Введение

Основным клиническим проявлением нового варианта вирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2, является пневмония с массивным поражением легочной паренхимы, диффузным альвеолярным повреждением, нарушением вентиляционно-перфузионных отношений и альвеолярного газообмена. Острое воспаление легких как основного органа внедрения и распространения вируса примерно у 15% пациентов приводит к развитию тяжелой двусторонней пневмонии, сопряженной с угрозой жизни. В 5% тяжелых случаев развиваются системное гиперергическое воспаление, дыхательная недостаточность, осложненная острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС) с быстро прогрессирующей гипоксемией, что приводит к высокой летальности [1—3].

Нами выполнен анализ публикаций, посвященных изучению клеточно-молекулярных механизмов течения и прогрессирования COVID-19, в частности, роли гипоксии и индуцированного гипоксией фактора 1α (HIF-1α). Систематический поиск проведен в электронных базах данных PubMed, Medline, Web of Science за период 2019—2022 гг.

Большинство исследователей разделяют мнение, что разнообразие клинических проявлений, наблюдаемое при COVID-19, обусловлено не столько различной вирусной нагрузкой, сколько особенностями иммунного ответа организма [4, 5]. Общие подходы к лечению COVID-19, которые использовались в период пандемии, включают противоинфекционную, противовоспалительную и антицитокиновую терапию, однако эффективных специфических препаратов для лечения SARS-CoV-2-инфекции на сегодняшний день не существует [6]. Несмотря на усилия исследователей всего мира, знания о клеточных и молекулярных механизмах течения и прогрессирования COVID-19 остаются во многом оторванными от реальных возможностей терапии, что обусловливает отсутствие эффективных средств лечения COVID-19. В то же время персонифицированный подход к терапии больных с тяжелой внебольничной пневмонией (в частности, являющейся осложнением COVID-19), предполагает определение наиболее информативных маркеров тяжести течения и прогноза заболевания, коррелирующих с основными патогенетическими звеньями патологического процесса и выделение наиболее эффективных схем и алгоритмов интенсивной терапии.

Основными патофизиологическими особенностями COVID-19 являются гипоксия, которая сопутствует всем стадиям заболевания, начиная с продромального периода, и «цитокиновый шторм» [5, 7, 8]. Тяжелое течение COVID-19 сопровождается низким уровнем оксигенации артериальной крови (гипоксемией), который часто непропорционален объему повреждения легких [9]. Доступность кислорода, гипоксическое микроокружение клеток определяют патогенез вирусных инфекций и влияют на врожденный и адаптивный иммунный ответ на инфекцию [10]. Гипоксия является прямым следствием повреждения легких, наблюдаемого при COVID-19. В очагах индуцированного повреждением воспаления тканевое микроокружение приобретает гипоксический характер («воспалительная гипоксия») из-за высокой метаболической потребности в кислороде мигрирующих иммунокомпетентных клеток (нейтрофилов, моноцитов) [11—13]. У многих инфицированных SARS-CoV-2 пациентов, не ощущающих респираторного дискомфорта, тем не менее отмечается гипоксемия, названная «тихой», «апатичной» или даже «счастливой» [3, 14]. Причины такого парадоксального явления активно обсуждаются научным сообществом. Среди возможных механизмов возникающей гипоксемии рассматриваются различные варианты: снижение чувствительности клеток к дефициту кислорода из-за инвазии SARS-CoV-2 в периферические и центральные дыхательные хеморецепторы [15]; нарушение соотношения вентиляция/перфузия вследствие повреждения эндотелия, обструкции микроциркуляторного русла легких, повышения проницаемости эндотелиально-альвеолярного барьера [16]; нарушение синтеза сурфактанта из-за утраты инфицированных SARS-CoV-2 альвеолоцитов 2-го типа [17]; опосредованное влияние SARS-CoV-2 на эритроциты и дисфункция молекул гемоглобина [18].

Основным регулятором клеточного ответа на дефицит кислорода общепризнанно считается HIF-1α, который стимулирует транскрипцию многочисленных генов, кодирующих белки, нацеленные на адаптацию к сниженной доступности кислорода, включая гликолитические ферменты, транспортеры глюкозы, эритропоэтин и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) [19]. В работах отечественных ученых HIF-1α рассматривается как фактор, транскрипционная активность которого связана с экспрессией гипоксия-зависимых генов, многих провоспалительных факторов и генов, вовлеченных в ремоделирование дыхательных путей, ангиогенез и энергетический метаболизм [20—24]. В настоящее время интерес к HIF-1α у больных с тяжелой пневмонией, в том числе вирусной этиологии, связан с тем, что его активация подавляет врожденные иммунные механизмы защиты, присущие клеткам бронхоальвеолярного эпителия, усиливает апоптоз альвеолоцитов 2-го типа, препятствуя заживлению эпителия после повреждения, изменяет профиль генной экспрессии альвеолоцитов 2-го типа и угнетает экспрессию сурфактантных протеинов. При нормоксии кислородзависимые пролилгидроксилазы в присутствии α-кетоглутарата, кофакторов Fe²⁺ и витамина C гидроксилируют HIF-1α и направляют на опосредованное убиквитин-E3-лигазой фон Гиппеля—Линдау убиквитинирование с последующей протеасомной деградацией. В условиях недостатка кислорода пролилгидроксилазы неактивны, гидроксилирование остатков пролина в молекуле HIF-1α не происходит, что позволяет ему избежать деградации и накапливаться в ядре в виде димера с HIF-1β. Действие HIF-1α как фактора транскрипции не ограничивается только ядром. HIF-1α может участвовать в межклеточном взаимодействии по паракринному механизму посредством внеклеточных микровезикул, стимулируя провоспалительные эффекты соседних клеток [25]. Согласно недавним исследованиям, в процессе адаптации клеток к недостатку кислорода может происходить переключение каскада реакций, опосредованных двумя основными изоформами HIF: острая гипоксия стимулирует высвобождение HIF-1α, в то время как хроническая гипоксия стимулирует высвобождение HIF-2α [26].

Роль HIF-1α в заражении клеток SARS-CoV-2

Коронавирус SARS-CoV-2 проникает в клетки организма-хозяина путем специфического связывания поверхностного спайкового S-белка с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2-го типа (АПФ2), экспрессируемого в легких в больших количествах альвеолоцитами 2-го типа, эндотелиоцитами, гладкомышечными клетками, лимфоцитами, моноцитами и макрофагами [27—30]. Рецептор-опосредованное проникновение вируса зависит от наличия мембраносвязанной сериновой протеазы 2-го типа (TMPRSS2), обеспечивающей активацию вирусного S-белка и слияние вирусной и клеточной мембран [30, 31]. Проникая в клетки, вирус SARS-CoV-2 нарушает слой гликокаликса, защищающий клеточные мембраны, что обусловливает их разрушение с высвобождением патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (РНК вируса) и молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMP), которыми являются аденозинтрифосфат (АТФ), аденозиндифосфат (АДФ), нуклеиновые кислоты и др. [32, 33]. Активность АПФ2 может модулироваться посредством уровней экспрессии РНК или белка, а также отщепления от клеточной мембраны, которое опосредуется ферментом из семейства металлопротеиназ ADAM (ADAM17).

Доказано, что HIF-1α может транскрипционно влиять на все белки, контролирующие проникновение SARS-CoV-2 в клетки — АПФ2, TMPRSS2 и ADAM17 [34]. На модели гипоксической легочной гипертензии показано, что HIF-1α подавляет экспрессию АПФ2 через микроРНК let-7b (ось HIF-1α-let-7b-АПФ2), которая нацелена на кодирующую последовательность АПФ2 [34]. HIF-1α транскрипционно усиливает экспрессию фермента ADAM17, который отщепляет АПФ2 от поверхности альвеолоцитов, закрывая «входные ворота» для проникновения SARS-CoV-2 в клетку [35]. Есть сведения, что HIF-1α подавляет сериновую протеазу TMPRSS2, необходимую для праймирования спайк-белка коронавируса [8]. Можно предполагать, что активация HIF-1α-сигнального пути гипоксией или химическим активатором (например, дихлоридом кобальта CoCl₂) приведет к снижению экспрессии АПФ2 и TMPRSS2 и увеличению экспрессии ADAM17 на поверхности альвеолоцитов и, следовательно, к снижению инвазивности SARS-CoV-2 (см. рисунок). С другой стороны, HIF-1α-зависимое увеличение транскрипции и экспрессии фермента ADAM17, участвующего в процессинге и высвобождении во внеклеточный матрикс и кровоток растворимых провоспалительных TNFα (S. Lisi и соавт.) [36] и рецептора IL-6 [37], может послужить фактором усиления «цитокинового шторма».

Участие индуцированного гипоксией фактора 1α (HIF-1α) в регуляции экспрессии ангиотензинпревращающего фермента 2-го типа (AПФ2), мембраносвязанной сериновой протеазы 2-го типа (TMPRSS2) и фермента из семейства металлопротеиназ 17 (ADAM17) — ключевых молекул проникновения SARS-Cov-2 в клетки [8].

Появляются доказательства того, что напряжение кислорода может влиять на восприимчивость к вирусу [38]. У людей, инфицированных SARS-CoV-2, которые проживали в высокогорных районах и акклиматизировались к гипоксической среде, заболеваемость и вероятность тяжелых исходов COVID-19 была ниже, что могло быть обусловлено индуцированным гипоксией и HIF-1α-зависимым снижением экспрессии АПФ2 [39, 40]. Идентифицированы 332 взаимодействия между 26 (из 29) белками SARS-CoV-2 и белками человека, в том числе входящими в состав HIF-1α-сигнального пути, управляющего экспрессией HIF-1α (белки NF-κB-сигналинга и убиквитинлигазного комплекса) [41]. Возможно, взаимодействие SARS-CoV-2 и сигнального пути HIF-1α лежит в основе медленной элиминации РНК SARS-CoV-2 клетками иммунной системы, длительного течения болезни в отличие от других вирусных пневмоний и восприимчивости организма к повторному заражению SARS-CoV-2 [42, 43]. На поздней стадии COVID-19 присоединение вторичной бактериальной инфекции может привести к стабилизации HIF-1α в макрофагах посредством активации toll-подобного рецептора 4 (TLR4) и снижения мРНК пролилгидроксилазы [8].

В исследовании на нескольких клеточных линиях эпителиоцитов легких и легочной ткани мышей показано, что активация HIF-1α под влиянием гипоксических условий или под действием фармакологического ингибитора пролилгидроксилазы роксадустата подавляет экспрессию АПФ2, ухудшает проникновение коронавируса внутрь клетки и репрессирует репликацию вирусных частиц, о чем свидетельствовало снижение внутри- и внеклеточной вирусной РНК на всех этапах жизненного цикла вируса [9]. С другой стороны, в экспериментах A.C. Codo и соавт. обработка моноцитов ингибитором пролилгидроксилазы того же класса молидустатом повышала уровни РНК SARS-CoV-2 зависимым от HIF-1α образом [44]. В исследовании, основанном на секвенировании РНК и анализе клинических образцов пациентов с COVID-19, M. Tian и соавт. выявили экспрессию HIF-1α и провоспалительных цитокинов, причем у пожилых пациентов наблюдались чрезмерные воспалительные реакции и высокая летальность. Авторы предположили, что при заражении SARS-CoV-2 вирусный белок ORF3a индуцирует повреждение митохондрий и выработку активных форм кислорода в митохондриях (Mito-АКФ) для активации и стабилизации HIF-1α, что, в свою очередь, усиливает вирусную инфекцию и усугубляет воспалительные реакции. На клеточных линиях показано, что индукция HIF-1α способствует экспрессии воспалительных цитокинов, тогда как ингибирование HIF-1α подавляет их выработку [45].

HIF-1α — регулятор иммунных реакций

Доказано, что гипоксия и HIF играют важную роль в формировании иммунного ответа на вирусную инфекцию, влияя на метаболизм, функцию, дифференцировку и выживание иммунных клеток [46]. Тяжелое течение COVID-19, в отличие от легких случаев, характеризуется особым иммунотипом: преобладанием провоспалительного подтипа макрофагов, критическим снижением соотношения регуляторных T-клеток (Treg) и T-хелперов 17-го типа (Th17) (Treg/Th17), дисфункцией дендритных клеток, «цитокиновым штормом» [47, 48]. В легких пациентов с тяжелым течением COVID-19 преобладают воспалительные макрофаги фенотипа M1, для которых характерны повышенные уровни экспрессии HIF-1α и провоспалительных цитокинов, продукция активных форм кислорода и азота, что ведет к неконтролируемому деструктивному воспалению легочной ткани [4]. HIF-1α связывается с транскрипционным фактором FOXP3 из семейства FOX-белков и способствует его деградации, что приводит к ингибированию дифференцировки регуляторных T-клеток, продуцирующих противовоспалительные цитокины (IL-4, IL-10 и TGF-β). В то же время обнаружено, что при гипоксии под действием HIF-1α усиливается дифференцировка Th17-клеток, вырабатывающих провоспалительный IL-17 [49]. Активация Th17-клеток играет роль в рекрутировании нейтрофилов при COVID-19-ассоциированном «цитокиновом шторме» [50]. При воспалительной гипоксии HIF-1α выступает в качестве ключевого транскрипционного фактора, регулирующего адаптацию дендритных клеток, которые являются мощными индукторами воспалительной реакции [4].

В тяжелых случаях COVID-19 активация HIF-1α может привести к молниеносному развитию «цитокинового шторма» в результате активации иммунных клеток, включая макрофаги, нейтрофилы, дендритные и тучные клетки, индуцируя выработку этими клетками большого количества провоспалительных цитокинов, вызывая высвобождение активных форм кислорода, протеаз и образование нейтрофильных внеклеточных ловушек [51]. Профиль цитокинов у тяжелых пациентов с COVID-19, которые нуждались в интенсивной терапии, отличался более высокими уровнями IL-1β, IL-6, TNFα, IL-2, IL-7, IL-10, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), индуцируемого гамма-интерфероном белка 10 (IP10), моноцитарного хемотаксического белка 1-го типа (MCP-1) по сравнению с пациентами с более легким течением заболевания [52]. Инфицированные SARS-CoV-2 эпителиальные клетки легких продуцируют IFN-α/β под контролем HIF-1α-сигналинга. Активация рецепторов IFN-α/β мононуклеарных макрофагов вызывает выработку хемоаттрактантов, рекрутируя следующий пул макрофагов, продуцирующих ключевые медиаторы «цитокинового шторма» TNFα, IL-6 и IL-1β. Повреждение тканей привлекает нейтрофилы, которые накапливаются в микроциркуляторном русле легких, альвеолах и интерстиции. Все больше доказательств того, что при участии HIF-1α происходит формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек, состоящих из ДНК, гистонов, биологически активных белков, активных форм кислорода и играющих решающую роль в патогенезе внутрисосудистого тромбоза и полиорганной недостаточности при COVID-19 [53]. Нарушение апоптоза и элиминации нейтрофилов при гипоксии происходит опосредованно через HIF-1α—Nf-κB-сигналинг и при участии макрофагального воспалительного белка 1а (MIP1a) [54]. Таким образом, обосновано предположение, что активация HIF-1α включена не только в генез «цитокинового шторма», но и в нарушение апоптоза нейтрофилов при SARS-CoV-2-ОРДС. Отличительной особенностью COVID-19 является то, что инфицированные вирусом макрофаги и дендритные клетки замедленно (отсроченно) продуцируют повышенные уровни провоспалительных цитокинов и хемокинов, что может быть одной из причин длительного течения заболевания [51].

Роль HIF-1α в регуляции экспрессии цитокинов противоречива и зависит от различных условий. Гипоксия и HIF-1α могут влиять на опосредованную цитокинами воспалительную реакцию, либо стимулируя, либо подавляя ее. Стабилизация HIF-1α в условиях тканевой гипоксии может вызвать или усилить «цитокиновый шторм», поскольку VEGF транскрипционно активируется HIF-1α и накапливается при гипоксии. Как известно, эндотелиальные клетки играют важную роль в случае тяжелого течения COVID-19. Миграция циркулирующих иммунокомпетентных клеток в ткани определяется рядом адгезивных молекул и хемоаттрактантов, вырабатываемых эндотелиальными клетками, а также повышенной проницаемостью сосудов [55]. Вместе с тем есть данные, свидетельствующие о том, что за счет стабилизации HIF-1α может быть достигнуто снижение экспрессии провоспалительных цитокинов. В культуре эпителиальных клеток бронхов человека воздействие гипоксии или введение ингибитора пролилгидроксилазы значительно снижало экспрессию медиаторов воспаления IL-6 и IP10 в ответ на лиганды toll-подобных рецепторов. Нокдаун гена HIF-1А, напротив, приводил к увеличению экспрессии медиаторов воспаления. На этом основании высказано предположение, что гипоксия подавляет врожденный иммунный ответ HIF-1α-зависимым путем [56]. Одним из возможных механизмов противовоспалительного действия HIF-1α является активация аденозинового рецепторзависимого пути. Внеклеточный АТФ, как элемент DAMP, сигнализирует о повреждении или гибели клеток и служит мощным активатором воспаления. Аденозин, напротив, обладает выраженным рецептор-опосредованным противовоспалительным действием [57]. Опосредованное HIF-1α переключение на анаэробный гликолиз способствует накоплению аденозина и защите жизненно важных органов от повреждения гиперактивными иммунными клетками.

HIF-зависимые подходы к лечению и профилактике COVID-19

Для лечения и профилактики COVID-19 использованы многочисленные фармакологические препараты, которые далеко не всегда оказывались эффективными и зачастую имели побочные эффекты. Отсутствие эффективных терапевтических подходов объясняет предпринимаемые попытки поиска альтернативных или дополнительных методов лечения SARS-CoV-2 инфекции. На основании приобретенного в период пандемии клинического опыта широко обсуждалась и анализировалась эффективность глюкокортикостероидов в борьбе с COVID-19 [58]. Показано, что, помимо проявления противовоспалительных свойств, дексаметазон HIF-1α-опосредованно снижает экспрессию АПФ2 [59] и подавляет гипоксическую стимуляцию экспрессии гена-мишени HIF-1А VEGF [60]. У пациентов, длительно болеющих коронавирусной инфекцией, лечение дексаметазоном приводило к увеличению показателей выживаемости по сравнению с плацебо или стандартным лечением [61]. Поскольку лечение дексаметазоном сопряжено с побочными эффектами, в качестве альтернативной терапевтической стратегии обсуждается применение ингибиторов HIF-1α.

Стильбеноид ресвератрол, относящийся к классу растительных фенилпропаноидов, и его синтетический аналог 4-(6-гидрокси-2-нафтил)-1,3-бензендиол (HS-1793) ингибируют индуцированную гипоксией экспрессию HIF-1α на уровне белка или переключают на продукцию изоформы HIF-2α [4]. Кроме того, HS-1793 снижает секрецию и экспрессию матричной РНК VEGF, ключевого медиатора ангиогенеза, регулируемого HIF-1α [62]. Полифенольный флавоноид кверцетин в гипоксических условиях подавляет накопление HIF-1α и экспрессию белка HIF-1α, оказывая такое же влияние, как и ингибитор HIF-1α циклогексимид, что позволяет использовать его в качестве потенциального средства против COVID-19 [63]. Исследование, проведенное в отделениях интенсивной терапии на 152 пациентах с COVID-19, показало, что назначение 1 000 мг кверцетина в течение 30 дней значительно сокращало продолжительность госпитализации, потребность в неинвазивной кислородной терапии и количество смертей [64]. Еще один препарат растительного происхождения — куркумин — значительно увеличивал содержание антиоксидантных ферментов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости крыс, подвергнутых воздействию гипоксии, наряду со снижением уровня активных форм кислорода, стабилизирующих экспрессию HIF-1α, снижением экспрессии VEGF и восстановлением гомеостаза сурфактанта [65]. Применение антиоксидантов в терапии COVID-19 может быть эффективным в плане обеспечения защиты тканей от активных форм кислорода, генерируемых активированными иммунными клетками, а также подавления опосредованной HIF-1α продукции цитокинов и образования нейтрофильных внеклеточных ловушек.

Снизить интенсивность «цитокинового шторма» и, следовательно, тяжесть заболевания и смертность пациентов с COVID-19 может доставка кислорода к воспаленным гипоксическим тканям. В качестве переносчика кислорода предлагается использовать перфторуглероды, которые, кроме высокой способности растворять и транспортировать газы, способны снижать экспрессию HIF-1α и прерывать каскад воспалительных реакций [66].

В многочисленных научных публикациях обсуждаются перспективы применения мелатонина для лечения и профилактики COVID-19. Мелатонин — многофункциональный нейрогормон шишковидной железы, обладающий антиоксидантными и противовоспалительными свойствами, является также признанным супрессором HIF-1α [67, 68]. Лечение тяжелых пациентов с COVID-19 мелатонином, либо в сочетании с другими препаратами, уменьшало повреждение легких и тяжесть заболевания, снижало смертность и сокращало продолжительность госпитализации [68—70]. Одни авторы связывают наблюдаемый терапевтический эффект мелатонина с прямым подавлением активности молекулы HIF-1α или удалением активных форм кислорода, стабилизирующих HIF-1α [71]. В работе, опубликованной в 2022 г., высказывается противоположное мнение, что положительные эффекты мелатонина в лечении COVID-19 связаны не с подавлением, а с активацией HIF-1α вследствие ингибирования мелатонином фермента пролилгидроксилазы [72]. Полезный эффект активации и стабилизации HIF-1α под действием ингибиторов HIF-пролилгидроксилазы класса роксадустата наглядно проявился в снижении экспрессии АПФ2 и подавлении SARS-CoV-2-инфицирования клеток легочного эпителия, что позволяет рассматривать потенциальное терапевтическое и профилактическое применение этих препаратов [9]. В качестве нефармакологического метода профилактики заражения SARS-CoV-2 и облегчения патологических последствий COVID-19 предложена гипотеза гипоксического кондиционирования (проведение кратковременных профилактических сеансов гипоксии), основанная на эффекте активации HIF-1α-сигнального пути для снижения тяжести заболевания и улучшения функции жизненно важных органов у пациентов с COVID-19 [8].

Заключение

Исследования, проведенные в период пандемии COVID-19 и направленные на анализ роли гипоксии как важного фактора, определяющего течение, прогрессирование и клинический исход заболевания, выявили важную, но противоречивую роль гипоксической активации HIF-1α-сигнального пути в патогенезе SARS-CoV-2 инфекции. Являясь ключевым фактором в инфицировании SARS-CoV-2 и развитии «цитокинового шторма», HIF-1α может служить потенциальной терапевтической мишенью в лечении и профилактике COVID-19. Необходимы дальнейшие исследования клеточно-молекулярных механизмов, связанных с участием HIF-1α-сигнального пути в иммунопатогенезе заражения SARS-CoV-2, на основе которых могут быть разработаны новые фармакологические стратегии, учитывающие возможный вклад HIF-1α как в противовирусный, так и в провоспалительный ответ на вирусную инфекцию.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Волчкова Е.В., Кузубова Н.А., Александрович Ю.С.

Сбор и обработка материала — Лебедева Е.С., Волчкова Е.В.

Написание текста — Волчкова Е.В., Кузубова Н.А.

Редактирование — Кузубова Н.А., Александрович Ю.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.