Список сокращений

ИК — искусственное кровообращение

мтДНК — митохондриальная ДНК

ОПП — острое повреждение почек

ПОН — полиорганная недостаточность

ПЦР — полимеразная цепная реакция

COX — Cytochrome oxidase, цитохромоксидаза

DAMP — danger-associated molecular patterns, молекулярный паттерн, связанный с повреждениями

NADH — Nicotinamide adenine dinucleotide-hydrogen, никотинамидадениндинуклеотид-гидрид

SOFA — Sequential Organ Failure Assessment, динамическая оценка органной недостаточности

«Золотым стандартом» лечения ряда болезней системы кровообращения (ишемическая болезнь сердца, структурная патология клапанного аппарата) является кардиохирургическое вмешательство, чаще всего проводимое в условиях искусственного кровообращения (ИК) [1]. Известно, что использование ИК за счет ряда факторов (нефизиологическая поверхность контура аппарата ИК, потребность в кардиоплегическом аресте, эпизоды ишемии и реперфузии, гемодилюция, использование донорской крови, применение ингаляционных и неингаляционных анестетиков) может приводить к развитию системной воспалительной реакции (СВР), что связано с реализацией danger-теории или danger-модели [2—4]. Многие исследователи в течение последнего десятилетия стали уделять особое внимание митохондриям как клеточным органеллам, отвечающим за энергетическое снабжение клетки, синтез белка и программированную гибель клетки, в том числе с позиции участия компонентов митохондрий в реализации и активации механизмов danger-модели в критических состояниях [5, 6]. Митохондриальная ДНК (мтДНК) состоит из 165 969 пар оснований, кодирующие последовательности представлены 2 генами рибосомальной РНК, 22 генами транспортной РНК и 13 генами, детерминирующими ферменты, которые участвуют в процессе дыхания, репликации мтДНК, а также один протяженный некодирующий регион, называемый D-петлей, контролирующий процессы транскрипции и трансляции. Известно, что мтДНК высвобождается из клетки под действием стресса и иных связанных с критическими состояниями событий [7]. Митохондрии содержат несколько копий мтДНК, количество которых взаимосвязано с размером и количеством митохондрий, изменяющимися в зависимости от потребности клетки в энергии, окислительного стресса и различных патологических состояний. Количество копий мтДНК отражает функциональное состояние митохондрий посредством продукции АТФ и активности ферментов [8]. Кроме того, мтДНК может повреждаться активными формами кислорода, что способно приводить к дисфункции митохондрий, системному воспалению и активации программированной гибели клеток [9]. Высокий уровень циркулирующей мтДНК действует подобно DAMPs (danger-associated molecular patterns, молекулярный паттерн, связанный с повреждениями), усиливая воспаление и повреждение органов [10]. Опубликован ряд исследований, ставящих своей целью связать уровень мтДНК в крови и особенности патогенеза СВР. Так, в своем исследовании авторы отмечают увеличение содержания в плазме крови циркулирующей мтДНК и цитокинов у всех пожилых пациентов независимо от тяжести состояния и особенностей послеоперационного течения после малоинвазивной операции по имплантации аортального клапана [11]. Еще одна группа исследователей установили, что у пациентов с остановкой сердца экспрессия генов цитохромоксидазы 3 (MT-CO3), NADH 1 (MT-ND1), NADH 2 (MT-ND2), цитохрома B (MT-CYB) была выше по сравнению со здоровыми. Однако после применения метода целевого управления температурой на фоне гипотермии до 33 °C наблюдалось относительное снижение экспрессии генов цитохромоксидазы 3 (MT-CO3), NADH 1 (MT-ND1), NADH 2 (MT-ND2) [12]. Китайские ученые также показали, что уровень циркулирующей мтДНК у пациентов с сочетанной травмой статистически значимо выше по сравнению со здоровыми донорами. Следует отметить, что высокий уровень мтДНК в плазме сохранялся в дальнейшем и у пациентов с развившейся посттравматической СВР [13].

Цель исследования — оценить уровень мтДНК в сыворотке пациентов, перенесших кардиохирургическое вмешательство по поводу коррекции патологии клапанов сердца, в зависимости от развития послеоперационной полиорганной недостаточности (ПОН).

Материал и методы

Характеристика исследуемой группы

В исследование включены пациенты, подвергшиеся хирургическому лечению на базе НИИ КПССЗ в период с 2018 по 2020 г. Все пациенты предварительно ознакомлены с условиями и подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Исследование одобрено локальным этическим комитетом. Подробная клиническая характеристика пациентов представлена в таблице.

Клиническая характеристика обследованных пациентов

Clinical characteristics of patients

Примечание. ИК — искусственное кровообращение; ПОН — полиорганная недостаточность; шкала CIRS — Cumulative Ilness Rating Scale (кумуляционная шкала коморбидности).

Все пациенты оперированы в условиях непульсирующего ИК с использованием нормотермического режима с перфузионным индексом 2,3 л/мин/м². Защита миокарда проводилась с использованием кристаллоидной кардиоплегии раствором Кустадиол («Dr. F. Kohler Chemie», Германия). Доставка раствора для кардиоплегии антеградная/ретроградная в зависимости от выраженности гипертрофии миокарда. Операции проходили в условиях общей комбинированной анестезии по эндотрахеальной методике, индукция анестезии — пропофол (3 мг/кг/ч), далее ингаляционный наркоз севофлураном 0,8—1,3 МАК (минимальная альвеолярная концентрация) до начала основного этапа, на основном этапе использовали пропофол в дозе 2 мг на 1 кг массы тела в 1 ч, далее после снятия зажима с аорты повторно возобновляли подачу севофлурана. Аналгезия проводилась с использованием фентанила в дозе 5—7 мкг на 1 кг массы тела в 1 ч. Интраоперационный мониторинг системной гемодинамики включал в себя инвазивный контроль уровня артериального давления, сердечного выброса (или с использованием катетера Сван—Ганца, или с использованием интраоперационной чреспищеводной эхокардиографии), BIS-мониторинг. Тяжесть ПОН в послеоперационном периоде определяли по шкале SOFA (Sequential Organ Failure Assessment, динамическая оценка органной недостаточности) (J.L. Vincent и соавт., 1996). При определении структур органной недостаточности использовали критерии: острый респираторный дистресс-синдром — «Берлинские» дефиниции, острое повреждение почек (ОПП) — по критериям ADQI (Acute dialysis quality initiative), центральная нервная система — оценка по шкале ком Глазго и/или наличие делирия по шкале CAM-ICU (Confusion Assessment Method-Intensive Care Unit) [12].

Забор крови

Забор венозной крови у пациентов проводили в пробирки, содержащие К3-ЭДТА и активатор свертывания, на следующих этапах: до начала операции, в 1, 3 и 7-е сутки после оперативного вмешательства. Далее кровь центрифугировали и аликвотировали плазму и сыворотку в пробирки типа Эппендорф. Далее пробирки с плазмой хранились в низкотемпературном холодильнике (–80 °C) до момента проведения исследования.

Выделение ДНК и количественный анализ мтДНК

Общую ДНК выделяли из 200 мкл плазмы при помощи набора QIAamp DNA Mini Kit (кат. номер 51306, «Qiagen», Германия). Концентрацию выделенной ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 2000 («Thermofisher scientific», США). Затем ДНК хранили при –80 °C до момента проведения исследования. Экспрессию генов мтДНК определяли методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флюоресцентным красителем SYBR Green на амплификаторе CFX96 Touch («Bio-Rad Laboratories», США). Подбор праймеров осуществляли путем анализа данных литературы (NADH, NADH 1, NADH 2, COX II, COX III, Cytochrome b) [13—15]. Праймеры синтезированы компанией ЗАО «Евроген» (Россия). Реакционная смесь в конечном объеме 10 мкл содержала 5 мкл мастер-микса PowerUp SYBRGreen Master Mix («Applied Biosystems», США), по 500 нМ прямого и обратного праймеров и по 20 нг ДНК. ПЦР проводили в стандартном 96-луночном оптическом планшете, который содержал 26 анализируемых образцов, 5 стандартов с двукратным разведением и 1 отрицательный контроль. Амплификация включала 40 циклов: денатурация 15 с при 95 °C, отжиг 15 с при 52—56 °C (в зависимости от температуры плавления выбранных праймеров), элонгация 1 мин при 72 °C. Нормализацию результатов ПЦР проводили при помощи референсного гена (гена «домашнего хозяйства») GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). Относительный уровень экспрессии рассчитывали по методу ΔCt. Графики мтДНК показаны в виде уровней экспрессии гена в условных единицах (уровень экспрессии гена, нормированный на референсный ген).

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку данных проводили при помощи программы GraphPad Prism 8.0. Нормальность распределения проверяли при помощи критерия Колмогорова—Смирнова. Для межгруппового сравнения использовали U-критерий Манна—Уитни (для сравнения двух групп) и критерий Краскелла—Уоллиса (для сравнения нескольких групп). Поиск прогностических предикторов проводили при помощи ROC-анализа, площадь под кривой (AUC) использовали для оценки точности прогнозирования. Корреляцию между показателями для случая непараметрических данных рассчитывали с использованием линейной регрессии.

Результаты

Уровень мтДНК у пациентов

У всех исследуемых уровни экспрессии генов мтДНК до операции были сопоставимы и не имели различий. Сразу же после операции экспрессия гена цитохрома B (MT-CYB) статистически значимо различалась, была выше у пациентов с наличием ПОН и сохранялась таковой в течение всего периода наблюдения, статистически значимого повышения экспрессии гена у пациентов без ПОН не было (рис. 1). Аналогичная динамика наблюдалась в отношении экспрессии генов цитохромоксидаз (рис. 2, 3). В отношении экспрессии генов NADH — повышение уровня экспрессии у пациентов обеих групп в 1-е сутки не имело статистически значимых различий, тенденция к росту появилась только на 3-и сутки (рис. 4, 5). Отметим, что уровень экспрессии генов мтДНК практически для всех групп генов сохранялся повышенным у исследуемых с ПОН по сравнению с пациентами без осложненного течения послеоперационного периода.

Рис. 1. Экспрессия генов цитохрома B (MT-CYB).

Fig. 1. Expression of cytochrome B genes (MT-CYB).

Рис 2. Экспрессия генов цитохромоксидазы 2 (MT-CO2).

Fig. 2. Expression of cytochrome oxidase 2 genes (MT-CO2).

Рис. 3. Экспрессия гена цитохромоксидазы 3 (MT-CO3).

Fig. 3. Expression of cytochrome oxidase 3 genes (MT-CO3)

Рис. 4. Экспрессия гена NADH 1 (MT-ND1).

Fig. 4. Expression of NADH 1 gene (MT-ND1).

Рис. 5. Экспрессия гена NADH 2 (MT-ND2).

Fig. 5. Expression of NADH 2 gene (MT-ND2).

Далее мы провели регрессионный анализ между показателями оценки тяжести ПОН по SOFA и уровнем мтДНК в плазме пациентов на дооперационном этапе и в 1-е, 3-и и 7-е сутки после операции. Для точки «Первые сутки» получена средняя положительная корреляционная связь (r=0,45; p=0,028) (рис. 6).

Рис. 6. Регрессионный анализ показателей тяжести полиорганной недостаточности по SOFA и уровня мтДНК в плазме пациентов.

Fig. 6. Regression analysis of SOFA score of multiple organ failure and serum mtDNA.

С целью оценки мтДНК как предиктора развития послеоперационных осложнений провели ROC-анализ, который показал, что уровень циркулирующей мтДНК в плазме (AUC=0,605) может быть предиктором развития ПОН.

Структура полиорганной недостаточности у пациентов с осложненным течением

При рассмотрении структуры послеоперационной ПОН установили явное превалирование ОПП среди проявлений ПОН (>80% по сравнению с острым респираторным дистресс-синдромом — 38%, недостаточностью желудочно-кишечного тракта — 13% и острой церебральной недостаточностью в виде угнетения сознания и/или развития делирия — 40%) (рис. 7).

Рис. 7. Структура и частота поражения органов и систем при развитии полиорганной недостаточности.

ОРДС — острый респираторный дистресс-синдром; ОПП — острое повреждение почек; ЖКТ — желудочно-кишечный тракт; ЦНС — центральная нервная система.

Fig. 7. Structure and incidence of organ damage following multiple organ failure.

Обсуждение

У пациентов после операций на сердце, выполненных в условиях ИК с формированием послеоперационной ПОН, мы определили статистически значимое повышение уровня циркулирующей мтДНК, прежде всего, в 1-е сутки с момента поступления в отделение реанимации, наряду с комплексом клинических факторов, способных прогнозировать формирование ПОН у данной когорты больных, что ранее отмечено нами в публикациях [16]. Проведение операций в условиях ИК, как правило, сопряжено с развитием СВР вследствие ишемического/реперфузионного повреждения органов (прежде всего, миокарда), контакта компонентов крови с контуром аппарата ИК, высвобождения эндотоксинов. СВР характеризуется «цитокиновым выбросом», который в случае своей избыточности (дезадаптации) способен приводить к необратимой дисфункции органов [17]. При инициировании СВР молекулами DAMP говорят о неинфекционном системном воспалительном ответе [18]. DAMP способны активировать эпителиальные, эндотелиальные клетки и фибробласты, а также нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки [19]. Активация данных клеток способствует высвобождению цитокинов и хемокинов в кровоток, что в свою очередь приводит к развитию воспалительных реакций и активации иммунного ответа [20]. Большое значение на сегодняшний день придают внеклеточной мтДНК как молекуле DAMP [21, 22]. Высвобождение мтДНК связано с увеличением активных форм кислорода и повышением проницаемости мембраны. В литературе приводится 2 механизма, которые свидетельствуют о том, что мтДНК способствует развитию воспалительной реакции. Первый связан с активацией NLRP3, что в свою очередь приводит к активации каспазы-1, в результате чего провоспалительные цитокины (ИЛ-19, ИЛ-18) переходят в активную форму. Второй механизм основан на активации TLR-9, который связывается с неметилированными CpG-мотивами в структуре бактериальной и вирусной ДНК [23]. Оба механизма приводят в конечном итоге к одному результату — СВР. Проведенное нами исследование подтверждает гипотезу о том, что мтДНК может выступать в качестве вероятного инициатора и биологического маркера для прогнозирования развития СВР у пациентов, перенесших кардиохирургическое вмешательство. Более ранние исследования, проведенные учеными из разных стран, доказывают, что повышенный уровень мтДНК может наблюдаться при различных состояниях, таких как рак молочной железы, ишемический инсульт, инфаркт миокарда, а также при системном воспалительном ответе [23]. Так, например, коллектив китайских исследователей показал, что уровень мтДНК в плазме крови пациентов с травмой выше по сравнению со здоровыми донорами, кроме того, плазменный уровень мтДНК также выше и у пациентов, у которых развился посттравматический системный воспалительный ответ [24]. В нашем исследовании наблюдается незначительное различие (в 1,25 раза) уровня мтДНК у пациентов с СВР, что можно объяснить небольшим количеством наблюдений. В исследованиях [24] отмечается положительная корреляционная связь между показателем SOFA и уровнем мтДНК в плазме крови пациентов в 1-е сутки после оперативного вмешательства, что также отражено в нашем исследовании. Группа исследователей показали, что уровень мтДНК в плазме пациентов позволяет прогнозировать выживаемость пациента, находящегося в отделении интенсивной терапии. Так, у пациентов, умерших на 28-й день с момента поступления в стационар, количество копий мтДНК было в несколько раз выше по сравнению с выжившими пациентами [25].

Связь между экспрессией геном мтДНК и тяжестью ПОН ранее обсуждалась в работах, посвященных, прежде всего, сепсису и травме [26, 27]. В исследованиях отмечается, что СВР как проявление критического состояния сопровождается развитием ОПП не менее, чем в 35%, что подтверждает роль мтДНК в качестве алармина даже в отсутствие первичного очага инфекции и при неинфекционном характере СВР.

Собственно, именно это и наблюдается у кардиохирургических пациентов, имеющих осложненный послеоперационный период. Авторы подчеркивают, что уровень сывороточного мтДНК не имеет столь большого диагностического значения в отношении ОПП по сравнению с уровнем мтДНК в моче.

Мы получили результаты, сопоставимые с выводами ряда авторов о связи между увеличением уровня мтДНК и развитием ПОН, а также неблагоприятным исходом (оценку связи между уровнями мтДНК и исходом мы не проводили). Авторы отмечают, что мтДНК превосходил по своей диагностической значимости такие «классические» параметры прогноза ПОН, как объем гемотрансфузий, объем тканевого повреждения (речь идет о травме как причине критического состояния и ПОН), тяжесть повреждений. Аналогично авторы установили прямую связь с выраженностью СВР и уровнем мтДНК (прямая сильная связь). Мы также получили сопоставимые данные о том, что при неблагоприятном течении ПОН и ее персистенции уровень мтДНК сохранялся на стабильно высоком уровне, что может быть связано с формированием индуцированной иммунной супрессии и вкладом мтДНК в поддержание данного явления (ранее роль и вклад индуцированной иммуносупрессии также рассмотрены и доказаны нами в исследованиях на модели кардиохирургического пациента) [28]. Связь между уровнем мтДНК у пациентов с травмой и сепсисом (т.е. при наличии СВР неинфекционного и инфекционного генеза) и проявлением ПОН может подтверждать теорию о развитии дистантных органных повреждений, способных замкнуть патофизиологическую цепочку ПОН при повреждении одного органа. Проведенные ранее исследования, равно как и наши результаты, позволяют прийти к выводу, что мтДНК как алармин и кандидатный прогностический маркер может реализовать свою прогностическую роль весьма рано, в первые 8 ч [29].

В нашем исследовании отмечен ряд серьезных ограничений, в частности одноцентровый характер, что способствовало небольшому числу включенных в исследование пациентов с учетом планового характера оперативных вмешательств. Дальнейшие исследования мы планируем продолжить в направлении включения большего числа пациентов, а также обоснования мтДНК в качестве маркера эффективности терапевтических вмешательств. Так, на основании выделения эндофенотипа пациента по уровню мтДНК могут быть обоснованы такие варианты терапии, как методы экстракорпорального очищения крови или вариант фармакологической антиоксидантной защиты. На основании измеренного уровня аларминов эффективность терапевтических методов и выбор конкретных методов очищения крови (например, превентивная цитокиновая сорбция, способная также сорбировать алармины) будет наибольшая [30, 31].

Выводы

1. На небольшой когорте кардиохирургических пациентов показано, что уровень мтДНК статистически значимо повышается при формировании ПОН вне зависимости от причины возникновения критического состояния.

2. Уровень мтДНК коррелирует с тяжестью ПОН по шкале SOFA.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Корнелюк Р.А.

Сбор и обработка материала — Ивкин А.А.

Статистический анализ данных — Григорьев Е.В.

Написание текста — Цепокина А.В.

Редактирование — Понасенко А.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.