Влияние севофлурана и пропофола на уровни ядерной ДНК и митохондриальной ДНК в плазме крови у детей с краниосиностозом

Согласно современным данным, особую актуальность приобретают научные исследования по изучению циркулирующих клеточных нуклеиновых кислот (НК) в физиологических жидкостях организма в качестве диагностических маркеров при различных вариантах повреждающего воздействия, приводящих к развитию полиорганной дисфункции, в том числе к нейрональному повреждению, запуску асептической воспалительной реакции и нейронального апоптоза. Циркулирующие в крови нуклеиновые кислоты (НК), или внеклеточные НК (вкНК), открыты в 1948 г. P. Mandel и P. Metais и представлены ДНК и РНК [1]. Из вкНК наибольший интерес представляют митохондриальная ДНК (мтДНК) и ядерная ДНК (яДНК). мтДНК расположена в митохондриях эукариотических клеток, яДНК представлена в ядре каждой эукариотической клетки. В соответствии с теорией эндосимбиогенеза α-протеобактерии, являвшиеся предшественниками митохондрий более двух миллиардов лет назад, в настоящее время стали частью эукариотических клеток, а исходный геном «переселился» в ядро, однако митохондрии и сегодня обладают собственным геномом [1]. Митохондриальный геном кодирует 37 генов, включая 13 аминокислот, которые жизненно необходимы для процессов окислительного фосфорилирования, обеспечивающего энергией клетку. Мутации мтДНК вызывают преждевременное старение у мышей в эксперименте [1], а дальнейшие исследования показали, что количество гетероплазмий увеличивается с возрастом, притом что общее количество мтДНК, наоборот, снижается [2]. Кроме того, мтДНК при воздействии агрессивного агента (инфекция, стресс и др.) может выступать как молекулярный фрагмент, ассоциированный с повреждением (дистресс-ассоциированные молекулярные паттерны — ДАМП), и вызывает ответ, опосредуемый Toll-подобными рецепторами (TLR3, TLR9) и ДНК-зависимыми активаторами регуляторных факторов интерферона, которые, в свою очередь, управляют клеточной активацией и иммунореактивностью [3]. Активация TLR3 стимулирует продукцию TNF-α и IL-6 [4, 5]. Таким образом, мтДНК, высвобождаясь при различных вариантах повреждающего действия на клетку (митохондрию), способствует запуску и активации системного воспалительного ответа.

Согласно современным представлениям, яДНК наряду с мтДНК также способствует продукции провоспалительных цитокинов, высвобождаясь из клетки в кровоток после ее гибели или действия на клетку патологического агента (травма, инфекция, радиация и др.). В большинстве случаев изучение уровней циркулирующей внеклеточной яДНК как диагностического и прогностического маркера проводилось у пациентов онкологического профиля, поскольку считается, что существенное освобождение внеклеточной яДНК у данной категории пациентов происходит из опухолевых клеток в результате их апоптоза или некроза [6]. В некоторых исследованиях показано, что содержание в плазме крови яДНК и мтДНК коррелирует с летальностью при сепсисе [7]; НК выступают в качестве диагностического маркера степени повреждения органов и тканей: чем выше концентрация НК в плазме крови, тем больше вероятность летального исхода [8, 9].

Влияние внутривенных и ингаляционных общих анестетиков на механизмы апоптоза на молекулярном и клеточном уровнях остается не до конца изученными, несмотря на значительные успехи проводимых исследований диагностической значимости оценки уровня внеклеточных ДНК в плазме крови при различных патологических воздействиях на клетку [10]. Развитие молекулярной биологии в последние годы способствовало в большей степени пониманию фармакологии внутривенных анестетиков; роль ингаляционных анестетиков, в свою очередь, в запуске механизмов апоптоза, в особенности нейронального апоптоза, изучена недостаточно [11].

В педиатрической анестезиологии обозначена как чрезвычайно актуальная проблема оценки нейротоксического влияния общего анестетика в отношении развивающегося мозга, суть которого — возможное формирование когнитивных нарушений и задержка психомоторного развития за счет активации нейронального воспаления и нейроапоптоза [12—14].

Известно, что некоторые общие анестетики могут вызывать нейротоксический эффект и, как следствие, нарушение когнитивной и поведенческой сферы. Например, изофлуран вызывает повреждение ДНК с помощью следующих механизмов: индуцирует окислительный стресс, приводящий к активации каспазы-3 и, следовательно, к активации каспазаактивированной ДНКазы (Caspase-activated DNase — CAD), вызывая повреждение ДНК, и предотвращает восстановление повреждения ДНК посредством снижения уровня p53 [15, 16]. При сравнении воздействия севофлурана и десфлурана на новорожденных детей, рожденных путем кесарева сечения от матерей, получивших ингаляционную анестезию севофлураном и десфлураном, обнаружено, что оба анестетика вызывают генотоксическое повреждение, однако по сравнению с десфлураном эффекты севофлурана более благоприятные [17].

Интересные данные обнаружены в отношении широко применяемого препарата для анестезии/седации у детей — пропофола. Показано, что пропофол обладает антиоксидантными свойствами, которые проявляются в снижении уровня маркеров окислительного стресса и, следовательно, генотоксического влияния, что позволяет рассматривать пропофол в качестве предпочтительного анестетика с нейропротективными свойствами, в первую очередь в нейроанестезиологии [18, 19]. Однако для развивающегося детского мозга эти свойства анестетика также чрезвычайно важны, поскольку благодаря наличию антиоксидантного и противовоспалительного эффектов снижается риск развития когнитивной дисфункции у детей в послеоперационном периоде и возможных отсроченных неврологических нарушений [20].

Проведенные единичные исследования в педиатрии не дают убедительных ответов на поставленные вопросы, в большинстве случаев результаты влияния общих анестетиков на механизмы нейронального повреждения и нейроапоптоза получены либо на взрослой популяции, либо на моделях экспериментальных животных [21].

В современной отечественной и зарубежной литературе практически не представлены данные об изучении содержания в плазме крови внеклеточных яДНК и мтДНК и их прогностической значимости у детей первого года жизни в условиях общей анестезии, что и послужило основной причиной для проведения исследования на модели педиатрических пациентов с краниосиностозом.

Цель исследования — определить содержание циркулирующих нуклеиновых кислот (яДНК и мтДНК) в периферической венозной крови у детей с краниосиностозом при проведении общей анестезии с применением севофлурана и пропофола в процессе выполнения магнитно-резонансной томографии (МРТ) головного мозга до нейрохирургического вмешательства.

Проведено проспективное когортное контролируемое исследование, включившее 46 пациентов и 20 здоровых добровольцев. Исследование выполнено в отделении анестезиологии и реанимации с палатами интенсивной терапии №3 для детей, в отделении нейрохирургии для детей №7 ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова». Получено одобрение комитета по этике ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» (протокол №07112019 заседания №11-19 от 11 ноября 2019 г.).

В процессе выполнения исследования сформированы четыре группы:

I группа — пациенты с диагнозом краниосиностоза с применением общей анестезии севофлураном при выполнении МРТ-исследования головного мозга (n=23);

II группа — пациенты с диагнозом краниосиностоза с применением внутривенного гипнотика пропофола при выполнении МРТ-исследования головного мозга (n=23);

III группа — контрольная, здоровые дети (n=10);

IV группа — контрольная, здоровые взрослые (n=10).

Распределение исследуемых участников по группам представлено на рис. 1. Общая характеристика пациентов, включая время воздействия анестетика, представлена в таблице.

Рис. 1. Распределение пациентов по группам исследования.

Таблица. Характеристика участников исследования

Примечание. По представленным показателям массы тела, возраста и пола между группами I, II, III статистически значимые различия не обнаружены; * — результаты представлены как среднее значение и стандартное отклонение.

Критерии включения и невключения в исследование для первых двух групп были идентичными.

Критерии включения: наличие информированного добровольного согласия от законного представителя ребенка для участия в исследовании; роды срочные, оценка по шкале Апгар 7—9 баллов; отсутствие хронических или перенесенных накануне госпитализации инфекционных заболеваний; отсутствие когнитивных нарушений и неврологической патологии; отсутствие приема лекарственных препаратов на постоянной основе или за 2 нед до госпитализации; отсутствие какой-либо хирургической патологии и хирургических вмешательств ранее; соответствие лабораторных показателей клинического и биохимического исследования крови возрастной норме.

Критерии невключения: рождение в сроке до 37 нед гестации; хронические заболевания; постоянный прием лекарственных препаратов; наличие грубой неврологической патологии; декомпенсированные формы краниосиностоза; вирусная или бактериальная инфекция, перенесенная менее чем за 4 нед до даты нейровизуализационного исследования.

При оценке физикального статуса по данным Американского общества анестезиологов (ASA) первые две группы исследуемых отнесены к I или II классу.

В III группу, сформированную для контроля полученных данных молекулярно-генетического исследования, включены здоровые доношенные дети в возрасте до 1 года жизни без инфекционных заболеваний, перенесенных в течение 2 нед накануне забора образцов крови, не принимающие какие-либо лекарственные препараты.

В IV группу, сформированную для сравнения полученных данных молекулярно-генетического исследования, включены здоровые взрослые добровольцы без хронических заболеваний, вредных привычек и приема фармакологических препаратов на постоянной основе.

За 60 мин перед проведением МРТ-исследования головного мозга на место предполагаемой катетеризации периферической вены с целью постановки периферического венозного катетера выполняли аппликацию местноанестезирующего крема «Эмла» 5% («Ресифарм Карлскога АБ», Швеция) в соответствии с инструкцией по применению у детей. Далее проводили постановку периферического венозного катетера с забором первого образца крови до подачи севофлурана или внутривенного введения пропофола. Затем выполняли анестезиологическое обеспечение при проведении МРТ-исследования головного мозга по одной из двух методик.

1. При применении севофлурана общую анестезию проводили с помощью МРТ-совместимого наркозно-дыхательного аппарата (Dräger Medical GmbH, Германия), выполняли насыщение анестетиком севораном (ООО «ЭббВи», Россия) 8 об.% в потоке воздушно-кислородной смеси 8 л/мин (FiO₂=0,8) в течение 2 мин через неплотную лицевую маску, фиксированную силиконовыми держателями к голове пациента, поддерживали анестезию 2,0—2,5 об.% севофлурана в потоке воздушно-кислородной смеси 1,5—2,5 л/мин (FiO₂=0,45), что соответствует 1 МАК (E.I. Eger II, 2001).

2. Общую внутривенную анестезию пропофолом («Пропофол-Липуро», ООО «Б. Браун Медикал») осуществляли медленным болюсным введением в дозе 2—3 мг на 1 кг массы тела с переходом на поддерживающую дозу 2,5 мг на 1 кг массы тела в час внутривенно микроструйно в течение всего периода выполнения МРТ.

В ходе проведения МРТ-исследования выполняли непрерывный мониторинг частоты сердечных сокращений, частоты дыхания, SpO₂, etCO₂ с помощью МРТ-совместимого монитора Invivo Expression (Philips Medical Systems, Нидерланды); осуществляли неинвазивное измерение уровня систолического, диастолического, среднего артериального давления. По окончании МРТ-исследования головного мозга прекращали подачу ингаляционного или введение внутривенного препарата с осуществлением второго забора образца крови. Восстановление сознания происходило в течение 2—3 мин в случаях обеих методик общей анестезии. Респираторных и гемодинамических осложнений после общей анестезии не было.

Получение плазмы. Цельную кровь забирали в вакуумные пробирки с K₃EDTA (Vacutest KIMA S.r.l., Италия). Пробирки центрифугировали при 400g в течение 10 мин. Полученную плазму отбирали в чистые пробирки, которые центрифугировали при 1600 g в течение 10 мин. Супернатант повторно переносили в свежие пробирки и еще раз центрифугировали в том же режиме. Полученный после этого центрифугирования супернатант аликвотировали в чистые пробирки, замораживали при –80°C и хранили в этих условиях до использования.

Выделение ДНК. Ранее замороженные образцы плазмы крови размораживали при комнатной температуре и центрифугировали при 3000g в течение 10 мин. Выделение общей ДНК происходило из 100 мкл плазмы с помощью наборов QIAamp DNA MiniKit (Qiagen, США) согласно рекомендациям производителя по методике, описанной и апробированной ранее нашей группой [22]. Образцы выделенной ДНК хранили при температуре –80°C до дальнейшего использования.

Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени. Количественную ПЦР в реальном времени применяли для оценки уровня ДНК, как это описано ранее [22]. Для детекции яДНК использовали праймеры к высококопийному повтору Alu: Alu_F 5’-GTGGCTCACGCCTGTAATC-3’, Alu_R 5’-CAGGCTGGAGTGCAGTGG-3’. Для детекции мтДНК использовали праймеры к гену субъединицы цитохромоксидазы 3: CO3_F5 5’-CTTCTGGCCACAGCACTTAAAC-3’, CO3_R5 5’-GCTGGTGTTAGGGTTCTTTGTTTT-3’. Контроль ингибирования ферментативных реакций проводили посредством детекции добавочной последовательности ДНК mw2060 с помощью праймеров mw2060_F 5’-GTGCTGACCATCCGAG-3’, mw2060_R 5’-GCTTGTCCGGTATAACT-3’. Амплификацию мишеней выполняли с использованием qPCRmix-HS SYBR+ROX mastermix (Evrogen, Россия) согласно рекомендациям производителя. Образцы ДНК разводили в 10 раз водным раствором тРНК Escherichia coli (10 нг/мкл). Количество исследуемых ДНК мишеней рассчитывали по формуле:

2^{(Cq_max–Cq)},

где: Cq — значение цикла квантификации исследуемой мишени в конкретном образце, Cq_max — максимальное значение цикла квантификации исследуемой мишени во всех образцах.

Для анализа различий уровней исследуемых мишеней между группами образцов проводили попарные сравнения с использованием непараметрических методов Уилкоксона и Манна—Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Статистический анализ проводили с использованием программы GraphPadPrism 8 (GraphPad Software Inc., США).

Для оценки влияния севофлурана и пропофола на уровни вкНК у детей с краниосиностозом до нейрохирургического вмешательства проведен этап сравнения уровней яДНК и мтДНК в венозной крови у здоровых взрослых и здоровых детей с показателями у детей I и II групп до применения севофлурана и пропофола. Выявлены более высокие значения вкНК у здоровых детей по сравнению с показателями у здоровых взрослых — с разницей примерно в 200 раз (p<0,001) (рис. 2а) и примерно в 4 раза по мтДНК (p=0,013) (рис. 2б). При сравнении уровней яДНК и мтДНК у детей с краниосиностозом и без данной патологии значения вкНК не имели различий.

Рис. 2. Уровни ядерной ДНК и митохондриальной ДНК в плазме крови у взрослых контрольной группы, у детей контрольной группы, а также у детей с краниосиностозом.

а — уровень яДНК; б — уровень мтДНК.

Не выявлены различия уровней яДНК и мтДНК в ходе применения пропофола (рис. 3). По результатам исследования установлено снижение уровней яДНК в плазме крови у детей с краниосиностозом при проведении общей анестезии севофлураном в 7 раз (p=0,043) (см. рис. 3а), при этом уровни мтДНК не изменялись (см. рис. 3а, 3б). При использовании пропофола уровни яДНК и мтДНК также статистически значимо не изменялись (см. рис. 3в, 3г).

Рис. 3. Концентрации ядерной ДНК и митохондриальной ДНК в плазме крови у детей с краниосиностозом до и после процедуры.

а — уровень яДНК при анестезии севофлураном; б — уровень мтДНК при анестезии севофлураном; в — уровень яДНК при седации пропофолом; г — уровень мтДНК при седации пропофолом.

Выявлены высокие значения яДНК и мтДНК у детей, независимо от наличия диагноза краниосиностоза, по сравнению с группой здоровых взрослых добровольцев [23]. Вероятно, причинами данных различий в зависимости от возраста могут быть следующие известные факты: интенсивность апоптоза в детской популяции в несколько раз превосходит таковую у взрослых, так как она связана с более быстрым темпом развития. По этой же причине происходит быстрое формирование новых нейронов, но и нереализованные нейроны, которые подвергаются запрограммированной гибели, находятся в избыточном количестве [24]. Получены также данные о высокой реактивности иммунной системы у детей, особенно у детей первого года жизни. Содержание в крови большого количества незрелых эритроцитов, которые имеют ядра и митохондрии, может также послужить причиной высокого уровня вкНК в силу избавления от этих органелл в кровотоке; также известно о низкой активности ДНКазы крови [25, 26]. В одном из недавних исследований проводили анализ сравнения содержания мтДНК и яДНК у детей с сахарным диабетом и у здоровых детей, в обеих группах получены высокие значения уровней вкНК [27]. Однако имеются исследования, в которых приведены данные о практически одинаковых значениях уровней вкНК у детей и у взрослых моложе 50 лет [28]. При этом свободноциркулирующая ДНК рассматривается как молекулярный паттерн, ассоциированный с повреждением (ДАМП), и может являться причиной воспаления. Чем выше значение уровня ДНК в крови, тем более явным оказывается хроническое воспаление [28]. При этом в качестве источника вкНК в крови у здоровых взрослых могут быть апоптотические лимфоциты и другие клетки, содержащие ядро [29].

В качестве возможных причин влияния на уровни циркулирующей яДНК при применении ингаляционной анестезии севофлураном можно рассматривать генотоксическую активность анестетика, а также влияние анестетика на активность ДНКазы в крови и его влияние на возможность почек или легких к выведению вкНК. Ранее показано, что севофлуран может приводить к повреждению ДНК [30], позднее при обследовании медицинского персонала, регулярно контактирующего с анестетиками, показано, что галогенсодержащие препараты не вызывают системных повреждений ДНК, но приводят к нестабильности генома, цитотоксичности и нарушениям пролиферации [31].

Снижение содержания яДНК и мтДНК при использовании севофлурана в нашем исследовании совпадает с результатами проведенного Y. Qin и соавт. (2019) анализа [16]. Исследователи сравнивали генотоксический эффект севофлурана и пропофола путем определения сывороточного уровня нейроспецифического белка S100B и экспрессии в мононуклеарных клетках периферической крови белков NOX2 и NOX4, которые влияют на высвобождение яДНК, где обнаружили протективное воздействие севофлурана. В группе севофлурана уровни нейроспецифического белка S100B и белков NOX2 и NOX4 были значительно ниже, чем в группе пропофола.

Но имеется и противоположное мнение. Например, при изучении окислительного повреждения и локальной генотоксичности сравнивали эффекты севофлурана и десфлурана в бронхоальвеолярных клетках. При применении каждого из анестетиков подтверждено повреждающее ДНК действие в бронхоальвеолярных клетках. При этом локальная генотоксичность и системное повреждающее ДНК действие были одинаковыми в обеих группах [32].

По сравнению со взрослыми в детской популяции, независимо от наличия диагноза краниосиностоза, выявлены высокие показатели ядерной (p<0,001) и митохондриальной ДНК (p=0,013). При ингаляционной анестезии севофлураном в группе детей с краниосиностозом при выполнении МРТ-исследования головного мозга до нейрохирургического вмешательства выявлены изменения в виде снижения уровней ядерной ДНК после воздействия анестетика (p=0,043); уровни митохондриальной ДНК до и после применения анестетика остаются неизменными. При использовании внутривенной анестезии пропофолом уровни ядерной и митохондриальной ДНК не изменяются.

Таким образом, в соответствии с полученными нами данными можно заключить, что оба анестетика (севофлуран и пропофол) оказывают либо нейтральное, либо угнетающее действие на изменение уровней циркулирующей ядерной и митохондриальной ДНК. Эффект применения севофлурана у детей с краниосиностозом в процессе проведения общей анестезии можно рассматривать как протективный, поскольку его использование приводит к снижению уровня ядерной ДНК (p=0,043), являющейся одним из маркеров цитотоксичности. Почему вызванное севофлураном снижение ядерной ДНК в плазме крови относительно физиологической нормы у детей можно считать протективным? Потому что свободноциркулирующая ядерная ДНК рассматривается в качестве молекулярного паттерна, ассоциированного с повреждением, и может являться причиной воспаления в условиях нейрохирургической операции, сопряженной с развитием асептического системного воспалительного ответа у детей с краниосиностозом, этот высокий уровень ядерной ДНК может выступать триггером дополнительного нейронального повреждения, обусловленного механизмами нейровоспаления, которые запускаются непосредственно нейрохирургическим вмешательством.

В качестве практической рекомендации детям с краниосиностозом при проведении магнитно-резонансной томографии головного мозга предлагается выбор общей анестезии севофлураном в связи со снижением при воздействии ингаляционного анестетика плазменной концентрации свободноциркулирующей ядерной ДНК, ассоциированной с повреждением и асептическим системным воспалительным ответом.

Проведенное исследование имеет ограниченный размер выборки пациентов. Выполнено сравнение показателей у детей и у здоровых взрослых добровольцев, однако полученные результаты могут явиться стартовыми значениями для дальнейшего изучения влияния общих анестетиков на процессы нейроапоптоза и нейровоспаления.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Гурская В.И., Саввина И.А., Иванов В.П., Костарева А.А.

Сбор и обработка материала — Гурская В.И., Иванов В.П., Ма И.

Статистическая обработка — Гурская В.И., Головкин А.С., Паншин Д.Д., Кондратов К.А.

Написание текста — Гурская В.И., Головкин А.С.

Редактирование — Саввина И.А., Костарева А.А., Головкин А.С.

Благодарность. Авторы выражают благодарность Антону Владимировичу Федорову за участие в реализации проекта и ценные комментарии при анализе полученных результатов.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ №19-75-20076.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts interest.