Обширные хирургические вмешательства в условиях общей анестезии могут сопровождаться развитием асептического воспаления [1, 2]. Появление асептической системной воспалительной реакции представляется важным фактором, определяющим послеоперационный прогноз у пациентов. В частности, модуляция нейровоспаления может выступать в качестве регулятора развития послеоперационных осложнений с формированием нового, дополнительного неврологического дефицита [3, 4]. Вероятный сценарий развития воспалительной реакции может зависеть как от типа хирургического вмешательства, так и от вида анестезии [5—10]. Молекулярные механизмы действия общих анестетиков, несмотря на их широкое клиническое применение, до сих пор остаются не до конца расшифрованными [11, 12]. Благодаря успешному применению методов молекулярной биологии сделан большой шаг вперед в понимании фармакологии внутривенных анестетиков [13]. При этом действие ингаляционных анестетиков на молекулярном и клеточном уровнях все еще недостаточно изучено.

В этой связи актуальными являются вопросы ранней диагностики развития асептического воспаления и расшифровка молекулярных механизмов его регуляции в условиях нейрохирургического вмешательства при прямом многофакторном воздействии на мозговое вещество. Прояснение этих процессов будет способствовать пониманию возможных механизмов церебропротекции в условиях общей ингаляционной анестезии.

Про- и противовоспалительные цитокины являются общепринятыми маркерами воспалительной реакции. Маркерами повреждения ткани обычно служат белки, специфичные для оперируемого органа. Кроме этого, на самых ранних сроках после повреждения тканей клеточные нуклеиновые кислоты также могут появляться в физиологических жидкостях. Таким образом, эти биомолекулы, присутствующие в физиологических жидкостях, представляют собой дополнительный класс биомаркеров и потенциальных регуляторов патологических процессов. Тканеспецифичность экспрессии и наличие в физиологических жидкостях в стабильной форме делают разные типы микроРНК перспективными диагностическими маркерами [14]. Известно, что уровень микроРНК-21 повышается при травматическом повреждении головного мозга [15]. Циркулирующая ядерная ДНК (яДНК) и в большей степени митохондриальная ДНК (мтДНК) могут выступать в качестве индукторов асептической воспалительной реакции [16, 17]. В частности, известна роль циркулирующей в ликворе мтДНК в активации каскада иммунного ответа при оптикомиелите (болезни Девика) [18].

До настоящего времени неизвестны точные механизмы активации системного воспалительного ответа у пациентов нейрохирургического профиля. Не до конца ясна роль хирургической травмы мозга и действия различных общих анестетиков в процессе активации системного воспаления. В литературе отсутствуют данные о динамике изменения уровней циркулирующих ДНК, микроРНК, а также белковых маркеров повреждения нейроглии и воспалительного ответа в ликворе в ходе нейрохирургической операции у больных с внутричерепными менингиомами в условиях общей анестезии севофлураном.

Цель исследования — оценить нейроповреждение и нейровоспаление, а также диагностический потенциал циркулирующих в ликворе нуклеиновых кислот у пациентов с внутричерепными менингиомами в процессе нейрохирургического вмешательства, выполняемого в условиях общей анестезии севофлураном в сочетании с фентанилом.

В проспективное пилотное обсервационное одноцентровое исследование включены 7 пациентов (2 мужчины и 5 женщин) в возрасте от 42 до 65 лет с внутричерепными менингиомами, оперированные одной нейрохирургической бригадой в период с июня по ноябрь 2017 г. на базе нейрохирургического отделения № 5 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России. Критериями включения в исследование были следующие признаки: 1) наличие внутричерепной менингиомы с гистологическим подтверждением на постоянных препаратах; 2) возраст пациентов от 40 до 65 лет; 3) наличие информированного согласия. Критерии исключения: 1) пациенты, страдающие аутоиммунными, нейродегенеративными заболеваниями, злокачественными новообразованиями; 2) беременные. Общая характеристика пациентов представлена в таблице.

Всех пациентов, при наличии в истории болезни заключения нейрохирургического диагностического комплекса, перед операцией осматривал анестезиолог. Больные с внутричерепной гипертензией в исследуемую группу не входили. Все пациенты оперированы в плановом порядке. Риск анестезии и операции определен как для пациентов с III степенью тяжести состояния по классификации ASA. Хронические заболевания, имевшиеся у некоторых включенных в исследование пациентов, были вне обострения по клиническим и лабораторным данным, представленным в истории болезни. Оперативное вмешательство проводилось на 2—4-е сутки от даты госпитализации. Ни у одного пациента не было послеоперационных осложнений.

Премедикация включала бензодиазепиновый анксиолитик фенорелаксан 1,0 мл внутримышечно вечером накануне операции и утром в день операции. При поступлении в операционную гемодинамический мониторинг включал неинвазивное измерение артериального давления (АД) (систолическое, диастолическое, среднее), частоты сердечных сокращений (ЧСС), уровня насыщения крови кислородом (SpO2) с использованием модульного монитора пациента («Philips» — IntelliVuе» MX 800, «Royal Philips», Нидерланды), а также проводили мониторинг периферической температуры и нейромышечной проводимости (TOF). После установки периферической венозной линии и инфузии 0,9% раствора натрия хлорида в периферическую вену начинали индукцию анестезии севофлураном через маску наркозно-дыхательного аппарата MAQUET FLOW-i (MAQUET, Германия) 8,0 об% до достижения 1 минимальной альвеолярной концентрации (МАК). По достижении 1 МАК внутривенно болюсно вводили фентанил 5,0 мкг на 1 кг массы тела, во всех случаях без использования миорелаксантов при показателях TOF «0» выполняли интубацию трахеи без технических трудностей оротрахеальной методикой. Поддержание анестезии осуществлялось методом низкопоточной ингаляционной анестезии севофлураном 3,6—4,2 об% (1 МАК) в сочетании с микроструйным введением фентанила 2,5—4,0 мкг на 1 кг массы тела в 1 ч. Миорелаксанты не использовались. Анестезиологическая бригада была одна и та же во всех описываемых наблюдениях.

Забор ликвора осуществлялся на следующих этапах:

1) точка 1 (т1) — люмбальный ликвор через 30 мин после вводного наркоза до хирургического разреза;

2) точка 2 (т2) — цистернальный ликвор после вскрытия твердой мозговой оболочки (ТМО) на этапе доступа до начала удаления опухоли (примерно через 40 мин после точки 1);

3) точка 3 (т3) — люмбальный ликвор после удаления опухоли и ушивания раны (примерно через 90 мин после точки 2).

После укладки пациента в соответствующее положение на операционном столе (4 больных оперировали в положении «на боку») лечащий врач-нейрохирург выполнял люмбальную пункцию в асептических условиях в типичном месте. Ни у одного пациента не было ликворного блока. Больных, которых оперировали в положении «на спине» (3 пациента), до начала операции укладывали в положение «на боку» для забора пробы ликвора. В т1 люмбальный ликвор в количестве 2,0 мл получали при истечении его каплями под контролем иглы с мандреном в пробирки с этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА). Далее нейрохирург, выполнявший люмбальную пункцию, устанавливал люмбальный дренажный катетер через просвет иглы для получения пробы ликвора в т3. После окончания операции и забора ликвора в т3 дренажный катетер удалялся в операционной. В т2 собирали центральный цистернальный ликвор, который оператор нейрохирург получал из визуализированных ликворных цистерн в количестве 0,5 мл. Не позднее, чем через 30 мин после получения пробирки с образцами ликвора центрифугировали 2 раза при 1600 g в течение 10 мин. Супернатант после 2-го центрифугирования разделяли на аликвоты по 200 мкл и помещали на хранение при –80 °С. Методика сбора, маркировки, аликвотирования и заморозки образцов ликвора была универсальной для всех клинических наблюдений.

Концентрацию маркера повреждения нейроглии S100B в ликворе определяли иммуноферментным методом на анализаторе планшетного типа Personal Lab («Adaltis», Италия) с помощью набора CanAg S100 EIA («Fujirebio Diagnostics», Швеция) согласно инструкции, прилагаемой производителем. Данный набор позволяет суммарно измерять 2 изоформы белка — S100A1B и S100BB. Диапазон измеряемых концентраций составляет от 50 до 3250 нг/л. Аликвотированные пробы ликвора перед исследованием размораживали в течение ночи в холодильнике.

Концентрацию интерлейкинов IL-6, IL-8, IL-10 и фактора некроза опухоли (TNF-α) в ликворе определяли на иммунохемилюминесцентном анализаторе Immulite 1000 (DPC, США) с помощью наборов производителя («Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd»., (Великобритания) согласно прилагаемым инструкциям. Чувствительность метода для IL-6 и IL-8 составляет 2 пг/мл, для IL-10 — 1 пг/мл, для TNF-α — 1,7 пг/мл. Аликвотированные пробы ликвора перед исследованием размораживали при комнатной температуре.

Перед выделением нуклеиновых кислот размороженную аликвоту ликвора центрифугировали при 3000 g 10 мин. В дальнейшей работе использовали супернатант. Общую ДНК выделяли из 80 мкл ликвора с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit («Qiagen», США), согласно рекомендациям производителя по методике, описанной ранее [19]. В буфер для выделения добавляли синтетическую ДНК (последовательность mw2060) [20] в количестве 10 нг на образец и тРНК E. coli в количестве 1,8 мкг на образец. ДНК снимали с колонки в 100 мкл буфера А.Е. Общую РНК выделяли из 40 мкл ликвора с помощью набора miRNeasy MiniKit («Qiagen», США) согласно рекомендациям производителя. В буфер для выделения добавляли синтетическую РНК (последовательность cel-miR-39), конечная концентрация 5 фМ на образец и тРНК E. coli в количестве 2,7 мкг на образец. РНК снимали с колонки в 100 мкл деионизованной воды, обработанной диэтилпирокарбонатом. Полученные растворы РНК и ДНК хранили при температуре –80 °C.

Анализ уровней ДНК и микроРНК проводили с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Обратную транскрипцию и амплификацию в реальном времени выполняли по описанным ранее методикам [21], используя аппараты Veriti 96-Well Thermal Cycler model 9902 («Life Technologies», США) и 7500 Real-Time PCR System («Life Technologies», США). Детекцию добавочной синтетической РНК последовательности cel-miR-39, а также зрелой микроРНК-21−5p выполняли с помощью наборов гидролизных зондов с праймерами 000200 и 000397 соответственно («Life Technologies», США) и реактива TaqMan Universal PCR Master Mix («Life Technologies», США). В реакцию обратной транскрипции объемом 5 мкл вносили 1,66 мкл раствора РНК. В реакцию амплификации объемом 20 мкл вносили 2,4 мкл продукта обратной транскрипции. Детекцию добавочной синтетической ДНК последовательности mw2060, высококопийного повтора Alu (маркер яДНК) и гена субъединицы цитохромоксидазы 3 (маркер мтДНК) выполняли с помощью праймеров

mw2060_F 5’-GTGCTGACCATCCGAG-3’,

mw2060_R 5’-GCTTGTCCGGTATAACT-3’,

Alu_F 5’-GTGGCTCACGCCTGTAATC-3’,

Alu_R 5’-CAGGCTGGAGTGCAGTGG-3’,

CO3_F5 5’-CTTCTGGCCACAGCACTTAAAC-3’,

CO3_R5: 5’-GCTGGTGTTAGGGTTCTTTGTTTT-3’

и реактива qPCRmix-HS SYBR+ROX master mix («Evrogen», Россия). Препараты ДНК разбавляли в 10 раз водным раствором тРНК E. coli (10 нг/мкл). В реакцию амплификации объемом 25 мкл вносили 5 мкл разбавленного раствора ДНК. Нормализацию циклов квантификации Cq проводили, как описано ранее [22]. Для этого использовали результаты амплификации добавочных синтетических последовательностей cel-miR-39 и mw2060. Относительные количества исследуемых нуклеиновых кислот определяли как 2^{(Cq_max — Cq)}, где Cq — значение цикла квантификации исследуемой мишени в конкретном образце, Cq_max — максимальное значение цикла квантификации исследуемой мишени во всех образцах.

Статистический анализ результатов и визуализацию данных выполняли с помощью программного пакета R версии 3.4.2. Для анализа различий уровней исследуемых мишеней между группами образцов до и после хирургического вмешательства использовали непараметрический парный критерий Вилкоксона. Статистически значимым считали p<0,05.

Для оценки развития повреждения головного мозга и нейровоспалительного ответа в ходе нейрохирургического вмешательства в условиях общей ингаляционной анестезии севофлураном в ликворе определены уровни регуляторов воспалительного ответа: TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, а также маркера повреждения нейроглии S100B [23]. В образцах ликвора, полученных в ходе нейрохирургического вмешательства, не обнаружено статистически значимых изменений уровней S100B (рис. 1, а).

Экспрессирующаяся в клетках мозга микроРНК-21 определялась во всех образцах ликвора как до, так и после удаления опухоли. В ходе нейрохирургического вмешательства не обнаружено статистически значимых изменений уровней микроРНК-21 (р=0,078) (рис. 2, а).

В настоящей работе для количественного измерения уровней циркулирующих нуклеиновых кислот применяли метод ПЦР в реальном времени. Образцы ликвора могут содержать ингибиторы ПЦР. По этой причине перед количественным измерением нуклеиновых кислот требуется проверка наличия ингибирования и при необходимости разбавление образца (в случае высококопийной мишени) или специфичное удаление ингибитора, например, посредством обработки гепариназой [24]. В данной работе, чтобы избежать ингибирования полимераз примесями, ПЦР реакции не перегружали препаратами циркулирующей в ликворе ДНК и РНК. Отсутствие ингибирования контролировали с помощью определения добавочных последовательностей. Подобраны такие разведения выделенных из ликвора ДНК и РНК, при которых добавочные последовательности ДНК (mw2060) и РНК (cel-miR-39) определялись во всех образцах, и разница между максимальным и минимальным значениями циклов квантификации не превышала 2. Результаты амплификации добавочных последовательностей использовали для нормализации результатов амплификации эндогенных циркулирующих нуклеиновых кислот, как это описано в разделе Материал и методы.

Следует отметить, что все пациенты, включенные в данное исследование, имели доброкачественные внутричерепные внемозговые опухоли — менингиомы (Grade I), матрикс которых расположен на твердой мозговой оболочке. По этой причине на этапе хирургического доступа и собственно удаления опухоли макроскопическое хирургическое повреждение головного мозга было минимальным. Поэтому сравнение данных в т2 и т1 фактически позволяет изучать эффект от действия общей анестезии севофлураном, а сравнение в т3 и т2 — эффект от нейрохирургического вмешательства на фоне общей анестезии.

Наблюдаемая в настоящей работе неизменность уровней белка S100B в ликворе свидетельствует об отсутствии значительных повреждений мозгового вещества в результате совместного действия общей анестезии севофлураном и нейрохирургического вмешательства, направленного на удаление менингиом. В образцах ликвора определены яДНК и мтДНК, уровни которых не меняются в ходе операции. Одной из основных причин появления в физиологических жидкостях яДНК является ее выход из погибших клеток. При этом мтДНК может появляться во внеклеточном пространстве также и в результате секреции активированными клетками. Отсутствие значительных повреждений головного мозга может объяснять выявленную неизменность уровней яДНК и мтДНК, а также микроРНК-21.

Полученные данные о повышении уровней провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8 в ликворе указывают на то, что в ходе нейрохирургического вмешательства в условиях общей ингаляционной анестезии севофлураном в сочетании с фентанилом на этапе удаления опухоли происходит запуск провоспалительного звена нейровоспалительного ответа. Поскольку при этом уровни нуклеиновых кислот в ликворе не меняются, можно сделать вывод, что при данном типе операций циркулирующие нуклеиновые кислоты не являются причиной развивающегося воспаления и не могут быть маркером такой реакции. Полученные данные дополняют результаты предыдущих исследований об индукции нейровоспалительного ответа при различных хирургических вмешательствах, включая интракраниальные при лечении назальной ликвореи [6] и при установке люмбального дренажа [25], а также в хирургии костей и суставов [5, 26, 27], аортального клапана [28], хирургии органов малого таза [29]. Описанные в настоящей работе методики могут быть использованы для изучения иммуномодулирующего действия общих анестетиков, а также для определения регуляторной и диагностической роли циркулирующих в ликворе нуклеиновых кислот при развитии воспалительных реакций в ходе различных типов нейрохирургического вмешательства.

В образцах ликвора определены ядерная и митохондриальная ДНК. Уровни ядерной и митохондриальной ДНК, а также биохимического маркера (S100B), характерного для значительных повреждений глиального компонента ткани головного мозга, не меняются в ходе нейрохирургического вмешательства по удалению менингиомы в условиях общей ингаляционной анестезии севофлураном в сочетании с фентанилом. При этом на этапе удаления менингиомы происходит запуск провоспалительного ответа в виде повышения в ликворе уровней цитокинов — интерлейкинов IL-6 и IL-8.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства здравоохранения РФ в рамках государственного задания (проект АААА-А18−118042390102−9).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Кондратов К.А. — https://orcid.org/0000-0002-8302-1186

Федоров А.В. — https://orcid.org/0000-0002-7674-5258

Распутина Д.А. — https://orcid.org/0000-0002-3343-0002

Крупко Т.А. — https://orcid.org/0000-0002-6997-7886

Рутковский Р.В. — https://orcid.org/0000-0002-9208-3741

Дрягина Н.В. — https://orcid.org/0000-0001-8595-6666

Петров А.А. — https://orcid.org/0000-0001-5747-2816

Гуляев Д.А. — https://orcid.org/0000-0002-5509-5612

Костарева А.А. — https://orcid.org/0000-0002-9349-6257

Саввина И.А. — https://orcid.org/ 0000-0001-5655-510X

Автор, ответственный за переписку: Саввина И.А. — e-mail: irinasavvina@mail.ru

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Кондратов К.А., Федоров А.В., Распутина Д.А., Крупко Т.А., Рутковский Р.В., Дрягина Н.В., Петров А.А., Гуляев Д.А., Костарева А.А., Саввина И.А. Влияние нейрохирургического вмешательства и общей анестезии севофлураном в сочетании с фентанилом на содержание биомаркеров воспаления, церебрального повреждения и нуклеиновых кислот в ликворе пациентов с внутричерепными менингиомами: пилотное исследование. Анестезиология и реаниматология. 2019;3:71-78. doi: 10.17116/anaesthesiology201903171