В фармакопее для любого препарата выделяется некоторое «основное» действие (например, ингибирование того или иного белка) и ряд «побочных» эффектов. Обычно при регистрации лекарственного препарата используется ограниченный перечень стандартных тестов и поэтому большинство других эффектов препарата остается неизученным. Недостаточность информации об основном и побочных эффектах препарата существенно осложняет возможности планирования и априорной оценки эффективности комбинированной терапии нейропротективными и ноотропными средствами (пирацетамом, винпоцетином, циннаризином и др.).
Винпоцетин — алкалоид барвинка, оказывающий противовоспалительное и антиатеросклеротическое действие [1]. В первичных эндотелиальных клетках капилляров головного мозга, стимулированных пуринергическими рецепторами, винпоцетин ингибировал отток кальция из митохондрий, подавлял продукцию H2O2 в митохондриях, уменьшал Ca2+-индуцированное набухание митохондрий, что важно для реализации противоишемического эффекта [2]. Ингибируя активность ФНО-α, винпоцетин противодействует атеросклеротическому процессу и гиперплазии интимы в модели аневризмы брюшной аорты у мышей линии C57BL/6J [3].
Пирацетам облегчает различные типы синаптической передачи сигналов, увеличивая плотность и активность постсинаптических холинергических и серотонинергических рецепторов, улучшает микроциркуляцию, способствует нейрональной пластичности. Пирацетам характеризуется очень низкой токсичностью (LD50=10,6 г/кг в/в для крыс) [4]. Пирацетам повышает концентрацию внимания, улучшает когнитивные функции (способность к обучению, память, внимание и сознание), не оказывая седативного или психостимулирующего воздействия [5]. Применение пирацетама сопровождается достоверными положительными изменениями на электроэнцефалограмме (ЭЭГ) (повышение α- и β-активности, снижение δ-активности). Пирацетам способствует уменьшению проявлений гипоксии мозга [6] и регрессии признаков сердечной недостаточности [7]. В многоцентровом исследовании пирацетама у 90% пациентов отмечены положительные эффекты применения препарата и только у 7% участников — нежелательное побочное действие [8].
Циннаризин — производное пиперазина, относится к группе блокаторов кальциевых каналов и характеризуется антигистаминным, антисеротонинергическим, антидофаминергическим действием. Циннаризин используется для лечения тошноты, укачивания, головокружения [9]. Такие осложнения при приеме циннаризина, как экстрапирамидные расстройства, существенно ограничивают его применение. Одним из наиболее известных нежелательных побочных эффектов циннаризина принято считать способность усугублять проявления паркинсонизма вследствие антагонизма D2-дофаминовых рецепторов (при назначении доз выше 150 мг/сут при терапевтической дозе порядка 75 мг) [10—12].
Хемоинформационный анализ молекул на основе машинного обучения предоставляет уникальную возможность сравнительного исследования эффектов различных молекул на реактом — совокупность химических реакций организма. В основе данного подхода — сравнение химической структуры молекулы с сотнями тысяч других молекул, для которых были изучены молекулярно-фармакологические свойства. В частности, хемореактомная технология позволяет оценить перспективы комбинирования различных ноотропных/нейропротективных препаратов.
Материал и методы
В настоящей работе представлены результаты сравнительного хемореактомного анализа синергизма комбинации «винпоцетин+пирацетам» (препарат Винпотропил) и комбинации «пирацетам+циннаризин». Сравнение и оценка свойств синергизма винпоцетина, пирацетама и циннаризина проводились с использованием современных методов прикладной математики и интеллектуального анализа данных. При оценке биологических активностей на животных в материал обучения вошли данные исследований на самцах мышей (n=10 в каждой группе) и самцов крыс (n=10 в каждой группе). Методы применения хемореактомной технологии для анализа различных лекарств [13] и их сочетаний [14] были более подробно описаны ранее [15, 16] и более подробно разобраны на соответствующем интернет-ресурсе (www.chemoinformatics.ru).
Результаты
В результате проведения хемореактомного анализа 3 исследованных молекул были получены оценки различных биологических активностей на различных культурах нейронов (табл. 1—3), на мышах (табл. 4) и крысах (табл. 5), а также оценки модуляции активности таргетных белков крыс (табл. 6) и человека (табл. 7). Полученные данные, включая оценки дозозависимых эффектов (рис. 1—3), позволили провести количественный анализ синергизма между винпоцетином и пирацетамом, винпоцетином и циннаризином, пирацетамом и циннаризином (рис. 4, 5).
Таблица 1. Хемореактомное моделирование на культурах нейронов мышей
| Активность | Константа биологической активности | Винпоцетин | Пирацетам | Циннаризин |
| Противовоспалительная активность, ингибирование ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-1β в клетках линии BV2 мышей, нМ | IC50 | 84 | 1100 | 2287,6 |
| Нейропротекция в нейронах HT22 мышей в условиях гиперкапнического ацидоза, % | — | 18,22 | 5 | 6,054 |
| Нейропротекция против индуцированного глутаматом повреждения нейронов мышей линии HT22, 10 мкМ, 24 ч, % | — | 39,79 | 18,9 | 41,07 |
| Нейропротекция против индуцированного глутаматом повреждения нейронов мышей линии HT22, 50 мкМ, 24 ч, % | — | 59,61 | 76,08 | 30,98 |
| Нейропротекция против цитотоксичности L-гомоцистеина, нМ | PC50 | 3,904 | 3,904 | 6,01 |
Таблица 2. Хемореактомный анализ на клеточных культурах нейронов крыс
| Активность | Константа биологической активности | Винпоцетин | Пирацетам | Циннаризин |
| Индукция роста нейритов в нейронах гиппокампа крыс (суммарная длина нейритов, 48 ч), у.е. | — | 246,5 | 239,9 | 138,3 |
| Нейропротекция в условиях глутаматного стресса культивируемых нейронов гиппокампа крыс, нМ | IC50 | 19,29 | 247 | 903,5 |
| Нейропротекция в дофаминергических нейронах крыс (иммунофлюоресцентное окрашивание на тирозингидролазу), % | — | 110,3 | 109,2 | 74,7 |
| Нейритогенный эффект дофаминергических нейронов крыс (суммарная длина нейритов), у.е. | — | 188.,5 | 188,5 | 157,6 |
| Нейропротекция нейронов PC12 крыс при поражении кортикостероном, 1 сут, % | — | 17,35 | 17,51 | 6,90 |
| Нейропротекция нейронов PC12 у крыс при воздействии H2O2, 5 мкМ, % | — | 49,98 | 55,33 | 13,8 |
| Нейропротекция нейронов PC12 у крыс при воздействии H2O2, 10 мкМ, % | — | 22,6 | 21,14 | 40,9 |
| Нейропротекция нейронов PC12 у крыс при воздействии H2O2, 20 мкМ, % | — | 45,69 | 47,39 | 22,8 |
| Нейропротекция нейронов PC12 у крыс при воздействии H2O2, 50 мкМ, % | — | 61,17 | 51,18 | 31,0 |
| Нейропротекция первичных нейронов крыс в условиях голодания, нМ | EC50 | 578,3 | 578,3 | 784 |
| Нейропротекция нейронов PC12 в условиях глутаматного стресса, 0,1 мкМ, 24 ч, % | — | 61,3 | 54,46 | 14,5 |
Таблица 3. Хемореактомный анализ эффектов исследованных веществ на культурах нейронов человека
| Активность | Константа биологической активности | Винпоцетин | Пирацетам | Циннаризин |
| Нейропротекция против цитотоксичности тетрациклина в нейронах линии MC65 человека, нМ | EC50 | 26,94 | 43,47 | 32,4 |
| Защита нейронов MC65 от гибели, вызванной белком-предшественником бета-амилоида C99, нМ | EC50 | 209,7 | 229,8 | 108,6 |
| Выживание нейронов переднего мозга при ишемии, % | — | 21,99 | 25,23 | 8,14 |
| Доза для 50% увеличения АТФ в нейронах NSC человека, через 4 дня, мкМ | EC50 | 1,279 | 0,205 | 1,21 |
| Защита нейронов SH-SY5Y от гибели под воздействием H2O2, 3 мкМ в-ва, % | — | 5,312 | 13,3 | 16,21 |
| Защита нейронов SH-SY5Y в условиях гипоксии и гипогликемии, 5 мкМ в-ва, % | — | 59,71 | 44,92 | 61,28 |
| Индукция роста нейритов в нейронах SK-N-SH человека, 100 мкМ, 5 сут., у.е. | — | 117 | 107,2 | 77,84 |
Таблица 4. Хемореактомное моделирование фармакологической активности у мышей
| Активность | Константа биологической активности | Винпоцетин | Пирацетам | Циннаризин |
| Нейролептическая активность у мышей STD-ddy как ингибирование локомоции, 100 мг/кг, % | — | 65,69 | 60,39 | 48,12 |
| Снижение каталепсии, вызванной галоперидолом у мышей, 100 мг/кг внутрибрюшинно, % | — | 64,16 | 48,56 | 45 |
| Нейролептическая активность у мышей, получивших дозу апоморфина, мг/кг | ED50 | 0,684 | 0,291 | 0,56 |
| Нейролептическая активность у мышей STD-ddy как ингибирование спонтанной двигательной активности, мг/кг | ED50 | 4,775 | 5,08 | 8,90 |
| Нейролептическая активность при стереотипных движениях, индуцированных метилфенидатом у мышей, мг/кг | ED50 | 5,097 | 5,097 | 30,4 |
Таблица 5. Результаты хемореактомного анализа активностей у крыс
| Активность | Винпоцетин | Пирацетам | Циннаризин |
| Антиаллодиническая активность в модели нейропатической боли с перевязкой спинномозгового нерва у крыс, 10 мг/кг, % | 10,93 | 7,685 | 9,37 |
| Нейропротекция на срезе гиппокампа крыс в условиях кислородно-глюкозного голодания, % | 25,45 | 30,47 | 21 |
| Нейропротекция на модели окклюзии средней мозговой артерии у крыс, мг | 14,32 | 15,87 | 46,10 |
Рис. 4. Распределение значений (а) и суммарные значения балла синергизма (б) для пар «винпоцетин+пирацетам» и «пирацетам+циннаризин».
Рис. 5. Суммы «баллов синергизма» по 7 разделам балльной шкалы для пар «винпоцетин+пирацетам» и «пирацетам+циннаризин».
Результаты хемореактомного моделирования эффектов молекул на культурах нейронов мышей показали, что нейропротекторные свойства винпоцетина при различных условиях стресса (глутамат, гиперкапнический ацидоз, токсическое воздействие гомоцистеина, воспаление) сопоставимы с эффектами пирацетама (см. табл. 1). Для циннаризина значения соответствующих констант были ниже в случае гомоцистеин-индуцированного токсического (PC50=6 мкМ, другие молекулы — 3,9 мкМ) и воспалительного (IC50=2288 нМ, пирацетам — 1100 нМ, винпоцетин — 84 нМ) стресса.
Дозозависимые оценки нейропротекции в модели глутаматного стресса на нейронах линии HT22 показали возрастание нейропротекторных свойств винпоцетина и пирацетама при нарастании концентраций веществ и, наоборот, снижение нейропротекции при нарастании концентрации циннаризина (см. рис. 1).
Рис. 1. Нейропротективная активность против индуцированного глутаматом повреждения нейронов мышей линии HT22, оцениваемая как выживаемость клеток через 24 ч.
Результаты хемореактомного анализа свойств исследованных веществ на клеточных культурах нейронов крыс (см. табл. 2) показали более выраженные нейропротективные свойства винпоцетина и пирацетама, чем циннаризина. Например, при культивации нейронов линии PC12 в условиях глутаматного стресса винпоцетин и пирацетам повышали выживаемость клеток на 55—61%, а циннаризин — всего на 15%. Значения константы IC50 ингибирования гибели нейронов гиппокампа составили 19 нМ для винпоцетина, 247 нМ для пирацетама и 904 нМ для циннаризина. Напомним, что более высокие значения константы ингибирования IC50 соответствуют более низкой эффективности ингибирования. Установленные дозозависимые эффекты включают повышение выживаемости нейронов линии PC12 в условиях оксидативного стресса (H2O2) при возрастании концентраций винпоцетина и пирацетама (см. рис. 2). Кроме того, для винпоцетина и пирацетама показана более выраженная индукция роста нейритов в нейронах гиппокампа (240—247 у.е., циннаризин — 138 у.е.).
Хемореактомное моделирование на культурах нейронов человека (см. табл. 3) подтвердило достоверно более выраженные нейропротекторные эффекты винпоцетина и пирацетама при различных условиях клеточного стресса (токсический стресс при воздействии тетрациклина или белка-предшественника бета-амилоида, оксидативный стресс, гипоксия и гипогликемия). Для винпоцетина и пирацетама была отмечена более выраженная индукция роста нейритов в клетках SK-N-SH (107—117 у.е., циннаризин — 78 у.е.).
Рис. 2. Нейропротективная активность, оцененная как процент выживания нейронов линии PC12 крыс при воздействии H2O2.
Результаты хемореактомного анализа активности у мышей указали на более выраженную нейролептическую активность винпоцетина и пирацетама (см. табл. 4).
Результаты хемореактомного моделирования фармакологических активностей у крыс продемонстрировали сходные показатели антиаллодинической активности для всех 3 веществ и несколько более выраженные нейропротективные свойства для винпоцетина и пирацетама (см. табл. 5).
Хемореактомный анализ модуляции активности таргетных белков крыс показал, что винпоцетин и пирацетам могут являться более эффективными ингибиторами глутаматергической нейротрансмиссии, гамма-секретазы и ноцицептивного пуриноцептора P2X7, чем циннаризин (см. табл. 6).
Таблица 6. Модуляция активности таргетных белков крыс при воздействии молекулами
| Белок | Константа биологической активности | Винпоцетин | Пирацетам | Циннаризин |
| Ингибирование NMDA-рецептора глутамата в синаптосомах полосатого тела крыс, % | — | 26,36 | 32,07 | 12,35 |
| Ингибирование гамма-секретазы в первичных нейронах плода крысы и продукции амилоида β42, % | — | 39,45 | 35,49 | 23,28 |
| Ингибирование гамма-секретазы в первичных нейронах плода крысы и продукции амилоида β42, нМ | IC50 | 73,62 | 73,62 | 86,68 |
| Ингибирование пуринового рецептора P2X7, нМ | Ki | 33,74 | 32,31 | 94,25 |
| Ингибирование моноаминоксидазы моноаминергических нейронов синаптосом крыс, мг/кг | ED50 | 27,51 | 26,65 | 53,19 |
Хемореактомный анализ модуляции активности таргетных белков человека (см. табл. 7) показал более выраженные холинергические эффекты винпоцетина и пирацетама (EC50=314—342 нМ) по сравнению с циннаризином (EC50=623 нМ). Кроме того, для винпоцетина и пирацетама было характерно несколько более выраженное ингибирование обратного захвата дофамина транспортером DAT (IC50=379—417 нМ, циннаризин — IC50=510 нМ) и особенно обратного захвата серотонина транспортером SERT (IC50=40—43 нМ, циннаризин — 595 нМ). Результаты оценок дозозависимых эффектов подтверждают более эффективное ингибирование обратного захвата дофамина транспортером DAT и серотонина траснпортером SERT человека (human HEK293 cells, fluorescent analysis of neurotransmitter transfer) (см. рис. 3). Эти эффекты винпоцетина и пирацетама способствуют усилению холинергической, серотонинергической и дофаминергической нейротрансмиссии.
Таблица 7. Модуляция активности таргетных белков человека при воздействии молекулами
| Белок | Константа биологической активности | Винпоцетин | Пирацетам | Циннаризин |
| Активация АХ-никотинового рецептора α7 человека как повышение уровня внутриклеточного Ca2+, % | — | 46,93 | 62,31 | 54,91 |
| Ингибирование обратного захвата норэпинефрина транспортером NET, 0,1 мкМ, % | — | 21,1 | 36,65 | 9,71 |
| Ингибирование обратного захвата дофамина транспортером DAT, 0,1 мкМ, % | — | 6,5 | 10,84 | 11,42 |
| Ингибирование обратного захвата дофамина транспортером DAT, 1 мкМ, % | — | 40,47 | 36,02 | 27,12 |
| Ингибирование обратного захвата дофамина транспортером DAT, 10 мкМ,% | — | 23,22 | 23,22 | 8,32 |
| Ингибирование обратного захвата серотонина транспортером SERT, 0,1 мкМ, % | — | 16,12 | 16,16 | 19,75 |
| Ингибирование обратного захвата серотонина транспортером SERT, 1 мкМ, % | — | 17,2 | 17,22 | 5,83 |
| Ингибирование обратного захвата серотонина транспортером SERT, 10 мкМ, % | — | 10,5 | 57,9 | 0 |
| Ингибирование обратного захвата серотонина транспортером SERT, 100 мкМ, % | — | 49,83 | 47,97 | 35,41 |
| Активация АХ-никотинового рецептора α7 человека как повышение уровня внутриклеточного Ca2+, нМ | EC50 | 342 | 313,8 | 622,8 |
| Ингибирование бета-секретазы BACE1, нМ | IC50 | 248,7 | 378,2 | 614,14 |
| Ингибирование рецептора нейрокинина NK1, нМ | IC50 | 180 | 358,6 | 805,58 |
| Ингибирование рецептора нейропептида Y5, нМ | IC50 | 40,98 | 44,94 | 166,97 |
| Ингибирование обратного захвата норэпинефрина транспортером NET, нМ | IC50 | 1103 | 224,9 | 1239,14 |
| Ингибирование обратного захвата дофамина транспортером DAT, нМ | IC50 | 417 | 379,3 | 509,8 |
| Ингибирование обратного захвата серотонина транспортером SERT, нМ | IC50 | 40,32 | 42,97 | 595,2 |
Рис. 3. Ингибирование исследованными веществами.
а — обратного захвата дофамина транспортером DAT; б — обратного захвата серотонина транспортером SERT (клетки HEK293 человека, флуоресцентный анализ переноса нейротрансмиттеров).
Таким образом, результаты хемореактомного анализа показывают, что рассмотренные фармакологические эффекты комбинирования действующих веществ в составе препарата Винпотропил, который является фиксированной комбинацией, содержащей 5 мг винпоцетина и 400 мг пирацетама (капс.) либо 10 мг винпоцетина и 800 мг пирацетама (таб.), существенно дополняют друг друга.
Для оценки степени синергизма между основной молекулой (винпоцетин) и молекулами-синергистами (пирацетам, циннаризин), а также для обоснованного выбора молекулы-синергиста, которая в наибольшей степени «комплементарна» основной молекуле, мы разработали балльную шкалу, основанную на результатах хемореактомного анализа, представленных в табл. 1—7. Разработанная шкала состоит из 7 разделов, включающих результаты хемореактомного моделирования (1) культур нейронов мышей, (2) культур нейронов крыс, (3) культур нейронов человека, (4) активностей у мышей, (5) активностей у крыс, (6) активности таргетных белков крыс, (7) активности таргетных белков человека.
Сравнение эффектов основной молекулы и молекул-синергистов по каждой из перечисленных в табл. 1—7 активностей осуществлялось по 3-балльной системе: 0 баллов — основная молекула проявляет активность, не найденную у синергиста; 1 балл — эффект основной молекулы сравним с эффектом молекулы-синергиста; 2 балла — молекула-синергист существенно дополняет эффекты основной молекулы; 3 балла — молекула-синергист проявляет активность, не найденную для основной молекулы. Вычисление «баллов синергизма» для каждой из активностей из 7 разделов основывалось на оценке статистических различий в значениях констант, полученных в результате проведения дифференциального хемореактомного анализа исследованных молекул.
Рассмотрим расчет балла синергизма на примере раздела шкалы, основанного на результатах хемореактомного моделирования эффектов молекул на культурах нейронов человека (см. табл. 3). Например, значение константы EC50 для нейропротекции в условиях токсического стресса (тетрациклин) приблизительно одинаково для всех 3 веществ. Поэтому для данной активности балл синергизма был равен единице для обеих комбинаций «винпоцетин+пирацетам» и «пирацетам+циннаризин». Аналогичная ситуация наблюдалась в случае константы EC50 для защиты нейронов MC65 от гибели, вызванной белком-предшественником бета-амилоида.
В то же время в случае оценивания активности «выживание нейронов переднего мозга при ишемии» (см. табл. 3) оценки для винпоцетина и пирацетама составили 22—25%, а для циннаризина были достоверно меньше (всего 8%). Поэтому для данной активности комбинации «винпоцетин+пирацетам» соответствует балл синергизма, равный 1 («эффект основной молекулы сравним с эффектом синергиста»), а для комбинации «винпоцетин+циннаризин» балл синергизма равен 0 («основная молекула проявляет активность, не найденную у синергиста»). Аналогичным образом начисляются баллы и для активности «индукция роста нейритов в клетках SK-N-SH» (см. табл. 3).
Распределение значений «балла синергизма» между винпоцетином и молекулами-синергистами (рис. 4) показывает, что наиболее типичным значением балла синергизма для сочетания «винпоцетин+пирацетам» являлось «1» (эффект основной молекулы сравним с эффектом синергиста), а для пар «винпоцетин+циннаризин» и «пирацетам+циннаризин» типичное значение балла синергизма составило «0» (основная молекула проявляет активность, не найденную у синергиста).
Анализ балльных оценок синергизма по 7 разделам балльной шкалы показал, что значения баллов синергизма для комбинации «винпоцетин+пирацетам (препарат Винпотропил)» превосходили значения баллов синергизма для комбинации «пирацетам+циннаризин» по 6 из 7 разделов шкалы, для комбинации «винпоцетин+циннаризин» по каждой из 7 разделов шкалы (рис. 5).
Заключение
Среди широко используемых нейропротективных средств принято считать, что винпоцетин преимущественно воздействует на микроциркуляцию и воспаление, а пирацетам в большей степени является ноотропом, улучающим память и когнитивные функции. Однако результаты хемореактомного анализа показывают, что обе эти молекулы могут проявлять и противовоспалительные, и ноотропные свойства, также усиливая дофаминергическую и серотонинергическую нейротрансмиссию. Полученные оценки фармакологических активностей на культурах нейронов, модельных организмах и таргетных белках крысы и человека позволили количественно оценить синергизм нейропротекторного действия комбинации молекул «винпоцетин+пирацетам» в составе препарата Винпотропил (54 балла) по сравнению с комбинацией «пирацетам+циннаризин» (25 баллов). Предпочтительность использования комбинации «винпоцетин+пирацетам» также обусловлена лучшим профилем безопасности.
Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (проект №20-12-00175) ИГХТУ.
This work was supported by a grant from the Russian Science Foundation (project No. 20-12-00175) ISUCT.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.