизацию (опиоидный анальгетик + клофелин/дексмедетомидин + пропофол/тиопентал натрия/бензодиазепины). В каждом конкретном случае проводили тщательную клиническую оценку состояния пациента с сепсисом/септическим шоком и принимали соответствующее тяжести состояния пациента решение о выборе структуры нейровегетативной блокады.

При установлении диагноза сепсиса выполняли забор крови в 1-е, на 7-е, 14-е, 21-е, 28-е сутки. В эти же дни оценивали показатели C-реактивного белка (СРБ) и лактата крови. Для измерения уровней S100B, NSE и NR2AT осуществляли забор периферической венозной крови в пробирку с активатором свертывания. После центрифугирования пробирок сыворотку аликвотировали и хранили при температуре –80°C.

Измерение содержания белка S100B (суммарное определение двух изоформ S100A1B и S100BB) проводили с использованием тест-системы CanAg S100B (Fujirebio Diagnostics, Швеция). Диапазон измерения составлял от 10 до 3500 нг/л без перекрестной реактивности с другими изоформами S100. Референсные значения S100B по данным производителя — до 90 нг/л. Измерение NSE проводили с использованием тест-системы CanAg NSE (Fujirebio Diagnostics, Швеция). Диапазон измерения от 1 до 150 мкг/л, референсные значения по данным производителя — до 10,5 мкг/л. Измерение NR2AT проводили с использованием тест-системы NR2AT-ИФА (Diagnostic Reagents Devices, Россия). Диапазон измерения от 0,7 до 12 нг/мл, референсные значения по данным производителя составляли менее 2 нг/мл.

Расчет объема выборки проведен с использованием программы G*Power v. 3.1.9.2¹ на основании следующих условий.

1. Уровень значимости статистических заключений составляет 95% (вероятность ошибки первого рода — 5%).

2. Показатель мощности составляет 80% (вероятность ошибки второго рода — 20%).

3. В качестве статистического метода оценки различий использовали непараметрический критерий Манна—Уитни для несвязанных выборок. За основной показатель исследования принято различие в концентрации маркера повреждения головного мозга астроглиального белка S100B.

4. Данные о медианах концентрации астроглиального белка S100B взяты из результатов исследований K. Erikson и соавт.², в котором астроглиальный белок S100B использован как маркер повреждения головного мозга при септическом шоке. Продемонстрировано повышение концентрации астроглиального белка S100B. Статистически значимые различия получены в группах сравнения, включавших по 22 пациента.

5. С учетом изложенного объем групп определен более 22 пациентов, общий объем выборки — 44 пациента.

Статистические расчеты проводили в программе RStudio (v. 2022.07.1 Build 554 2009-2022 (RStudio, Inc., США) на языке R (v. 4.1.3 (2022-03-10, Австрия). Дескриптивные статистики непрерывных показателей дообследования — медиана [первый квартиль; третий квартиль] — Me [Q₁; Q₃]; для бинарных показателей — частота случаев [95% доверительный интервал частоты по формуле Вилсона] (% [95% ДИ]), для категориального показателя определяли число пациентов (частота) для каждой категории. С применением критерия Шапиро—Уилка не выявлены нормально распределенные показатели, поэтому для сравнения непрерывных показателей использовали непараметрический U-критерий Манна—Уитни. Бинарные и категориальные данные сравнивали с применением точного двустороннего критерия Фишера. Коррекция ошибки множественного тестирования при сравнении категорий проведена методом Бенджамини—Хохберга. Выявление пороговых значений проводили методами ROC-анализа с оптимальными значениями чувствительности и специфичности. Корреляцию проводили с помощью рангового метода Спирмена с вычислением коэффициента корреляции rho. Проверку статистических гипотез проводили при критическом уровне значимости p=0,05, то есть различие считалось статистически значимым при p<0,05.

В нашем исследовании госпитальная летальность была высокой и составила 64%, что, очевидно, напрямую связано с тяжестью состояния пациентов (все пациенты, включенные в исследование, находились в состоянии септического шока). Продолжительность пребывания в ОРИТ составила 18 [10,5; 45,0] сут. Продолжительность пребывания в стационаре составила 44 [24,5; 64,5] сут. Среднее количество баллов по шкале SOFA в 1-е сутки диагностики сепсиса составило 8,5 [6,75—10,0] балла, по шкале SAPS II — 40,5 [35,75; 44,5] балла. Все результаты, полученные при анализе проб сывороток добровольцев (контрольной группы), находились в референсных пределах.

У выживших после сепсиса пациентов уровни S100B были ниже, чем у умерших пациентов (106,55 [20,9; 144,9] нг/л по сравнению с 142,13 [41,275; 165,570] нг/л, p<0,001). У выживших пациентов уровни NSE были ниже, чем у умерших (4,90 [2,695; 7,050] мкг/л по сравнению с 12,56 [4,115; 8,760] мкг/л, p<0,001). Уровни NR2AT существенно не различались у выживших и умерших пациентов (1,27 [0,870; 1,620] нг/мл по сравнению с 1,17 [0,817; 1,790] нг/мл, p=0,105).

Мы выявили, что в зависимости от клинических вариантов подгруппа B включала 25 пациентов (75% от общего числа пациентов основной группы) без делирия с оглушением, сопором или комой (CAM-ICU отрицательный, RASS — 1 балл и менее); подгруппа A — 8 пациентов (25% от общего количества пациентов с сепсисом) с делирием. Статистически значимая разница в уровнях S100В или NSE между подгруппами пациентов A и B не выявлена (99,70 [46,2; 149,0] нг/л по сравнению с 58,70 [38,1; 134,0] нг/л, p=0,338; 3,78 [2,40; 8,47] мкг/л по сравнению с 3,4 [2,67; 4,96] мкг/л, p=0,780), несмотря на различные клинические проявления острой церебральной дисфункции. Клинические проявления САЭ зависят от вовлечения структур головного мозга в патологический процесс. Например, при повреждении гиппокампа, коры лобных долей у пациентов развивается делирий; при вовлечении в патологический процесс ствола головного мозга и коры больших полушарий развивается угнетение сознания по типу оглушения, сопора или комы. В связи с нашими данными можно сделать вывод, что уровни церебральных биомаркеров повышаются одинаково вне зависимости от нейроанатомического повреждения.

Сообщается, что S100B представляет собой кальций-связывающий белок, преимущественно синтезируемый и секретируемый астроцитами, олигодендроцитами ЦНС и шванновскими клетками периферической нервной системы [5]. В норме он преимущественно присутствует в цитоплазме и регулирует фосфорилирование белков, пролиферацию и апоптоз клеток, энергетический обмен и воспалительную реакцию через сигнальный путь кальция; в патологическом состоянии он выделяется в клетку преимущественно в аутокринной и паракринной форме. Белок S100B вовлечен в патогенез болезней Альцгеймера и Паркинсона, рассеянного склероза, шизофрении и эпилепсии, поскольку высокая экспрессия этого белка посредством активации рецепторов RAGE и TLR-4 инициирует внутриклеточные сигнальные пути и факторы транскрипции, что приводит к повышенной экспрессии провоспалительных цитокинов и молекул клеточной адгезии, способствуя нейровоспалению [6]. Глиальный белок S100В обнаруживается в цитоплазме астроцитов, шванновских клеток, адипоцитов, хондроцитов, меланоцитов. Учитывая, что этот белок широко представлен в клетках разного типа, его предположительно считают маркером генерализованного повреждения гематоэнцефалического барьера, а не изолированного повреждения глии [7]. В метаанализе, включающем 28 исследований, показано, что уровни S100B в сыворотке крови у пациентов с САЭ были значительно выше, чем у лиц контрольной группы, а уровни S100B в сыворотке крови у пациентов с САЭ с благоприятным исходом были значительно ниже, чем у пациентов с неблагоприятным исходом [8]. В исследовании С.Ю. Белышева и соавт. доказано, что концентрация белка S100B является высокочувствительным маркером структурного повреждения головного мозга при септической энцефалопатии [9]. S.A. Cohen и соавт. обнаружили, что S100B можно применять для определения прогноза стойкой когнитивной дисфункции и выживаемости у пациентов с сепсисом [10]. A.J. Calsavara и соавт. предположили, что уровень S100B в сыворотке крови может быть связан с симптомами тревоги, депрессии и посттравматического стрессового расстройства у людей, переживших сепсис [11]. Однако диагностическая и прогностическая роль S100B при САЭ все еще остается спорной, а различные исследования привели к большим пробелам и даже противоположным выводам [12]. M. Vučeljić и соавт. показали, что белок S100B не является хорошим ранним предиктором тяжелых исходов сепсиса [13]. J. Ehler и соавт. продемонстрировали, что уровни S100B в спинномозговой жидкости существенно не различались у пациентов с сепсисом и лиц контрольной группы [14]. C. Jorge-Ripper и соавт. обнаружили повышенный уровень S100B в сыворотке крови у пациентов с делирием, а также у пациентов с сепсисом без делирия, и это увеличение не связано со смертностью [15]. Значительные различия могут быть обнаружены в связи с разными диагностическими критериями САЭ, что может повлиять на точность собранных данных. Белок S100B описан как СРБ головного мозга из-за его потенциальной роли в качестве инструмента неврологического скрининга или биомаркера повреждения ЦНС аналогично роли СРБ как маркера системного воспаления [16].

В нашем исследовании уровни S100В и NSE в крови у пациентов с сепсисом были значительно выше, чем у лиц контрольной группы, что положительно коррелировало с тяжестью заболевания по шкалам полиорганной недостаточности SOFA и SAPSII, показателями СРБ и лактата. Выявлена умеренная положительная корреляция между балльной оценкой по шкале SOFA и уровнями S100B и NSE (rho=0,427; p=0,037/rho=0,599; p=0,018). Уровни S100B и NSE положительно коррелировали с балльной оценкой по шкале SAPS II (rho=0,474; p=0,022, rho=0,630; p=0,016). Корреляция между балльной оценкой по шкалам SOFA и SAPS II и уровнем NR2AT также отмечалась, но была ниже. Уровень S100B коррелировал с уровнем лактата (rho=0,515; p=0,01), а уровень NSE коррелировал с уровнем СРБ (rho=0,736; p=0,002) и уровнем лактата (rho=0,644; p=0,033) (табл. 2).

Таблица 2. Корреляция между балльной оценкой по шкалам полиорганной недостаточности и уровнями S100B, NSE, NR2AT, значениями C-реактивного белка и лактата

Примечание. СРБ — C-реактивный белок.

Корреляция между уровнями S100B, NSE и NR2AT и оценкой по шкалам FOUR и RASS не выявлена (табл. 3).

Таблица 3. Корреляция между балльной оценкой по шкалам неврологических нарушений FOUR, RASS и уровнями S100B, NSE, NR2AT

С целью определения значимости предикторов в прогнозировании риска развития летального исхода и их критических уровней проведен ROC-анализ, построены ROC-кривые с установлением пороговых значений. Концентрация S100В более 126,4 нг/л в 1-е сутки развития сепсиса служила предиктором госпитальной летальности со специфичностью 80% и чувствительностью 70%, площадь под кривой (AUC) составляла 0,720 (95% ДИ 0,559—0,806). Уровни NR2AT, превышающие 1,91 нг/мл, предсказывали госпитальную летальность со специфичностью 100% и чувствительностью 25%, AUC — 0,514 (95% ДИ 0,302—0,669). Концентрация NSE более 4,85 мкг/л была предиктором госпитальной летальности со специфичностью 100% и чувствительностью 50%, AUC — 0,760 (95% ДИ 0,599—0,811). Построены ROC-кривые, оценивающие способность биомаркеров S100В, NR2AT и NSE прогнозировать госпитальную летальность при САЭ (рис. 2).

Рис. 2. ROC-кривые, оценивающие способность биомаркеров S100В, NR2AT и NSE прогнозировать неблагоприятный исход у пациентов с сепсис-ассоциированной энцефалопатией.

Диагностическую ценность в отношении развития САЭ показала концентрация NSE, определенная в 1-е сутки развития сепсиса: уровень NSE ≥1,86 мкг/л указывал на развитие САЭ со специфичностью 78% и чувствительностью 90%. Площадь под ROC-кривой, соответствующей взаимосвязи диагностики заболевания и уровней NSE, составила 0,934±0,03 (95% ДИ 0,871— 0,996) (рис. 3). Полученная модель статистически значима (p<0,001).

Рис. 3. ROC-кривая, характеризующая значимость уровня NSE для диагностики сепсис-ассоциированной энцефалопатии.

Два других биомаркера (астроглиальный белок S100В и NR2AT) показали низкую эффективность для диагностики САЭ. Уровень S100В >101,4 нг/л (AUC=0,563) обладал чувствительностью 38,1% и специфичностью 100%; уровень NR2AT >1,91 нг/мл — специфичностью 77,27% и чувствительностью 19,05%, AUC составляла 0,316 (95% ДИ 0,161—0,467). На рис. 4 показаны ROC-кривые, оценивающие способность маркеров S100В и NR2AT диагностировать САЭ.

Известно, что нейронспецифическая енолаза представляет собой клеточно-специфичный изофермент гликолитического фермента енолазы [17]. В метаанализе, включающем 16 исследований, продемонстрировано, что у пациентов с черепно-мозговой травмой неблагоприятный исход был статистически значимо связан с более высокими концентрациями NSE [18]. В недавнем исследовании L.T. Zhang и соавт. установлено, что высокий уровень NSE является независимым предиктором смерти в ОРИТ у пациентов с септическим шоком [19], что продемонстрировано и в нашем исследовании. Однако мы также обнаружили, что его уровень коррелирует с уровнем СРБ и лактата.

NMDA-рецепторы представляют собой ионотропные гетеротетрамерные трансмембранные ионные каналы, которые состоят из четырех из семи возможных субъединиц (NR1, NR2A-D, NR3A и B) [20]. Показано, что NR2-подтипы NMDA-рецепторов локализованы как в структурах головного мозга (преимущественно в коре), так и в эндотелии церебральных артерий, эпителии сплетений и эпендиме желудочков. Пептид NR2 представляет собой N-концевой фрагмент глутаматного NMDA-рецептора, который образуется вследствие расщепления протеазами, активируемыми ишемией [21]. Попадая в кровоток через поврежденный ишемией гематоэнцефалический барьер, NR2-субъединицы инициируют выработку антител. Ранее установлено, что повышенный уровень антител NR2ab в сыворотке крови является молекулярным биомаркером церебральной ишемии у пациентов с очаговыми неврологическими симптомами, хроническим инфарктом головного и спинного мозга и предиктором субклинического поражения головного мозга у больных с артериальной гипертензией и другими сосудистыми факторами риска [22]. Настоящее исследование определило значение NR2AT при течении САЭ и показало их низкую специфичность и чувствительность для диагностики и прогноза летальности при САЭ. Следует отметить, что наше исследование имело ограниченный размер выборки — только 33 клинических наблюдения пациентов с сепсисом. Безусловно, наши результаты должны быть подтверждены более масштабным рандомизированным клиническим исследованием с сопоставимым многомерным подходом.

Рис. 4. ROC-кривые, характеризующие значимость уровней S100B и NR2AT для диагностики сепсис-ассоциированной энцефалопатии.

Сегодня лечение септической энцефалопатии основано на этиопатогенетической терапии сепсиса, однако ведутся экспериментальные исследования, целью которых является поиск патогенетически обоснованной терапии острой церебральной дисфункции с целью предупреждения структурного повреждения головного мозга. Терапия, направленная на снижение уровня S100B, может быть многообещающей фармакологической целью для упреждения развития САЭ, что может помочь в выборе лучшего комбинированного или основного метода лечения. Обнадеживающие результаты демонстрируют экспериментальные работы. Так, арундиновая кислота способна ингибировать увеличение повреждений головного мозга, предотвращая воспалительные изменения, вызванные повышенным производством белка S100B в астроцитах [23]. Более того, в экспериментальной модели сепсиса, вызванного перевязкой и перфорацией слепой кишки, продемонстрировано, что моноклональное антитело (Anti-S100B), введенное интравентрикулярно в головной мозг подопытного животного в дозе 10 мкг на 1 кг массы тела, может восстановить привычную память и улучшить когнитивные функции [24]. Противопротозойный препарат пентамидин может блокировать сигнальный путь S100B/RAGE/NF-κB и уменьшать нейровоспаление в гиппокампе мышей с сепсисом [25], а ингибитор митохондриального деления Mdivi-1 может ингибировать высвобождение S100B в плазму [26]. В настоящее время исследования, связанные с антагонистом S100B, в основном проводятся на животных моделях, и все еще необходимы дополнительные клинические испытания, чтобы доказать его терапевтическую ценность для пациентов с САЭ.

1. У пациентов с сепсис-ассоциированной энцефалопатией определяются повышенные значения S100В и NSE, которые положительно коррелируют с тяжестью состояния больных с сепсисом и острой церебральной дисфункцией на ранних этапах заболевания.

2. Уровень NSE >1,86 мкг/л может быть использован для диагностики сепсис-ассоциированной энцефалопатии (специфичность 78%, чувствительность 90%). Церебральные биомаркеры астроглиальный белок S100B и антитела к NR2-субъединице NMDA-рецептора глутамата не имеют диагностической значимости в отношении развития сепсис-ассоциированной энцефалопатии.

3. Наиболее значимыми предикторами неблагоприятного прогноза у пациентов с сепсис-ассоциированной энцефалопатией являются концентрации в сыворотке крови астроглиального белка S100В >126,4 нг/л (AUC=0,720; специфичность 80%, чувствительность 70%) и концентрации в сыворотке крови нейронспецифической енолазы (NSE) >4,85 мкг/л (AUC=0,760; специфичность 100%, чувствительность 50%).

4. Антитела к NR2-субъединице NMDA-рецептора глутамата не связаны с тяжестью течения сепсис-ассоциированной энцефалопатии и не являются диагностическим маркером и предиктором госпитальной летальности.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Саввина И.А., Мазурок В.А., Шляхто Е.В.

Сбор и обработка материала — Яблонских Д.Д., Родченко А.М., Рутковский Р.В., Кашерининов И.Ю.

Статистический анализ данных — Матакаева Ж.А., Быкова К.М.

Написание текста — Быкова К.М., Дрягина Н.В., Саввина И.А.

Редактирование — Саввина И.А., Дрягина Н.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹ Faul F, Erdfelder E, Lang AG, Buchner A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 2007;39(2):175-191. https://doi.org/10.3758/bf03193146

²Erikson K, Ala-Kokko TI, Koskenkari J, Liisanantti JH, Kamakura R, Herzig KH, Syrjälä H. Elevated serum S-100β in patients with septic shock is associated with delirium. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 2019;63(1):69-73. https://doi.org/10.1111/aas.13228