Мерцалова М.П.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России

Пронин И.Н.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России

Захарова Н.Е.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России

Подопригора А.Е.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России

Баталов А.И.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России

Тюрина А.Н.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России

Шульц Е.И.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России

Погосбекян Э.Л.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России

Фадеева Л.М.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России

Голанов А.В.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России

Постнов А.А.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России;
ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ»;
ФГБУН «Физический институт им. П.Н. Лебедева РАН»

Родионов П.В.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России

Измерение внутриклеточного водородного показателя глиобластом: возможности фосфорной магнитно-резонансной спектроскопии

Журнал: Журнал «Вопросы нейрохирургии» имени Н.Н. Бурденко. 2020;84(6): 26‑32

Просмотров : 880

Загрузок : 16

Как цитировать

Мерцалова М.П., Пронин И.Н., Захарова Н.Е., Подопригора А.Е., Баталов А.И., Тюрина А.Н., Шульц Е.И., Погосбекян Э.Л., Фадеева Л.М., Голанов А.В., Постнов А.А., Родионов П.В. Измерение внутриклеточного водородного показателя глиобластом: возможности фосфорной магнитно-резонансной спектроскопии. Журнал «Вопросы нейрохирургии» имени Н.Н. Бурденко. 2020;84(6):26‑32.
Mertsalova MP, Pronin IN, Zakharova NE, Podoprigora AE, Batalov AI, Tyurina AN, Shults EI, Pogosbekyan EL, Fadeeva LM, Golanov AV, Postnov AA, Rodionov PV. Intracellular pH measurement in glioblastoma cells: the possibilities of phosphorus-31 MR spectroscopy. Zhurnal Voprosy Neirokhirurgii Imeni N.N. Burdenko. 2020;84(6):26‑32. (In Russ., In Engl.).
https://doi.org/10.17116/neiro20208406126

Авторы:

Мерцалова М.П.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России

Все авторы (12)

Список сокращений

МРС — магнитно-резонансная спектроскопия

МРТ — магнитно-резонансная томография

PCr — фосфокреатин

Pi — неорганический фосфат

pH — водородный показатель

δPi — химический сдвиг пика неорганического фосфата

В неинвазивной диагностике заболеваний головного мозга наряду со стандартной магнитно-резонансной томографией (МРТ) широко применяются методики мультиядерной магнитно-резонансной спектроскопии (МРС) [1—4], одна из которых — фосфорная МРС — используется для оценки энергетического метаболизма клеток головного мозга. В дополнение к уже известным возможностям этого метода в изучении энергетического профиля клеток фосфорная МРС позволяет измерить внутриклеточный уровень водородного показателя (pH) мозгового вещества in vivo в отличие от большинства методов, основанных на определении pH тканей in vitro [5—7].

Возможность оценки внутриклеточного pH с помощью резонансных частот пиков фосфорных спектров продемонстрирована в 1973 г. в работе R. Moon и J. Richards из Калифорнийского Технологического института [8]. В этой работе авторы представили результаты исследования влияния внутриклеточного pH на резонансные частоты фосфолипидов в фосфорном спектре. Резонансные частоты клеточных фосфолипидов — продуктов энергетического обмена — возрастали с увеличением уровня внутриклеточного pH среды, тогда как резонанс фосфокреатина оставался постоянным.

В 1985 г. O. Petroff и соавт. продолжили исследование зависимости резонансов пиков фосфорного магнитно-резонансного спектра тканей печени и мозга и получили уравнение для вычисления внутриклеточного pH по величине химического сдвига пика неорганического фосфата (Pi) (основной вклад в который вносит магнитно-резонансный сигнал от цитоплазмы) относительно химического сдвига пика фосфокреатина (PCr), которое применяют сейчас в фосфорной МРС для оценки внутриклеточного pH [9].

Внутриклеточный pH является важным физиологическим параметром, который изменяется при различных патологических состояниях мозгового вещества, в том числе при опухолях. Ранее в экспериментальных исследованиях доказано, что внутриклеточный уровень pH опухолей имеет более щелочные значения по сравнению с нормальным мозговым веществом [9—11]. В дальнейшем появились работы по измерению уровня pH с помощью фосфорной МРС в клинических условиях при различной патологии головного мозга — демиелинизирующих процессах, ишемических изменениях, травме, а также при опухолевом поражении [6, 7, 12—14]. Однако полученные результаты при исследовании pH опухолей значительно варьировали.

Цель исследования — изучить возможности измерения внутриклеточного pH с помощью фосфорной МРС в глиобластомах, а также сравнить полученные данные со значениями внутриклеточного pH здоровых добровольцев.

Материал и методы

В исследование включены 10 пациентов в возрасте от 41 года до 67 лет (средний возраст 55,8 года) с первоначальным диагнозом глиобластомы, который в дальнейшем подтвержден гистологически. Перед проведением фосфорной МРС всем пациентам выполнено анатомическое МРТ сканирование по стандартному протоколу. При МРС размеры исследуемого вокселя составили 6×6×2 см. Помимо солидного компонента опухоли в область интереса попали участки некроза, геморрагический компонент, зона отека—инфильтрации, а также неизмененное мозговое вещество. В качестве контрольной группы взяты результаты исследования 23 условно здоровых добровольцев, полученные ранее (И.Н. Пронин и соавт., 2019) [15]. В той же статье подробно описана методика выполнения фосфорной МРС, которую использовали при проведении этого исследования. Обработку спектров проводили с помощью программы SAGE. Расчет внутриклеточного pH опухолевой ткани проводили по формуле, предложенной O. Petroff и соавт., которую использовали в большинстве работ по измерению внутриклеточного pH [7, 9, 12, 14, 15]:

pH=6,77+log [(δPi—3,29)/(5,68—δPi)],

где δPi — химический сдвиг пика Pi относительно пика PCr, который расположен на шкале на уровне 0 ppm. На рис. 1 представлено схематическое изображение определения химического сдвига Pi относительно пика PCr.

Рис. 1. Схематическое изображение фосфорного спектра.

Красная стрелка указывает расстояние между пиком фосфокреатина (PCr) и пиком неорганического фосфата (Pi), являющееся химическим сдвигом неорганического фосфата (δPi) относительно пика PCr. Подставляя полученное значение δPi в специальную формулу, можно получить значение внутриклеточного рН исследуемой ткани.

Статистическая обработка проведена в программе R-project (https://www.r-project.org), для ROC-анализа использовали библиотеку pROC (порог значимости выше 0,7—0,8 рассматривали в качестве порога статистической значимости). Статистическая значимость рассматривалась при пороге значимости p<0,05.

Результаты

При структурной МРТ все глиобластомы имели разнообразную магнитно-резонансную МР картину и различались по ряду признаков, включая наличие кровоизлияния в опухоль, соотношение некротического и тканевого компонентов, выраженность перифокального отека, а также характер контрастного усиления (табл. 1). Все глиобластомы по молекулярно-генетическому статусу имели IDH1 дикий тип. Содержание MGMT в опухоли не оценивали.

Таблица 1. Магнитно-резонансная характеристика глиобластом

Пол

Возраст

Соотношение некротического/солидного компонентов

Кровоизлияние в опухоль

Выраженность перифокального отека

Характер контрастного усиления

рН

1

м

53

Преобладает некроз

Есть

Выраженный

Кольцевидное

7,58

2

м

63

Преобладает некроз

Есть

Нет

Кольцевидное

7,20

3

м

41

Преобладает солидный компонент

Нет

Не выражен

Кольцевидное

7,07

4

м

67

Преобладает солидный компонент

Нет

Нет

Диффузное

7,04

5

м

46

Преобладает некроз

Нет

Минимальный

Кольцевидное

6,96

6

ж

51

Преобладает некроз

Есть

Нет

Кольцевидное

6,98

7

м

63

Преобладает некроз

Нет

Выраженный

Кольцевидное

6,98

8

ж

58

Преобладает некроз

Есть

Минимальный

Кольцевидное

6,98

9

ж

57

Равное соотношение некроза с солидным компонентом

Есть

Выраженный

Кольцевидное

6,89

10

м

59

Преобладает некроз

Нет

Выраженный

Кольцевидное

6,78

Во всех исследованиях получен фосфорный спектр, в котором четко определялись пики PCr и Pi, необходимые для вычисления уровня pH, а также остальные пики основных фосфоросодержащих метаболитов, результаты обработки которых не вошли в данное исследование. Вычисление внутриклеточного уровня pH проведено на основе представленной выше формулы. В табл. 2 приведены средние значения внутриклеточного pH глиобластомы и здорового мозгового вещества. Фосфорный спектр глиобластомы показан на рис. 2.

Таблица 2. Среднее значение внутриклеточного pH ткани глиобластом и здоровой мозговой ткани по данным магнитно-резонансной спектроскопии

Группы

Среднее значение рН

Контрольная группа

6,943±0,044

Группа с глиобластомами

7,047±0,21

Рис. 2. Фосфорный спектр глиобластомы.

Самый высокий пик спектра, соответствующий значению 0 ppm на шкале химического сдвига, относится к фосфокреатину. Три пика спектра, распложенные в отрицательной зоне шкалы, соответствуют АТФ. В положительной зоне спектра расположены пики неорганического фосфата (ближний к фосфокреатину), далее — пики фосфодиэфиров и фосфомоноэфиров.

В нашем исследовании у пациентов в глиобластомах среднее значение pH составило 7,047±0,21, а в мозговом веществе здоровых добровольцев — 6,943±0,044. У исследуемых с глиобластомами стандартное отклонение было в несколько раз выше по сравнению со стандартным отклонением pH у добровольцев контрольной группы. Полученные значения pH глиобластом находились в диапазоне от 6,787 до 7,58. В 4 случаях в глиобластомах выявлен более высокий уровень pH по сравнению со здоровой тканью мозга. В 2 случаях значения pH были ниже, чем в здоровом веществе мозга. На рис. 3 представлена глиобластома с максимальным значением уровня pH — 7,58. В проведенном нами ROC-анализе и при обработке данных с применением теста Манна—Уитни статистически значимого различия уровня pH глиобластом с уровнем pH здорового мозгового вещества не было.

Рис. 3. Глиобластома правой теменной доли.

Магнитно-резонансная томография в режиме Т2 (а) и Т1 после контрастного усиления (б) демонстрирует гетерогенное строение внутримозговой опухоли с кольцевидным типом контрастного усиления.

Обсуждение

В нашем исследовании мы получили более щелочные значения pH глиобластом по сравнению с pH здорового мозгового вещества, однако из-за большого разброса значений pH глиобластом статистически значимого различия между показателями этих двух групп не получено. Такое разнообразие значений pH среди опухолей, вероятно, обусловлено выраженной структурной неоднородностью глиобластомы, в которой присутствует большое количество некротических и геморрагических компонентов в сочетании с особенностью методики, заключающейся в исследовании большого объема ткани. Помимо солидного компонента опухоли в исследуемый воксель неизбежно попадают участки некроза, кровоизлияний, нормальная паренхима мозга, область отека и др., что в результате приводит к искажению истинного значения внутриклеточного pH опухолевых клеток.

В других работах по оценке pH глиобластом также определялась тенденция к изменению уровня pH в сторону щелочных значений. Например, в исследовании D. Maintz и соавт. получен уровень pH 7,12±0,02 (контрольные значения pH 7,04±0,01) [12]. В другом исследовании K. Wenger и соавт. измеряли pH in vivo пациентам с первичной глиобластомой до и после проведения антиангиогенной терапии. В их исследовании среднее значение уровня pH глиобластом до лечения составило 7,11±0,053, и статистически значимо отличалось от значений контрольной группы (7,017±0,026) [14]. Следует отметить, что исследование K. Wenger и соавт. выполнено с применением мультивоксельной технологии.

Изменение уровня pH в сторону щелочных значений имеет биохимическое объяснение. Считается, что злокачественные опухоли, такие как глиобластомы, характеризуются высоким по сравнению с нормальным мозговым веществом уровнем анаэробного гликолиза [16], так как в процессе своей жизнедеятельности преобразуют глюкозу в пировиноградную кислоту, а затем в лактат, как при отсутствии кислорода (анаэробный гликолиз с последующим молочнокислым брожением), так и при его наличии в клетке (так называемый Warburg-эффект) [17]. В ходе этого процесса кроме извлечения энергии опухолевые клетки также снижают pH внеклеточной среды за счет активного транспорта протонов (Н+) и лактата во внеклеточное пространство [18]. При проведении некоторыми исследователями измерений внеклеточного pH in vivo продемонстрировано, что микроокружение солидных опухолей является более кислым, чем микроокружение нормально дифференцированных клеток [10, 19, 20]. Кислая внешняя среда, не являясь вредной для самих опухолевых клеток, способствует повышению пролиферативной активности, более высокой инвазии опухолевых клеток, а также усиливает опухолевый неоангиогенез [21—23]. При этом транзиторное повышение внутриклеточного pH активирует некоторые механизмы, усиливающие клеточную пролиферацию, а также ингибирующие клеточный апоптоз, что способствует более высокой выживаемости патологических клеток в агрессивной для них среде [23—25]. Таким образом, характерными особенностями опухолевого роста являются повышение скорости гликолиза, а также изменения в работе ионных насосов и транспортных белков плазматической мембраны, которые осуществляют экспорт протонов и лактата во внеклеточное пространство. Это позволяет опухолевым клеткам поддерживать более высокий внутриклеточный уровень pH, усиливающий их пролиферативную активность и способность к инвазии [24, 25].

Такие особенности соотношения pH внутри- и внеклеточной среды стали основой для изучения эффективности некоторых химиотерапевтических препаратов [26]. В исследованиях N. Raghunand и соавт. на опухолях мышей in vivo показано, что индуцированное повышение внеклеточного pH в опухоли приводило к усилению цитотоксической активности химиотерапевтических препаратов [27, 28]. В нашем исследовании уровень pH одной из глиобластом имел очень высокое значение — 7,58. Такая информация может в дальнейшем лечь в основу клинических исследований с целью изучения эффективности применяемых химиотерапевтических препаратов в опухолях с различными кислотно-щелочными характеристиками.

Наряду с фосфорной МРС существуют и другие способы измерения внутриклеточного pH in vivo [29]. Среди этих методов следует отметить недавно появившийся метод амидно-протонного трансфера (APT-CEST), который использует pH-зависимую скорость обмена амидных или аминных протонов с водой для контраста и обладает достаточно хорошим пространственным разрешением [30, 31]. Недостатками такого метода являются двухмерность полученных данных, а также выраженные технические артефакты, искажающие точность исследований.

Заключение

Фосфорная магнитно-резонансная спектроскопия является развивающимся методом измерения внутриклеточного pH мозгового вещества in vivo, исследование которого в глиобластомах показало тенденцию к защелачиванию внутриклеточной составляющей опухолей. Такой метод имеет как преимущества, так и недостатки, в основном связанные с большим объемом исследуемого вокселя. Техническое усовершенствование методики в виде применения мультивоксельной технологии, высокопольного томографа и многоканальной фосфорной катушки повысит точность измерения внутриклеточного pH, увеличив пространственное разрешение. Изменение внутриклеточного pH мозгового вещества в дальнейшем может быть использовано в качестве потенциального маркера ранних патологических изменений, не визуализируемых при стандартном магнитно-резонансном томографическом исследовании, а также в оценке эффективности противоопухолевой терапии. Механизмы, приводящие к вариациям значений pH в различных по структуре опухолях, остаются неясными и должны быть изучены в дальнейшем.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Пронин И.Н., Мерцалова М.П.

Сбор и обработка материала — Мерцалова М.П., Шульц Е.И., Баталов А.И., Тюрина А.Н., Родионов П.В.

Статистический анализ данных — Фадеева Л.М., Погосбекян Э.Л.

Написание текста — Мерцалова М.П.

Редактирование — Пронин И.Н., Захарова Н.Е., Подопригора А.Е., Голанов А.В., Постнов А.А.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ №18-15-00337.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.


Комментарий

Работа посвящена применению метода фосфорной магнитно-резонансной спектроскопии (31Р-МРС) для изучения внутриклеточного pH глиобластомы и сравнению полученных данных со значениями pH мозгового вещества здоровых добровольцев. Метод фосфорной спектроскопии позволяет визуализировать основные фосфорсодержащие метаболиты, присутствующие в клетке, с помощью которых можно изучить энергетических профиль патологической ткани, а также измерить уровень ее внутриклеточного pH. Другими словами, 31Р-МРС позволяет неинвазивно получать важную информацию об изменениях в фундаментальных клеточных процессах при различной патологии головного мозга, в том числе при злокачественных опухолях головного мозга, наиболее агрессивной из которых является глиобластома. С помощью фосфорного спектра можно вычислить значения внутриклеточного pH опухоли, вариация значений которого отражает степень метаболических нарушений клеток, что может служить маркером ответа опухоли на проводимое химио/лучевое лечение.

При сопоставлении уровня внутриклеточного pH в глиобластомах со значениями pH тканей мозга здоровых добровольцев выявлена тенденция к увеличению уровня внутриклеточного pH в опухолях по сравнению с уровнем pH здоровых тканей.

Результаты исследования для определения воспроизводимости сопоставлялись с данными других авторов. Полученные значения pH не противоречат измерениям, выполненным другими авторами.

На основании проведенных исследований авторы показали, что данная методика в дальнейшем может быть использована в качестве потенциального маркера ранних патологических изменений, не визуализируемых при стандартном магнитно-резонансном томографическом исследовании, а также в оценке эффективности противоопухолевой терапии.

А.Х. Бекяшев (Москва)

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail