Одной из важнейших медико-социальных проблем является высокая распространенность цереброваскулярных заболеваний — ведущей причины снижения качества жизни и потери трудоспособности. В России распространенность различных форм цереброваскулярных заболеваний составляет около 20% среди лиц трудоспособного возраста. Число пациентов, страдающих хроническими нарушениями мозгового кровообращения (ХНМК), в России составляет не менее 700 на 100 тыс. населения. ХНМК характеризуются диффузной и постепенно прогрессирующей недостаточностью кровоснабжения головного мозга (ГМ), которая проявляется комплексом неврологических, прежде всего когнитивных расстройств, которые могут достигать степени тяжелой деменции. ХНМК также являются фактором риска развития острых нарушений мозгового кровообращения. Ключевые задачи терапии таких пациентов сводятся к предупреждению прогрессирования стенозирующего поражения церебральных артерий, улучшению микроциркуляции, нормализации углеводного и липидного обмена, коррекции формирующихся нарушений [1—3].

В настоящее время количество препаратов с нейропротективными свойствами велико, однако все они не лишены недостатков, поэтому разработка новых препаратов для профилактики и лечения цереброваскулярных заболеваний актуальна. Наиболее перспективными в этом отношении являются препараты с мультимодальным механизмом действия. С этой точки зрения особый интерес вызывают эндотелиопротекторы, обеспечивающие улучшение церебральной перфузии и восстановление метаболических процессов в ГМ, способные повлиять на патогенез ХНМК [1, 2, 4].

Цитиколин, являясь предшественником ацетилхолина, усиливает его синтез и высвобождение, вследствие чего возрастает активность холинергической нейротрансмиссии, также он обладает мембрано- и эндотелиопротективными свойствами [5]. Цитиколин рассматривается как перспективное средство для лечения пациентов в остром периоде ишемического инсульта. Ницерголин является α₁-адреноблокатором, повышает региональный мозговой кровоток с последующей активацией метаболических процессов в ткани ГМ. Препарат применяется при деменциях различного генеза, после перенесенных транзиторных ишемических атак и при инсульте, постинсультных нарушениях [4, 6]. Унифузол является разработкой российской компании ООО «НТФФ «ПОЛИСАН» (Санкт-Петербург), представляет собой раствор для внутривенного введения, в состав которого входят аргинина натрия сукцинат (14,0 г), янтарная кислота (5,28 г), L-аргинин (7,80 г) и вода для инъекций (до 1,0 л). Поскольку в ранее проведенных исследованиях он проявил эндотелиопротективный, антигипертензивный, вазодилатирующий эффекты [7, 8], представляются перспективными изучение его влияния на поведенческие и когнитивные нарушения (КН) и оценка морфологических изменений ткани головного мозга в условиях экспериментальной модели ХНМК.

Цель исследования — изучить влияние препарата Унифузол на тяжесть КН, состояние мозгового кровотока и выраженность повреждения гиппокампа и коры ГМ при 10-дневном введении крысам с ХНМК, вызванным двусторонним стенозом общих сонных артерий (ОСА).

Материал и методы

Эксперимент был проведен на 6—8-месячных самцах крыс линии Wistar (n=164), которых содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране используемых в научных целях животных. Дизайн исследования одобрен Региональным независимым Этическим комитетом, регистрационный номер: ИРБ 00005839 IORG 0004900 (выписка из протокола №003 от 28 февраля 2020 г.).

У животных создавали модель ХНМК стенозированием ОСА на 60%, сужая просвет лигатурами под контролем лазерной допплерографии (полиграф MP150 с модулем LDF100C, «Biopac Systems», США). Наркоз обеспечивали внутрибрюшинным введением смеси золетил/ксилазин в дозе 20/8 мг/кг [9].

Исследование проводили на 20 интактных животных и 20 животных, которым провели ложную операцию (ЛО), а также на 124 крысах, которым просвет ОСА суживали на 60% (по 20 животных в каждой опытной группе и 24 — в группе плацебо) и в последующем вводили различные лекарственные препараты (опытные группы). Через 40 дней после операции животных разделили на равные группы и курсом в 10 дней с использованием шприцевого инфузионного насоса SN-50C6T («SinoMDT», Китай) и рестрейнеров в/в со скоростью 0,5—1 мл/мин ежедневно вводили один из нижеперечисленных препаратов: Унифузол в дозах 21, 42 и 84 мл/кг (дозу 84 мл/кг/сут вводили дробно — по 42 мл/кг с интервалом 6 ч); цераксон (Ceraxon, «Феррер Интернасьональ», С.А., Испания) в дозе 500 мг/кг; ницерголин (ООО Фирма «Фермент», Россия) в дозе 10 мг/кг; 0,9% натрия хлорид (плацебо) в дозе 42 мл/кг. Эксперимент состоял из 3 этапов: на 1-м оценивали состояние животных до моделирования ХНМК, 2-й проводили через 40 дней после операции, 3-й — после 10 дней введения препаратов.

О влиянии операционных манипуляций на фиксируемые показатели судили по разнице показателей интактной группы и группы ЛО. О тяжести психоневрологического дефицита судили по разнице показателей между группами плацебо и ЛО. Выраженность терапевтического эффекта оценивали на основании вычисления разницы показателей между группой плацебо и опытными группами.

Двигательную и исследовательскую активность животных оценивали в тесте Открытое поле (ОП). В течение 3 мин после помещения животного в установку при помощи счетчика фиксировали количество пересеченных квадратов — показатель двигательной активности. Также подсчитывали количество актов стоек и обследованных отверстий-норок, их сумма использовалась как показатель исследовательской активности [10]. Обучаемость и сохранение долговременной пространственной памяти на этапе 3 оценивали в тесте Водный лабиринт Морриса (ВЛМ): в течение 4 дней (по 4 попытки в день) животных обучали поиску затопленной платформы по ориентирам на стенке установки, помещая животное в разные исходные точки относительно платформы. На 5-й день платформу убирали и регистрировали время поиска места ее локализации в ходе проведения единственной тестовой сессии [11]. Тест Распознавания новых объектов (РНО) основан на естественной потребности животных исследовать новые объекты и не требует наличия внешней мотивации, награды или наказания, используется для оценки когнитивных функций (способности выявлять информацию и сопоставлять ее с хранящейся в кратковременной памяти) и был выполнен в 2 этапа: ознакомление с 2 одинаковыми объектами (А1 и А2) — 3 мин; предъявление нового объекта Б1 и копии старого (АЗ) через 60 мин после ознакомления — 3 мин в домашней клетке (545×395×200 мм). По результатам теста рассчитывали индекс дискриминации (ИД) — время, затраченное на изучение нового объекта минус время, затраченное на изучение старого объекта во второй посадке (ИД = tB1 — tA3) [12].

Скорость кровотока по средней мозговой артерии (СМА) определяли методом ультразвуковой допплерографии (Минимакс-Допплер-К, ООО «СП Минимакс», Россия). Датчик устанавливали в стереотаксической установке, скорость кровотока регистрировали в проекции СМА, доступ к которой осуществляли следующим способом: у наркотизированных (хлоралгидрат 400 мг/кг) животных удаляли шерстяной покров верхней поверхности черепа, которая впоследствии скальпировалась над местом предполагаемого трепанационного отверстия. Далее по стереотаксическим координатам, началом которых принимали точку bregma, определяли место трепанационного отверстия, которое создавали стоматологическим трепаном [13].

Выраженность повреждения тканей ГМ оценивали по результатам морфометрических исследований. Морфометрию тканей ГМ проводили при окрашивании срезов по Нисслю. Микрофотосъемку гистологических препаратов проводили на микроскопе Micros (Австрия) цифровой фотокамерой Olympus (Япония). Степень поражения различных структур головного мозга (моторная и соматосенсорная кора, зоны CA1, CA3 и CA4 гиппокампа) определяли по доле клеток, которые были отнесены к одному из следующих типов: нейроны нормальные, неизмененные; слабоизмененные нейроны с сохранением ядра, но со структурными или тинкториальными нарушениями компонентов цитоплазмы (набухание, гиперхроматоз, хроматолиз, центральная тинкториалъная ацидофилия); грубо измененные нейроны (выраженное сморщивание, гомогенизирующее изменение нейронов, клетки-тени).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программного пакета Prism 6 («GraphPad Software Inc.», США). Проверку данных на нормальность осуществляли с использованием критерия Шапиро—Уилка, для сравнения групп применяли однофакторный дисперсионный анализ (One-Way ANOVA) и t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. Данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (M±m).

Результаты

Оценка формирования и воспроизведения памятного следа в тесте ВЛМ показала, что животные с ХНМК, которым вводили плацебо, значимо дольше искали затопленную платформу по сравнению с группой интактных крыс (рис. 1, а). В группах животных, получавших Унифузол в дозе 84 л/кг, ницерголин и цитиколин, время поиска платформы статистически значимо сократилось на 41,8, 37,7 и 58,3% соответственно по сравнению с группой, получавшей плацебо (рис. 1, а). Было установлено дозозависимое положительное влияние курсового введения препарата Унифузол, эффект которого при введении в дозе 84 мл/кг был сопоставим с влиянием ницерголина и цитиколина на долговременную память — воспроизведение памятного следа в тесте ВЛМ.

Рис. 1. Значения времени поиска затопленной платформы в ВЛМ (а) и ИД в тесте РНО (б).

Здесь и на рис. 2: * — различия статистически значимы в сравнении с группой плацебо при p<0,05; t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони.

В результате проведения теста РНО было отмечено практически четырехкратное снижение ИД в группе плацебо по сравнению с интактными животными. В группах, которым проводилось лечение Унифузолом в дозе 84 мл/кг, отмечен сопоставимый с таковым при введении ницерголина и цитиколина эффект, выражавшийся в статистически достоверном увеличении ИД (рис. 1, б), что свидетельствует об улучшении когнитивных функции на фоне лечения.

При проведении теста ОП через 10 дней после начала терапии в группе плацебо двигательная и исследовательская активность была значимо ниже, чем у интактных животных (p=0,0027 и p<0,0001 соответственно): крысы не обследовали арену полностью, редко совершали поведенческие акты, свидетельствующие о выраженности исследовательской активности.

В группах животных, которым вводили Унифузол в дозах 42 мл/кг и в большей степени, 84 мл/кг, были значительно выше двигательная (p=0,0397 и 0,0473 соответственно) и исследовательская (p=0,0474 и 0,0110 соответственно) формы активности. Отмеченная активность препарата Унифузол была сопоставима с таковой у ницерголина и незначительно уступала цитиколину (рис. 2).

Рис. 2. Результаты оценки двигательной (а) и исследовательской (б) активности в тесте ОП (M±m).

Степень стенозирования ОСА выбирали таким образом, чтобы уровень кровотока по ним был снижен на 55—60% (рис. 3) и во всех экспериментальных группах животных кровоток по сонным артериям до и после операции был на сопоставимом уровне. Снижение кровотока по ОСА на 55—60% приводило к выраженному (на 40—45%) снижению перфузии мозговой ткани в бассейне левой средней мозговой артерии (рис. 4, а, б), которая увеличивалась на 10—15% через 40 дней (рис. 4, в). В группах животных, получавших Унифузол в дозах 42 и 84 мл/кг, а также ницерголин, уровень мозгового кровотока в бассейне левой средней мозговой артерии был значительно выше по сравнению с группой плацебо, скорость кровотока в которой за 10 дней не изменилась (рис. 4, г). В группах, получавших Унифузол в дозе 21 мг/кг и цитиколин, кровоток был статистически незначимо выше, чем в группе плацебо. Таким образом, курсовое введение препарата Унифузол (42 и 84 мл/кг) животным с 40-дневной гипоперфузией способствовало значимому повышению мозгового кровотока.

Рис. 3. Показатели скорости кровотока по ОСА до (а и в соответственно для левой и правой ОСА) и после (б и г соответственно для левой и правой ОСА) моделирования стеноза (M±m).

Здесь и на рис. 4: ^# — различия статистически значимы в сравнении с группой «ЛО» при p<0,05; t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони.

Рис. 4. Показатели кровотока в бассейне средней мозговой артерии до (а) и после (б) моделирования стеноза ОСА, через 40 дней (до лечения) (в), и после 10 дней лечения (г) (M±m).

В группе ЛО отмечено отсутствие значимых морфологических различий по сравнению с интактными животными. В структурах дорсального и вентрального гиппокампа нейроны пирамидального слоя CA1 располагались компактно, а в CA3 — более дисперсно. В моторной и соматосенсорной областях коры преобладали нейроны без видимых дистрофических изменений. В группе плацебо стойкие структурные изменения были выявлены у 80% экспериментальных животных — в вентральных и дорсальных отделах гиппокампа значимые морфологические изменения отсутствовали, в то время как в моторной и соматосенсорной областях церебральной коры — носили достаточно выраженный характер. Нейродегенеративные изменения наблюдались преимущественно в крупных клетках ганглионарного слоя V. У отдельных животных в патологический процесс вовлекались нейроны пирамидного (III) и внутреннего зернистого (IV) слоев. Отмечалось набухание тел клеток с вакуолизацией цитоплазмы либо пикнотические изменения нейронов с уменьшением объема и формы тел клеток и усилением базофилии цитоплазмы и ядра. Относительная плотность умеренно поврежденных нейронов составила 21,90±2,80% в моторной и 16,37±3,41% в соматосенсорной областях коры. Кроме того, в ганглионарном слое различных отделов неокортекса обнаруживались клетки с выраженной гиперхромией и гомогенизацией цитоплазмы. В моторной области насчитывалось 22,35±4,38% таких клеток, в соматосенсорной — 12,49±2,92%.

В группе, получавшей ницерголин, морфологические изменения пирамидальных клеток CA1 и CA3 вентрального и дорсального гиппокампа существенно не отличались от таковых у животных с контрольным стенозом ОСА. В моторных областях церебральной коры наблюдались очаговые изменения в виде гиперхромии цитоплазмы нейронов и клеток глии. Данные процессы носили очаговый характер и фиксировались преимущественно в ганглионарном слое (V) церебральной коры. Морфометрический анализ выявил достоверное снижение относительной плотности умеренно и грубо измененных нейронов ганглионарного слоя по сравнению с группой плацебо. В соматосенсорной области коры, как и в моторной, наибольшее количество дистрофически измененных нейронов выявлялось в V слое. Обнаружено достоверное снижение численной плотности грубо поврежденных нейронов в ганглионарном слое коры на фоне лечения ницерголином (4,05±1,71%), по сравнению с плацебо (12,49±2,92%).

Применение цитиколина не приводило к коррекции морфологических изменений структур лимбической системы по сравнению с группой плацебо. В коре изменения носили как слабый, так и выраженный характер и проявлялись прежде всего в увеличении количества гиперхромных нейронов с усиленной базофилией цитоплазмы, в которой четко определялись ядро и структуры цитоплазмы. Их тела угловатой или полигональной формы были окружены ободком светлого пространства (перицеллюлярный отек). Изменения носили ограниченный характер и вовлекали преимущественно нейроны V слоя. При сравнении с группой экспериментальной хронической ишемии без фармакологической коррекции применение цитиколина приводило к статистически значимому снижению относительной плотности слабо и грубо поврежденных нейронов ганглионарного слоя моторной коры (10,31±3,78 и 9,96±3,69% соответственно). В соматосенсорной коре также отмечалась тенденция к снижению количества дистрофически измененных нейронов без статистической достоверности.

У животных, получавших Унифузол (21 мл/кг), в структурах лимбической системы наблюдались легкие патоморфологические изменения. При изучении различных функциональных отделов церебральной коры было выявлено, что 13,13±3,9% нейронов ганглионарного слоя моторной области характеризовались умеренными морфологическими изменениями. Клетки приобретали слегка вытянутую или полигональную форму. Пикноморфные ядра визуализировались на фоне слабобазофильной цитоплазмы. Грубо измененные нейроны составили 8,80±3,29%. Оба показателя были достоверно ниже по сравнению с группой плацебо. В V слое соматосенсорной коры также встречались сморщенные, гиперхромные клетки, относительная плотность которых составляла 26,88±6,70%. В то же время в группе плацебо данный показатель достигал 28,79±5,01%. Поэтому можно говорить о том, что терапия Унифузолом в дозировке 21 мл/кг приводила к уменьшению нейродегенеративных изменений только в моторных отделах коры.

При морфологическом исследовании структур лимбической системы головного мозга животных, которые получали Унифузол в дозе 42 мл/кг, структурные изменения существенно не отличались от таковых в группе плацебо. На препаратах моторной и соматосенсорной областей коры, окрашенных по методу Ниссля, во всех слоях преобладали нормохромные клетки симметричной формы с равномерно распределенной хроматофильной субстанцией в цитоплазме, наблюдались преимущественно сморщивание и гиперхромия отдельных клеток ганглионарного слоя коры головного мозга. В моторной области коры статистически значимо снижалась относительная плотность умеренно поврежденных нейронов до 15,03±5,81%, по сравнению с группой плацебо (44,25±6,02%). В соматосенсорной коре достоверно уменьшалось количество только грубо измененных нейронов (6,28±1,67%).

У животных, получавших Унифузол в дозе 84 мл/кг, в CA1 дорсальных отделах гиппокампа пирамидные клетки характеризовались отсутствием выраженных гистологических изменений. В вентральных отделах обнаруживались отдельные пикноморфные нейроны, отличающиеся умеренной гиперхромией цитоплазмы, без существенных изменений ядерного аппарата. В CA3 увеличивалось количество пирамидальных нейронов со слабыми гиперхромными изменениями, статистически значимые отличия от группы плацебо отсутствовали. В коре изменения фиксировались в моторных отделах и проявлялись наличием участков ганглионарного слоя, характеризующегося умеренным сморщиванием нейронов и наличием гиперхроматоза (6,49±2,03%). В некоторых нейронах глыбки тигроида сливались, в результате чего клетки приобретали вид интенсивно окрашенных узких, угловатых образований. Количество таких нейронов составляло 8,86±3,21%. Таким образом, общая площадь поврежденных нейронов была статистически значимо ниже, чем в группе плацебо.

Обсуждение

Таким образом, в представленной серии экспериментов по моделированию ХНМК у крыс путем стенозирования ОСА в структурах лимбической системы (CA1 и CA3 поля дорсального и вентрального гиппокампа) патоморфологические изменения характеризовались крайне слабыми пикноморфными изменениями единичных клеток пирамидальных нейронов. В моторных и соматосенсорных отделах коры морфологические изменения носили как умеренный, так и выраженный характер и в большинстве случаев сводились к гиперхромии цитоплазмы и отростков, изменению формы перикарионов и усилению базофилии ядер нейронов пирамидного слоя. Иногда выявлялись гидропические изменения с появлением единичных цитоплазматических вакуолей.

Коррекция ХНМК различными фармакологическими препаратами не приводила к каким-либо значимым улучшениям в характере морфологических изменений различных структур лимбической системы, что закономерно, поскольку в данной серии экспериментов 40-дневный двусторонний стеноз ОСА практически никак не сказался на гистоархитектонике различных отделов гиппокампа. Иная картина наблюдалась при изучении динамики морфологических изменений функциональных отделов коры головного мозга, где все без исключения препараты продемонстрировали определенную эффективность в снижении выраженности дистрофических процессов в моторных отделах церебральной коры.

Фармакологическая коррекция ницерголином и цитиколином приводила к достоверному снижению нейродегенеративных изменений в моторной области церебральной коры. В соматосенсорной области коры количество поврежденных клеток также уменьшалось, однако статистически значимое снижение количества грубо поврежденных нейронов наблюдалось только при применении ницерголина.

При изучении эффективности экспериментального препарата Унифузол выявлялась дозозависимая вариабельность патоморфологических изменений в различных отделах неокортекса. Введение препарата в дозе 21 мл/кг оказывало протективный эффект только в отношении моторных отделов церебральной коры. Применение Унифузола в дозе 42 мл/кг приводило к значимому снижению плотности поврежденных нейронов не только в моторной, но и в соматосенсорной области коры. Еще бóльшее увеличение дозировки (до 84 мг/кг) не приводило к дальнейшему снижению плотности слабо и умерено поврежденных нейронов коры. По результатам морфологического исследования (рис. 5) можно сделать вывод, что наиболее значимое нейропротективное действие оказывали ницерголин и Унифузол (в дозе 42 мл/кг).

Рис. 5. Морфологическая характеристика нейродегенеративных изменений нейронов пирамидального слоя различных функциональных отделов коры головного мозга — моторной (а), соматосенсорной (б) и областей гиппокампа (CA1 (в) CA3+CA4 (г)) (M±m%).

* — различия статистически значимы в сравнении с группой «ХНМК+Плацебо» при p<0,05; НН — нормальные нейроны; СН — слабоизмененные нейроны; ГН — грубо измененные нейроны.

Заключение

Острые и хронические нарушения мозгового кровообращения являются одной из наиболее распространенных причин смертности и инвалидизации в мире. Результаты исследований в области цереброваскулярной патологии показывают, что хронические формы недостаточности мозгового кровообращения осложняются развитием острого его варианта (инсульт), а пациентам, перенесшим инсульт, в последующем постоянно требуются проведение фармакотерапии нарушенной мозговой гемодинамики и коррекция когнитивных расстройств. Ключевым фактором в патогенезе инсульта является снижение кровотока, которое можно использовать в качестве фармакологической мишени для нейропротективных препаратов. Одним из них является Унифузол (L-аргинина натрия сукцинат), поскольку после курсового введения он дозозависимо увеличивает мозговой кровоток на сопоставимом уровне с ницерголином, превышая по данной активности цитиколин. Улучшение мозгового кровотока на фоне введения Унифузола сопровождалось улучшением состояния когнитивных функций: улучшением кратковременной и долговременной памяти. Эффект Унифузола был наиболее выражен при его применении в дозах 42 и 84 мл/кг и оказался сопоставим с таковым у ницерголина (10 мг/кг) и цитиколина (500 мг/кг).

Таким образом, курсовое введение экспериментальным животным со стенозом ОСА препарата Унифузол улучшает микроциркуляцию тканей головного мозга сопоставимо с препаратом ницерголин. Курсовое введение Унифузола в дозах 42 и 84 мл/кг сопоставимо с референтными препаратами ницерголин и цитиколин снижает выраженность когнитивных нарушений у животных с ХНМК. Применение Унифузола в дозе 21 мл/кг оказывает протективный эффект в моторных отделах церебральной коры. В дозе 42 мл/кг приводит к снижению численной плотности поврежденных нейронов в моторной и соматосенсорной областях коры. При увеличении дозы Унифузола до 84 мг/кг усиления эффекта не наблюдается.

Исследование выполнено при финансовой поддержке ООО «НТФФ «ПОЛИСАН», Россия.

The study was carried out with the financial support of LLC «NTFF «POLISAN», Russia.